張麗娜
(安徽省淮南市壽縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 232200)
豬口蹄疫的治療很難,而且還會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迅速地蔓延擴(kuò)散,因此必須要重視起診斷技術(shù)的應(yīng)用,以便可以及時(shí)確診并采取針對(duì)性的治療辦法,從而降低經(jīng)濟(jì)損失。
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,在其傳播過(guò)程中,豬主要是口蹄疫發(fā)生的放大器,其能夠促進(jìn)口蹄疫的傳播,擴(kuò)大傳播范圍,造成嚴(yán)重的負(fù)面影響。就當(dāng)前的獸醫(yī)臨床實(shí)踐中可以發(fā)現(xiàn),病豬往往發(fā)病較快、較急,大多數(shù)病豬會(huì)突然高燒(高達(dá)41℃左右),且精神不佳,食欲廢絕,可以觀察到在豬的口鼻部、蹄冠部、蹄叉部及口腔黏膜和乳頭皮膚上會(huì)出現(xiàn)許多小水泡,隨著病情的發(fā)展,水泡會(huì)發(fā)生潰爛,極易引起繼發(fā)感染,比如仔豬會(huì)因病發(fā)腸炎和心肌炎而死亡。
通過(guò)對(duì)口蹄疫病毒進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn),其主要分為O型、A型、C型、Asia-1、STA1、STA2和SAT3等7個(gè)血清型,目前、世界各地豬群中以O(shè)型、A型為主,其中亞洲國(guó)家主要以O(shè)型、A型、Asia1等為主,而我國(guó)主要流行毒株有A型ASIA拓?fù)湫蚐ea-97毒株、O型SEA拓?fù)湫蚆ya98毒株和O型ME-SA拓?fù)湫蚉anAsia毒株。由此可見(jiàn),導(dǎo)致豬口蹄疫的病毒株具有較大差異,簡(jiǎn)單的臨床治療辦法很難起到效果,必須要準(zhǔn)確診斷血清型,并全面監(jiān)測(cè)其隱性帶毒的情況,從而為該病的防控奠定良好的基礎(chǔ)[1]。
2.1.1 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)
補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)最早出現(xiàn)于1952年,其在實(shí)際應(yīng)用中能夠?qū)⒁阎目乖?、被檢抗體為檢測(cè)系統(tǒng)組,與紅細(xì)胞、溶血素指示系統(tǒng)組進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)補(bǔ)體,兩者如果發(fā)生溶血,則為陰性,反之則為陽(yáng)性,該方法在診斷口蹄疫病毒上比較直觀,但是在實(shí)際操作中需要試驗(yàn)人員嚴(yán)格把握補(bǔ)體的使用量,因此該方法不能用于快速檢測(cè)中,目前在豬口蹄疫的診斷上也降低了應(yīng)用概率。
2.1.2 病毒中和試驗(yàn)(VNT)
病毒中和試驗(yàn)一般常用于進(jìn)出境動(dòng)物口蹄疫病毒感染的檢測(cè)工作中,效果較好,在保護(hù)進(jìn)出口安全上發(fā)揮著重要的作用。但是這一方法在應(yīng)用過(guò)程中需要實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單層細(xì)胞的培養(yǎng)工作,或者是飼養(yǎng)試驗(yàn)動(dòng)物,而且進(jìn)行體外檢測(cè)的時(shí)候還會(huì)因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、病毒敏感性的變化等受到一定的影響,且必須要使用或病毒才能夠進(jìn)行有效的檢測(cè),對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求也比較高,因此一般不用于基層的口蹄疫診斷中。
2.1.3 間接血疑試驗(yàn)(IHA)
間接血疑試驗(yàn)在實(shí)際應(yīng)用中可以有效地檢測(cè)血清中的抗體和抗原水平,檢測(cè)結(jié)果較為直觀,在操作上也比較簡(jiǎn)單,還能夠?qū)崿F(xiàn)定量與定性檢測(cè),因此是當(dāng)前臨床中常用的一種檢測(cè)辦法。其在實(shí)際應(yīng)用中需要將口蹄疫病毒吸附在綿羊紅細(xì)胞載體上,以此可以形成致敏紅細(xì)胞,其在電解質(zhì)環(huán)境下可以與檢測(cè)樣本中的抗體相遇且發(fā)生凝集反應(yīng),因此可以直接使用肉眼進(jìn)行觀察[2]。
2.2.1 熒光定量(PCR)
熒光定量既可檢測(cè)病毒核酸又可檢測(cè)病毒的血清型,還能夠?qū)崿F(xiàn)定量檢測(cè),因此在口蹄疫臨床樣品診斷中發(fā)揮重要的作用,已經(jīng)成為我國(guó)蹄疫病毒快速檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。
2.2.2 基因芯片技術(shù)(DNAchips)
基因芯片技術(shù)靈敏度相對(duì)常規(guī)RT-PCR來(lái)說(shuō)更高,實(shí)驗(yàn)表明可以高10~100倍,而且芯片保存3個(gè)月仍能重復(fù)使用,大大節(jié)省了檢測(cè)成本。在實(shí)際應(yīng)用中,基因芯片技術(shù)能夠快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)口蹄疫病毒,確定其血清型與基因型,還能夠幫助防控人員區(qū)分免疫動(dòng)物與自然感染動(dòng)物。但是其需要進(jìn)行樣品制備,成本較高,因此在基層普檢中還沒(méi)有得到推廣。
2.2.3 生物傳感器技術(shù)
生物傳感器技術(shù)是生物科學(xué)發(fā)展過(guò)程中誕生的一種新技術(shù),其涉及到生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)、電子技術(shù)等多種學(xué)科,當(dāng)前主要應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域,在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出選擇性好、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)勢(shì),而且在電子技術(shù)等先進(jìn)技術(shù)的支持下,生物傳感器技術(shù)還能夠?qū)崿F(xiàn)在線監(jiān)測(cè),且自動(dòng)化、微型化與集成化特點(diǎn)較為明顯。在動(dòng)物疫病的診斷中,生物傳感器技術(shù)主要應(yīng)用于口蹄疫病毒、皰疹病毒及彎曲桿菌等的檢測(cè)中,比如在口蹄疫的診斷上,其主要是通過(guò)壓電免疫傳感器進(jìn)行檢測(cè),比如當(dāng)前常見(jiàn)的壓電(PZ)晶體的免疫生物傳感器,能夠特異性地用于口蹄疫病毒的分型,因此診斷效果較好,在當(dāng)前的口蹄疫診斷中應(yīng)用比較廣泛。
膠體金免疫層析快速診斷技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中主要是將已知抗原或抗體用膠體金進(jìn)行標(biāo)記,之后可以通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)使得膠體金集聚形成肉眼可見(jiàn)的形式,以此來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)工作。而且其在實(shí)際應(yīng)用中不需要特殊的設(shè)備和專業(yè)人員,不僅操作簡(jiǎn)單,而且反應(yīng)靈敏,能夠快讀的監(jiān)測(cè)血清型O、A或Asia1。在當(dāng)前的口蹄疫診斷中,可以制作口蹄疫Asia1型的可定量檢測(cè)的膠體金試紙,其特異性與敏感性都比較好,在定量檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。
逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用可以直接采用瓊脂糖凝膠電泳、顏色變化、生成的沉淀等現(xiàn)象判定反應(yīng)結(jié)果,因此表現(xiàn)出操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的優(yōu)勢(shì),檢測(cè)后也不需要借助特殊設(shè)備,只需要肉眼就能夠觀看到檢測(cè)結(jié)果,且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法從核酸提取到檢測(cè)僅需要75min[3]。
重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)可以在15~20min內(nèi)完成擴(kuò)增,在實(shí)際應(yīng)用中,以FMDV3D基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物和探針,在此基礎(chǔ)上建立起實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增(real-timeRT-RPA)檢測(cè)方法,以此對(duì)口蹄疫進(jìn)行檢測(cè),只需要在40℃恒溫條件下持續(xù)20min就可以完成檢測(cè),且檢測(cè)結(jié)果與RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果具有100%的符合率。除此以外,重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng),因此在不同的實(shí)驗(yàn)室中都能夠完成檢測(cè)工作,基于該方法的便捷性,可以采用便攜式等溫?cái)U(kuò)增儀-GenieⅢ實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè),操作簡(jiǎn)單且快捷,對(duì)口蹄疫病毒株的血清型檢測(cè)也比較準(zhǔn)確。
綜上所述,口蹄疫診斷技術(shù)在近幾年得到了迅速的發(fā)展,在檢測(cè)各種口蹄疫病毒株上發(fā)揮著重要的作用,從常見(jiàn)的血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷,到現(xiàn)階段的膠體金免疫層析快速診斷技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等新型的檢測(cè)技術(shù),最終在我國(guó)口蹄疫診斷上形成了多方位且全面的診斷檢測(cè)手段,從而有效地提高了我國(guó)在口蹄疫診斷上的發(fā)展水平,為口蹄疫的防控工作提供了堅(jiān)實(shí)的保障,為我國(guó)生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康、穩(wěn)定以及可持續(xù)發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。