張趙一淳 郭靜 綜述 邱新毓 馮劍穎 審校

1 細胞外囊泡

細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是指細胞分泌的各種類型的膜囊泡，電鏡下EVs為杯狀或球形的雙層脂質膜結構，其內包含了許多不同種類的生物活性分子，比如蛋白質、DNA、RNA、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)和脂質等[1]。包括免疫細胞、間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和血細胞等在內的各種細胞均能夠分泌EVs，使其廣泛地分布于血液、尿液、乳汁等各類體液中，從而發(fā)揮特定的生物學功能。目前EVs的分類方式有很多，根據(jù)目前對細胞外囊泡生物起源的了解，其大致可分為外泌體、微囊泡和凋亡小體三大類。外泌體一般直徑大小在50～150 nm，來源于細胞的胞內體，而微囊泡直徑大小在50～500 nm，甚至會達到1 μm，一般來自細胞膜[2]。而凋亡小體一般由細胞發(fā)生凋亡后產(chǎn)生，直徑約在1～5 μm左右。

作為生命體進化過程中一個十分保守的環(huán)節(jié)，EVs的分泌起初被認為是發(fā)揮著清除細胞內不必要物質的作用。隨著研究技術手段的不斷革新，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，EVs作為細胞間彼此相互溝通的橋梁，能夠參加細胞間的多種信號傳導。同時，通過運輸不同種類的生物分子，EVs還能夠實現(xiàn)細胞之間的成分交換，介導細胞各種各樣的生理與病理過程[2]。

2 EVs的生物學功能及其臨床診療作用

目前研究表明，EVs是由母細胞在炎癥、缺氧、氧化應激、衰老和細胞凋亡等不同因素影響下構成或激活后產(chǎn)生的[1]。EVs內容物種類主要取決于母細胞的類型和分化程度及所處微環(huán)境的刺激因素，其內含物包括脂質(如類花生酸)、蛋白質(如細胞因子、趨化因子、生長因子或其他信號轉導中介體)、遺傳物質(如mRNAs、lncRNAs)和在大囊泡中包含的整個細胞器結構(如線粒體等)[1-2]。EVs在特定條件下與受體細胞相互作用后，釋放其內容物，從而發(fā)揮相應的生物學功能。雖然介導EVs作用于受體細胞的具體機制目前仍不十分清楚，但已有部分研究證實，EVs能夠參與細胞的絕大多數(shù)生理病理過程，包括信號轉導、細胞生長及發(fā)育、代謝調節(jié)、組織穩(wěn)態(tài)與修復再生、抗原呈遞與免疫應答等等[1,3-5]。

2.1 EVs的形成過程

EVs形成過程中的不同步驟涉及多種分選機制[2]。首先，脂質和膜相關蛋白在細胞膜(形成微囊泡)和多囊泡核內體(multivesicular endosome， MVE)的有限膜區(qū)域(形成外泌體)中聚集，這些區(qū)域一般被稱為分散的微域。隨后，這些微域參與可溶性成分(比如胞質內蛋白質和不同RNA)的募集，而這些可溶性成分要在EVs中進行分選。集群的微域形成與外加的機械作用共同促進細胞膜出芽的過程，隨后出現(xiàn)質膜向細胞外介質或MVE的限制膜向MVE腔的分裂過程。在外泌體和微囊泡分選的跨膜蛋白仍然保持在質膜上同樣的拓撲學結構。目前，外泌體形成的機制已經(jīng)較為明確，其中涉及到運輸所需的內體分選復合物(endosomal sorting complex required for transport， ESCRT)的亞單位具有十分重要的作用。在管腔內囊泡(Intraluminal vesicles， ILVs)進入MVE腔內時，在不同程度上需要ESCRT-III的參與，而內含物的聚集和膜出芽的過程則不完全依賴于ESCRT[6-7]。相較于外泌體，微囊泡發(fā)生的機制目前也仍在研究中。

EVs內包含不同物質，包括主要組織相容性復合體2(major histocompatibility complex class II，MHC class II)[8]、糖基磷脂酰肌醇-錨定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins，GPI-anchored proteins)[9]、載脂蛋白E(apolipoprotein E，Apo E)[10]、mRNA及DNA片段[2]等參與調節(jié)生命活動的生物分子。盡管微囊泡和外泌體在細胞內不同的位置生成，但這兩種不同EVs的合成過程有共同的細胞內機制和分選機制。EVs的生成過程是十分復雜的，往往取決于包含物和母體細胞的類型，同時也會受到細胞接收的其他刺激信號的影響。包含物通過逐步聚集，參與到EVs發(fā)芽、裂變和釋放的過程。另外，EVs內含物的性質和含量具有特異性，經(jīng)常受到母體細胞的生理或病理狀態(tài)、調節(jié)其產(chǎn)生和釋放的刺激以及促進其生成的分子機制的影響。

2.2 EVs的作用方式

由于EVs的大小和其表面分子特性的差別，不同EVs對受體細胞的識別和捕獲能力也不盡相同。研究表明，外泌體的作用方式可以通過小胞飲作用的理論進行解釋。而對于較大的微囊泡，其本身可通過與受體細胞的胞外特異性分子相互作用或膜與受體細胞膜融合而產(chǎn)生后續(xù)作用[11]。EVs在特定條件下與受體細胞相互作用后，釋放其內容物，從而發(fā)揮對應的生物學功能。在受體細胞(可以是生產(chǎn)細胞本身)中，外源性的EVs會結合到細胞表面，并經(jīng)歷不同的作用過程。根據(jù)受體細胞類型的不同，它們可以保持與表面結合(例如與整合素結合)，并啟動細胞內信號通路(例如抗原提呈過程)。同時，EVs還可以通過多種途徑內化，包括網(wǎng)格蛋白依賴性和網(wǎng)格蛋白非依賴性途徑介導的內吞作用，最終將內容物轉移到受體細胞中[12-13]。外源性EVs可以通過典型的內體通路，由細胞外到達MVE。在MVE中，內化的囊泡可能與ILV混合。與含有溶酶體的MVE融合會導致EVs和其內容物的降解，此過程不斷循環(huán)以促進受體細胞的新陳代謝[2,9]。除此之外，EVs還通過與細胞膜或MVE的有限膜的融合，釋放其內容物進入細胞質或ILV中，參與細胞生命活動的調節(jié)。EVs與細胞表面的相互作用模式以及介導EVs內含物轉移的具體機制尚未完全闡明，但這一過程對于如miRNA 等信號分子的傳遞效應十分重要。

2.3 疾病診斷與預后評估

在過去的十幾年中，EVs被廣泛認為是可靠的診斷和監(jiān)測人類疾病狀態(tài)的生物性指標[14]。EVs在機體不同的體液(血液、尿液、支氣管肺泡液、膽汁和唾液等)中均能夠存在。除了EVs的分布范圍以外，其還可以通過攜帶來自母細胞的相關特定物質(如蛋白質、miRNAs、mRNAs、lncRNAs和脂質等)來動態(tài)地反映疾病狀態(tài)[1-2]。研究證實，EVs的內容物反映著母細胞的病理生理特征，并且比其循環(huán)所處的生物流體更具有特異性[15]。同時，作為能夠顯示疾病特異性動態(tài)信息的EVs內容物，甚至具備評價疾病預后情況的重大潛力。在許多臨床疾病中，如冠狀動脈疾病、腎臟疾病、肝臟疾病、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病[15-19]等，EVs已被提出可作為預測疾病預后水平的可靠性指標。

2.4 組織工程與臨床治療

如前所述，機體中收集到的天然EVs，因攜帶有具體生物學意義的信息分子，使其有益于臨床進行疾病診斷與預后評估。而因EVs具有能夠穿越生物屏障和天然趨化性等特點，使得讓EVs作為體內藥物遞送載體成為可能。近年來，隨著組織工程技術的不斷發(fā)展，EVs已經(jīng)可以實現(xiàn)工程化的改造與構建，使其成為新的藥物遞送載體。相較于其他類似藥物遞送系統(tǒng)(如聚合物納米顆粒和脂質體等)，EVs具有許多獨特的優(yōu)勢[20]，它可以遞送不同類型的物質，例如干擾RNA (siRNA)或藥物活性分子等。EVs在血液中的穩(wěn)定度較高，即使是體內遠距離的傳輸，也可以特異性地完成遞送[21-22]。此外，由于EVs的體積較小且具有生物源性，它可以繞過溶酶體的吞噬，將包含的內容物直接釋放到受體細胞，從而發(fā)揮功能。由于EVs是來源于宿主自身的產(chǎn)物，所以不會引起機體強烈的免疫反應[20]。同時，EVs的親水性核心也使其成為水溶性藥物的優(yōu)質載體[23]。目前使用EVs的治療方法已經(jīng)在體外和體內進行了檢驗，被證實可用于治療不同的疾病，例如癌癥、免疫或神經(jīng)性疾病等等。目前，關于EVs的最新研究主要集中在如何通過有效地修飾，來改善EVs內容物的成分，提高遞送靶向效率和精準調控分布位置。例如，研究者們想通過在EVs表面錨定一些特定設計的肽段，來實現(xiàn)精準識別靶細胞上的特定受體[1,24]，從而進一步加強EVs的治療效果。

3 EVs的臨床應用

隨著人們對于EVs認知與研究的不斷加深，其得到了越來越多的應用。EVs通過將其內容物傳遞給受體細胞，來參與受體細胞生命活動并調節(jié)機體穩(wěn)態(tài)。EVs在免疫上是具有惰性的，因此能夠最低程度的避免觸發(fā)先天和適應性的免疫反應[25]。臨床應用研究結果發(fā)現(xiàn)，樹突狀細胞分泌的EVs可以刺激免疫系統(tǒng)，用作抗腫瘤疫苗的研發(fā)。在肺癌和黑色素瘤患者治療的臨床試驗中，采用EVs的免疫療法也具有巨大潛力[26]。此外，MSCs來源的EVs已在動物模型中被證實可以用于治療急性腎衰竭、皮膚損傷和心肌梗死等多種疾病。目前還有一些臨床試驗正在進行，主要是基于EVs的體外操作，裝載特定的內含物(例如siRNA，miRNA和藥物)，然后將其運送到目標細胞，從而發(fā)揮治療效能[27-28]。因此，高精度、高特異性及免疫惰性的優(yōu)點，使得EVs在臨床疾病應用中具有巨大潛力。

3.1 心血管系統(tǒng)疾病

EVs通過調節(jié)細胞間信號，引導細胞外基質發(fā)生改變來應對血流動力學等環(huán)境的變化，從而幫助機體控制心血管的穩(wěn)態(tài)。EVs從母細胞攜帶到細胞外的信息可以作用于局部(同一組織內)和遠端(血流下游)的受體細胞。一方面，有研究表明EVs內包含的病理性生物信號分子可能進一步誘發(fā)或者加重各種心血管系統(tǒng)疾病。另一方面，研究表明將體外培養(yǎng)細胞(例如內皮細胞，心肌細胞等)獲得的EVs注射到病變組織中可以促進組織功能的恢復。

由于EVs包含的不同生物分子可以反映出細胞表型的改變，臨床上常將血液中的EVs作為一種非侵入性的檢查來監(jiān)測全身組織狀態(tài)。這在心血管系統(tǒng)疾病的診斷中有很多應用。有研究表明，暴露于致動脈粥樣硬化脂蛋白的平滑肌細胞，會釋放miRNA譜顯著改變的EVs，這其中包含的miRNA-24-3p和miRNA-130a-3p含量會相應減少[29]，而這兩種miRNA在家族性高膽固醇血癥患者的循環(huán)EVs中表達也降低。因此臨床上可通過監(jiān)測血液中EVs的miRNA-24-3p和-130a-3p含量變化篩選高膽固醇血癥或動脈粥樣硬化患者，從而增強診斷的可靠性與可信度。除了有助于臨床診斷以外，EVs能夠作為治療載體幫助恢復組織穩(wěn)態(tài)。例如有研究發(fā)現(xiàn)，通過引入體外細胞培養(yǎng)獲得的EVs，可預防或逆轉心血管系統(tǒng)的病理重塑。內皮細胞來源的EVs可包含功能性的內皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase， eNOS)，eNOS可以通過自分泌的方式參與恢復脂肪酸誘導氧化應激[30]后的穩(wěn)態(tài)。同時，也有研究表明，冠脈內注射心球樣細胞來源的EVs可以減輕大鼠和豬急性心肌梗死中的心肌壁損傷[31]。以上提及的EVs修復作用可能是通過其在病變組織[32]中有效遞送并提高穩(wěn)態(tài)基因表達和非炎癥表型的miRNA來實現(xiàn)的，這也為未來心血管疾病的治療方法提供了新思路。

3.2 肝臟疾病

近期研究表明，EVs可用于檢測、監(jiān)測和預測肝臟疾病患者的疾病進展狀況及生存率。以肝硬化為例，EVs計數(shù)可用于監(jiān)測全身的炎癥狀態(tài)[33]，而EVs在肝硬化患者體內含量比正常的健康人更高[34]。同時，相較于健康的正常人，肝硬化患者血漿中含有CD4、CD8、CD11a、CD31、CD235和CK-18等表面標記的EVs亞群的數(shù)量有所增加[33]。前期有研究證實，CK-18標記的EVs水平與肝硬化病情的嚴重程度密切相關，并通過這一指標預測了疾病的6 個月死亡率[35]。此外，血漿來源EVs內包含的miRNA可作為評價患者纖維化水平的生物指標。通過檢測機體血漿EVs內 miRNA-101、miRNA-122、miRNA-195、miRNA-224和let-7的變化，可以診斷肝硬化或監(jiān)測其早期到晚期的進展情況，而檢測體內EVs中miRNA-192的增加情況，有助于診斷非常早期的肝纖維化病變[34]。

除了疾病診斷與監(jiān)測外，基于前體細胞和MSCs來源的EVs治療肝臟相關疾病的應用研究也有很大前景。研究證實，對脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)進行 miRNA-122(一種肝星狀細胞的抑制劑)轉染[36]，而轉染后ADMSCs產(chǎn)生的EVs可以抑制原代肝星狀細胞和其LX2細胞系的活化與增殖，這可以直接抑制肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。同時，這些EVs也可以提高由CCl4注射誘導的肝纖維化小鼠的存活率。更加值得注意的是，同步在CCl4誘導的肝纖維化小鼠脾臟內注射ADMSCs來源的EVs(過表達miRNA-181-5p)，結果發(fā)現(xiàn)肝臟中I型膠原蛋白、Vimentin、α-平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和纖維連接蛋白的表達較對照組均明顯減少[37]。同樣，還有研究發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導小鼠肝纖維化的模型中，人臍帶間質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs)來源的EVs減輕了肝纖維化的組織病理學改變，抑制了Caspase-3的活化，并降低了ROS與TGF-β的產(chǎn)生[38]。

3.3 腎臟疾病

EVs扮演著細胞間信使的角色，并通過不同類型的腎細胞，參與形成腎小球濾液的過程[1]。研究表明，足細胞來源的EVs附著在腎臟近端小管上皮細胞的刷狀邊緣，并易出現(xiàn)濃度依賴性內化[1,39]。在各種影響腎臟的病理因素刺激下，細胞出現(xiàn)應激反應，從而EVs的特性也發(fā)生改變[40]，提示疾病的發(fā)生和發(fā)展。比如，機械性牽張和高血糖環(huán)境會誘導腎小球濾液中EVs的釋放，而這可以作為高血壓和糖尿病腎病中腎小球損傷的早期尿液檢測標志物。腎小球濾過液中釋放的泌尿生殖道上皮脫落的EVs均可從尿液中提取，因此可作為考察泌尿系統(tǒng)的臨床狀況的非侵入性生物標志物[1]。同時，轉錄組學分析可以幫助確定尿液EVs的具體來源，比如EVs內包含特定的mRNAs，如編碼podocin(膜蛋白，定位在腎小球)和 aquaporin 2(水通道蛋白2，定位在集合管)的mRNAs，可以表明其起源于腎元和集合管的特定區(qū)域。除此以外，全面的蛋白質組學或脂質組學分析研究也可以幫助識別尿EVs的來源，利于疾病診斷[1]。

除了標記不同類型的腎臟疾病外，目前臨床試驗證據(jù)也表明，EVs可以促進多種慢性腎病(chronic kidney disease, CKD)的修復與再生。 EVs內的生物分子富含調節(jié)信息，能夠參與調節(jié)受體細胞內包括炎癥、氧化應激、細胞凋亡和血管生成等一系列的生理病理過程，而這些過程都與CKD 的疾病進展密切相關。高血壓和糖尿病腎病患者的臨床試驗驗證了EVs在改善腎損傷和功能障礙方面的安全性與有效性，并將能夠釋放EVs的MSCs定為CKD 患者細胞療法的有利種子細胞。目前，在CKD 疾病模型中的研究揭示了 MSCs來源的 EVs 在保護腎臟結構和功能方面的可行性和有效性，推動了非細胞治療在腎臟修復再生中的應用。

3.4 口腔系統(tǒng)疾病

唾液的EVs中已被證實包含有多種具有口腔疾病信息的生物活性分子，可以輔助完成口腔疾病的診斷。以口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)為例，研究表明OSCC患者的唾液微囊泡含量水平升高，這與患者臨床表現(xiàn)和預后情況密切相關[41]。另有研究結果表明，OSCC患者唾液EVs中miR-412-3p 和 miR-512-3p的表達含量有所增加，而miR-302b-3p和 miR-517b-3p出現(xiàn)選擇性富集[42]。這4 種唾液EVs中的 miRNAs均有輔助診斷 OSCC的潛在價值。除此以外，臨床常見的牙周炎患者唾液EVs中的 PD-L1表達也被發(fā)現(xiàn)與非牙周炎患者間存在顯著差異，可作為牙周炎的輔助診斷標記物[43]。不僅在診斷方面，EVs在口腔疾病的治療中也有很大應用前景。研究證實，舌癌 Tca8113細胞能分泌包含腫瘤免疫相關蛋白的EVs，可以通過樹突狀細胞，誘導T細胞成為抗原特異性細胞毒性T細胞，從而進一步特異性殺傷腫瘤細胞[44]，為口腔腫瘤的免疫治療提供了新可能。

3.5 免疫調節(jié)

EVs對先天性和適應性免疫的調節(jié)作用也不容忽視。一方面，在先天性免疫中，中性粒細胞趨化募集是由趨化中性粒細胞來源的EVs內包含的白三烯B4驅動自分泌/旁分泌級聯(lián)反應所介導的[1]。最新研究表明，活化的單核細胞分泌的EVs內所包含的線粒體，可在內皮細胞中誘導系統(tǒng)性促炎I型IFN和TNF反應[45]，這可能是導致部分心血管疾病的潛在原因，通過分析血液中EVs內包含的相關物質，可以幫助提高疾病診斷與病情分析水平。與此同時，來自MSCs的EVs可以通過轉移miR-451a、miR-1202、miR-630和miR-638等調控物質，作用于Toll樣受體信號通路和NF-kB通路，參與抑制巨噬細胞介導的免疫應答反應[46]。因此，MSCs來源的EVs可以參與治療多種炎癥相關疾病，甚至可以作為免疫治療藥物載體發(fā)揮關鍵作用。另一方面，關于適應性免疫與EVs的關系，目前的研究發(fā)現(xiàn)MHC II類限制性抗原的呈遞依賴于囊泡轉運[47]。來自樹突狀細胞的EVs能夠促進抗原特異性T細胞活化和T輔助細胞(Th)向Th1表型分化[1]。也有研究表明，T調節(jié)細胞通過EVs介導的miRNAs轉移抑制Th1細胞增殖和細胞因子分泌，從而抑制Th1(CD4+ IFNgamma+)的炎癥反應[1]。以上這些發(fā)現(xiàn)均表明，EVs可以作為免疫疾病治療的新手段。

4 前景與展望

許多體外細胞與體內動物實驗研究結果和部分臨床研究數(shù)據(jù)表明，EVs在疾病的診斷和治療中發(fā)揮著關鍵作用，但目前EVs的臨床應用產(chǎn)品仍然較少，EVs在輔助臨床診斷和疾病預后監(jiān)測評估，參與疾病治療的潛力仍然有待發(fā)掘。

EVs能夠通過生物屏障，并且可以較為容易地從生物體液(如眼淚、血液、尿液等)中獲得，EVs能提供機體器官或組織在病理生理條件下有價值的生物信息，尤其是對于某些無法獲取或不方便直接獲取的器官或系統(tǒng)，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腎臟和胚胎-胎兒胎盤組織等。這些寶貴信息有助于輔助疾病診斷與病情監(jiān)測，甚至于疾病預后評估。但由于不同研究使用了不同的EVs分離和表征方法，因此在分析結果和總結結論方面也仍存在挑戰(zhàn)。此外，抑制EVs的形成與釋放可能是臨床上新的治療方法，對控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、轉移性腫瘤擴散、腎性子癇等疾病有潛在的應用價值。EVs還可以作為納米載體，將治療藥物轉運到受體組織或細胞中，從而達到治療目的。安全來源的EVs(例如MSCs來源EVs)可能包含選擇性遺傳物質或蛋白，靶向輸送到受體組織或細胞，參與生命活動。因此，基于EVs的納米載體技術為藥物在人體內的定向傳輸提供了良好遠景。然而，相關的大多數(shù)研究均是在體外和動物模型中進行的，這種方法在臨床試驗中的安全性和特異性仍然有待觀察。總體來說，雖然EVs有很好的應用前景，但在其提取與鑒定標準化以及臨床轉化應用等方面還存在諸多挑戰(zhàn)，因此在臨床上廣泛使用EVs仍需克服許多障礙，我們期待通過對EVs的不斷深入研究，可以促進EVs在臨床醫(yī)療成果轉化方面的進一步發(fā)展。