張娟麗 韓亞梅 王凡

支氣管肺發(fā)育不良（Bronchopulmonary dysplasia，BPD）是由于早產兒肺發(fā)育不成熟和出生前后自身或外界因素共同作用（如高氧、感染、機械通氣等）導致的肺和支氣管的異常發(fā)育。隨著新生兒醫(yī)學研究的深入以及圍產輔助生殖水平的提高，早產兒存活率明顯升高，尤其是超早產兒，故使得BPD的發(fā)病率增高。胎齡22～28周超早產兒近40%有發(fā)展為BPD的風險，是死亡和長期呼吸、神經發(fā)育殘疾的主要兒科就診原因[1]。臨床上引起B(yǎng)PD的病因較多，不同病因引起的BPD病理生理改變、臨床表現及預后不同[2]。新舊BPD的病理改變不同，舊BPD主要影響晚期早產兒，表現為肺泡結構損傷、炎癥細胞浸潤、氣管平滑肌增生及間質性改變引起的肺囊性病變及纖維化為主。而新BPD主要病理變化為肺發(fā)育不成熟，在外界因素的影響下，導致肺泡發(fā)育停滯、肺泡減少及簡單化、異常毛細胞血管發(fā)育和血管組織異常生長[3]。因BPD的發(fā)病機制目前仍不清楚，保護性治療措施在改善BPD中的臨床效果仍欠佳，故尋找參與BPD過程中的主要信號通路，為BPD提供靶向治療位點迫在眉睫。

1 轉化生長因子β1（TGF-β1）概述

TGF-β1是TGF-β超家族中的一員，在哺乳動物中僅存在3個亞型，分別是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，這3個亞型具有70%～82%的氨基酸同源性[4]。TGF-β1由人體中TGF-β基因編碼，位于染色體19q3[5]，通過二硫鍵將2條各含112個氨基酸的單鏈結合，是一種相對分子質量為25 000的多肽，具有調節(jié)細胞增殖、分化及遷移、凋亡、細胞外基質合成和免疫抑制等多種生物學功能，主要在內皮細胞、造血細胞和結締組織細胞中表達[6]。TGF-β1只有通過與相應受體結合，才能發(fā)揮相關生物效應，而與TGF-β1結合的受體有3種，分別是TGF-BRⅠ、TGF-BRⅡ及TGF-BRⅢ。而TGF-β的這3種亞型均與TGF-β2型受體作為同型二聚體結合，招募并激活TGF-β1型受體以啟動受體信號[7]。

2 TGF-β1與BPD

2.1 TGF-β1與血管形成大部分肺的發(fā)育發(fā)生在肺泡發(fā)育期，通過“二次間隔”使得厚壁囊狀氣道變?yōu)樾〉谋”诜闻?，肺毛細血管通過血管生成而擴張，增加肺的氣體交換面積。由于早產兒，特別是超早產兒和極早產兒的肺發(fā)育不成熟且抵抗力低，對氧氣依賴性高，同時大多數患兒需要不同程度的機械通氣等相關外界因素干擾，導致肺的發(fā)育受損，肺泡結構簡單化及微血管受損，引起B(yǎng)PD[8，9]。肺血管生成是肺泡化的關鍵驅動因素，內源性NF-κB活化具有促進早期肺泡的肺血管生成，但激活NF-κB的機制尚不清楚?，F有研究表明，TGF-β1是肌成纖維細胞在早期肺泡化中高度表達的分泌蛋白，為一種發(fā)育調節(jié)蛋白，激活肺內皮（PEC）中NF-κB，并通過整合素αvβ3增強NF-κB介導的內皮細胞（EC）遷移，促進肺內血管形成，而TGF-β1表達失調可能導致肺泡受損，分隔破壞及血管生長受損[10]。TGF-β1表達失調還可能導致在肺泡化受損的情況下，觀察到異常血管形成，說明TGF-β1是早期肺泡化過程中維持內皮NF-κB活性的關鍵因素。而TGF-β1介導的NF-κB活化和PEC遷移取決于其結合整合素的能力。αvβ3在新生血管中高度表達，αvβ3的激活促進EC的遷移，阻斷αvβ3可阻礙胚胎中血管管腔形成和血管模式[11]。研究表明TGF-β1通過整合素αvβ3促進人臍帶ECs的黏附和遷移[12]。TGF-β1促進血管形成的下游機制是集落刺激因子3（Csf3），Csf3是一種NF-κB的靶基因，編碼G-CSF，可導致內皮一氧化氮合酶（eNOS）的表達，以增加NO的產生，使eNOS缺失的小鼠肺毛細血管形成受損[13]。這是由于NO是血管生成的關鍵調節(jié)劑，也可維持血管的穩(wěn)態(tài)，eNOS表達減少可導致NO生成減少，臨床上利用iNO預防BPD的研究結果與其矛盾。在美國兒科學會一項單中心研究關于早產兒高劑量iNO（＞20ppm）治療使BPD的發(fā)生率略降低，但仍需進一步研究證明[14]，有研究表明iNO在BPD預防中沒有效果[15]，總之不支持利用iNO吸入預防BPD[16]。血管生成中斷是BPD的發(fā)病機制[17]。Yan等[18]研究發(fā)現TFG-β作為肺血管發(fā)育的調節(jié)因子，參與了BPD的形成。Goumans等[19]在體外實驗中發(fā)現TGF-β抑制內皮細胞增殖、遷移，阻止血管形成，可能與TGF-β結合活化素受體樣激酶5（ALK5）使Smad2/3磷酸化有關，而與上述信號通路功能相反的是TGF-β與活化素受體樣激酶1（ALK1）使Smad1/5磷酸化[20]，仍需進一步實驗驗證其信號通路間的相關作用。

2.2 TGF-β1與肺的損傷、修復BPD病因復雜，遺傳和環(huán)境因素協(xié)同作用于早產兒未成熟肺，炎癥是導致BPD多因素起源的中心環(huán)節(jié)[21]。有研究表明新生兒呼吸窘迫綜合征患兒因肺部發(fā)育不成熟，長時間暴露于高壓和高氧等外界因素下導致支氣管及肺泡受損，使得Ⅱ型肺泡上皮細胞增殖、分化停滯，不能轉化為Ⅰ型肺泡上皮，各種炎癥因子及趨化因子導致肺部炎癥、氧化應激和內皮損傷，阻止肺的發(fā)育，肺組織結構重建，組織纖維化，支氣管和毛細氣管及基底膜增厚，肺泡細胞凋亡、微血管受損，最終導致BPD形成[22]。肺部炎癥可引起機械通氣時間延長，進一步加重肺的損傷，形成惡性循環(huán)[23]。故目前認為肺發(fā)育不成熟、急性期損傷及損傷后異常修復是BPD發(fā)病的主要環(huán)節(jié)，而肺損傷和修復過程涉及EMC成分的變化和細胞生長、分化等。

2.2.1 TGF-β1與細胞外基質（ECM）人類妊娠后期是胎兒肺泡發(fā)育的關鍵時刻，在多種因素如早產、感染、高氧、機械通氣的影響下會使肺泡化和微血管發(fā)育過程異常，可導致肺泡數量減少，肺泡壁增厚，最終形成BPD[24]。ECM是構成肺泡隔的主要成分，其含有具有連接及支持組織結構的彈性蛋白、膠原蛋白等物質，正常情況下，各部分合成及降解之間保持平衡。ECM蛋白沉積增加可干擾正常的器官功能及損害組織結構。BPD中肺泡發(fā)育異常以及肺泡隔增厚都與ECM異常有關。TGF-β1一方面是ECM沉積的有效驅動因素，與ECM具有強親和力，在損傷部位形成促纖維因子池[25]。另一方面TGF-β1可以調節(jié)細胞對某些機制代謝酶，如機制金屬蛋白酶（MMP）的分泌來影響ECM的組成[26]。TGF-β1過度表達可激活肺原位成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，引起膠原蛋白（I型、Ⅲ型）、纖連蛋白等細胞外基質相關蛋白過度積累，損傷肺泡結構導致肺纖維化[27，28]。膠原蛋白I主要定位于支氣管、肺泡間隔和血管，在BPD患者中過度表達，導致BPD進展過程中肺泡間隔失效[29]。有研究表明，機械通氣可誘導肺組織TGF-β1生成，啟動有氧酵解，進一步促進肺纖維化[30]。TGF-β1與TGF-β1受體Ⅱ結合，引起磷酸化TGF-β1受體I激酶，進而激活Smad2/3通道，形成Smad2/3/4三聚體復合物進入細胞核，激活誘導細胞分化的轉錄因子P300及CPB。在高氧作用下，小鼠膠原蛋白與彈性蛋白比率較常氧組增加了3倍，與TGF-β信號刺激肺成纖維細胞有關[31]。具體的信號通路需進一步研究。朱富等[32]在體外試驗中研究發(fā)現利用艾拉莫德一方面抑制TGF-β1誘導的膠原蛋白mRNA的合成及纖連蛋白的表達，另一方面可以通過抑制TGF-β1誘導的smad2/3通道而達到抑制細胞分化，抑制肺纖維化，故通過抑制TGF-β/Smad途徑達到治療BPD有望實現。

2.2.2 TGF-β1與上皮細胞的增殖、凋亡 反復的肺泡上皮細胞損傷是引起肺纖維化過程中異常修復的始動因素[33]。研究表明，BPD的病理變化與吸入氧濃度（60%）有關，主要表現為肺泡數量減少、間隔增厚及血管發(fā)育遲緩，而炎性滲出及肺纖維化較輕，但若吸入80%左右氧濃度時，其主要變化以炎癥細胞浸潤、滲出及肺纖維化為主[34]，引起這一病理變化的機制尚不明確。白瓊等[35]發(fā)現利用活化素受體樣激酶5抑制劑SB43154阻斷TGF-β1/Smad途徑，可使肺纖維化程度減輕，肺泡上皮細胞及支氣管黏膜上皮細胞凋亡指數下降。說明肺纖維化過程中，有細胞凋亡的參與，而其可能的信號通路之一是TGF-β1/Smad。有報道TGF-β通過Smad3通路使得細胞內死亡相關蛋白激酶的表達上調，其與TGF-BRⅡ結合，激活了JNK/MAPK通路，誘導Fas受體相關蛋白TIEG和Daxx的表達，引起細胞凋亡[36]。有研究通過剔除小鼠細胞TGF-BRⅡ基因，減輕了肺泡上皮細胞的炎癥和細胞的凋亡[37]，但仍需多中心大樣本研究進一步證實。最近發(fā)現BPD小鼠的超氧化物歧化酶（SOD）活性隨著丙二醛（MDA）水平的提高而降低，孟魯司特作為一種有效的半胱氨酸白三烯（cysLT）受體拮抗劑可以降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1b表達及增強SOD活性，降低MDA表達，使得炎癥反應及氧化應激對肺的損傷減輕[38]。通過增加SOD活性可以治療BPD患者的肺損傷[39]。Kim等[40]經過多中心前瞻性隨機研究發(fā)現孟魯司特無預防BPD的作用，有待于進一步實驗研究證明。TGF-β已證實在高氧引起的慢性肺疾病（CLD）新生大鼠肺組織中周期蛋白依賴性激酶-2（CDK-2）表達增加，而細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子（P27）降低，且隨著用氧時間的延長，CDK-2的表達呈上升趨勢，而P27的表達呈下降趨勢[41]。說明細胞周期蛋白的異常表達引起了肺成纖維細胞的增殖。甚至有研究表明TGF-β1通過下調P27及上調CDK2促進細胞進入分裂周期，刺激肺成纖維細胞的增殖，引起B(yǎng)PD的形成[42]，故提示CKD2及P27可能為治療BPD的靶點。TGF-β1誘導細胞產生活性氧（ROS），ROS是體內細胞在氧化系統(tǒng)中產生的一類衍生物，包括氧自由基、過氧化物及激發(fā)態(tài)氧。正常情況下ROS水平較低，低水平ROS對機體有保護作用，參與機體的修復、免疫及凋亡。ROS生成增多，可直接引起組織損傷，同時ROS作為TGF-β1的第二信使，進一步調節(jié)TGF-β1激活的信號轉導途徑如JIK、P38等[43，44]。硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶-2（Peroxiredoxin-2，Prx-2）是一種新型過氧化物酶，通過降低ROS水平調控細胞內信號轉導過程，從而影響細胞增殖、轉移、蛋白合成及凋亡等生物學行為[44]。Prx-2過表達可能通過抑制ROS和JNK、P38通路激活，抑制TGF-β1促成纖維細胞增殖和膠原合成的作用，從而抑制纖維化[45]。

2.2.3 TGF-β1與上皮-間充質轉化（EMT）上皮-間充質轉化（EMT）在胚胎發(fā)育和組織重塑中發(fā)揮重要作用[46]。在正常肺情況下，肺泡Ⅱ型細胞可分化成肺泡Ⅰ型細胞，促進肺泡的形成。王思思等[47]通過新生大鼠持續(xù)吸入高濃度氧氣制備的BPD模型中發(fā)現高氧可引起Ⅰ型肺泡上皮細胞（AEC1）上AQP5蛋白表達下降，且隨著吸氧時間的延長AQP5持續(xù)下降，同時也可以導致Ⅱ型肺泡上皮細胞（AEC2）上SP-C蛋白表達下降，說明在高氧的刺激下，肺泡上皮細胞增殖及分化受到抑制，導致肺泡化功能障礙。楊海萍等[46]研究發(fā)現在BPD模型肺組織中，增殖的Ⅱ型肺泡細胞可能更多的發(fā)生了EMT，因為代表間充質細胞生物標記物N鈣黏蛋白（N-cad）、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）均增高，影響了AEC2向AEC1的分化，進而影響肺泡的發(fā)育，但其分子機制不明確。有研究表明TGF-β是EMT的中樞誘導劑，通過下調上皮標記物E-鈣黏蛋白（E-cad）的表達和上調間充質標志物N-鈣粘蛋白表達，而TNF樣弱細胞凋亡誘導劑（TWEAK）與TGF-β起協(xié)同作用，發(fā)揮著修復重塑作用[48]。目前研究中發(fā)現在人肺上皮細胞中TGF-β誘導的EMT中需要轉錄因子YY1過表達，YY1的敲低消除了TGF-β的EMT和促纖維誘導，同時發(fā)現NF-κB信號轉導可能在調節(jié)TGF-β/YY1過程中起著重要作用，但調控機制仍需進一步探索[49]。目前研究證明YY1是TGF-β誘導肺上皮細胞EMT和促纖維化的關鍵介質，為單獨靶向抑制YY1或與TGF-β或NF-κB抑制劑聯合治療肺纖維化提供了依據。有學者在高氧誘導的大鼠BPD模型中發(fā)現應用孟魯司特可使TGF-β1/Smads信號通路失活，下調TGF-β1的表達水平，抑制上皮-間充質轉化，減輕肺纖維化，改善BPD[50]。TGF-β1可通過激活Smad2引起肺泡上皮細胞在體外和體內進行EMT[49]。最新研究表明通過沉默的長鏈非編碼 RNA（lncRNA）X非活性特異性轉錄本（Xist）競爭性結合miR-1013p以抑制高遷移率族蛋白B3（HMGB3）并下調TGF-β1/Smad3軸，減輕BPD肺損傷[51]。有學者發(fā)現沉默的Xist抑制TGF-β調節(jié)的EMT和NSCLC細胞的生長[52]。這一發(fā)現為BPD的預防和治療提供新線索。

3 小結

結合目前研究可以發(fā)現，TGF-β1在早期促進遠端肺發(fā)育過程中對肺泡化及肺血管形成至關重要，充分說明TGF-β1的正確數量和正確位置都是支持血管生長所必需的，但在肺損傷修復過程中過度的表達，導致肺纖維化，引起B(yǎng)PD的發(fā)生，進一步說明了TGF-β1在肺發(fā)育和損傷過程中的雙重作用。雖然臨床上有針對特發(fā)性肺間質纖維化的藥物是通過抑制TGF-β而抑制ECM的沉積，抑制肌成纖維細胞生成達到治療效果，但由于TGF-β1作用于機體的信號通路復雜，同時由于新生兒群體的特殊性，使得TGF-β1在BPD研究較局限，仍需進一步研究TGF-β1各信號通路之間復雜網絡，選擇針對性干預措施，其有望成為預防和治療BPD的新靶點。