趙紅玉，徐 磊，易可可

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

磷素是地殼中含量較為豐富的非金屬元素，它也是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一，其高效吸收及利用對(duì)于植物正常生長發(fā)育至關(guān)重要。植物主要通過根系以磷酸鹽的形式吸收土壤中的磷素養(yǎng)分。但由于磷酸鹽在土壤中易被固定而難以被植物吸收利用，在田間生產(chǎn)過程中，主要是通過大量的加施磷肥來克服其容易固定的特點(diǎn)。盡管磷肥的大量使用極大地促進(jìn)了作物的產(chǎn)量，但當(dāng)季施用的磷肥只有15%～30%能被作物吸收利用。這也導(dǎo)致了當(dāng)前我國大量的耕地總磷含量高，而作物能吸收利用的有效磷含量相對(duì)較低。同時(shí)，大量的施加磷肥也會(huì)引起水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題，嚴(yán)重影響到現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。近期，Nature有報(bào)道指出，與石油資源的不可再生性類似，磷礦石為農(nóng)用磷肥的主要來源，有可能在50～100年之后消耗殆盡[1]。因此，農(nóng)業(yè)的安全可持續(xù)發(fā)展要求我們減少磷肥的使用量，這一目標(biāo)可以通過提高作物自身的磷吸收效率(根系從土壤中吸收磷的能力)和利用效率(磷在作物體內(nèi)的循環(huán)再利用效率)來實(shí)現(xiàn)。而要提高作物磷素吸收利用效率，要求我們更加清楚地解析作物吸收利用磷素的分子生理機(jī)制。

目前，對(duì)于作物中磷素信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)節(jié)磷素吸收機(jī)制的認(rèn)識(shí)較為完善。其中，調(diào)節(jié)作物體內(nèi)磷素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心調(diào)控因子是一類含有MYBCC結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子PHRs (phosphate starvation response)家族蛋白。PHRs主要通過結(jié)合下游磷饑餓誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子區(qū)域的P1BS順式作用元件來調(diào)控基因表達(dá)[2–3]。如，水稻中的磷信號(hào)核心轉(zhuǎn)錄因子OsPHR2可以直接結(jié)合磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體OsPT2的啟動(dòng)子，進(jìn)而調(diào)控水稻的磷素吸收平衡[4]。而近期的研究發(fā)現(xiàn)，一類負(fù)調(diào)控因子SPX (根據(jù)SYG1、Pho81和XPR1命名)家族蛋白也參與了PHR類轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)磷素供應(yīng)的活性調(diào)控[5–6]。如，在水稻中SPX4能負(fù)調(diào)控磷信號(hào)，正常供磷條件下該蛋白會(huì)與OsPHR2蛋白結(jié)合，阻礙其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并抑制其與下游的磷饑餓誘導(dǎo)表達(dá)基因(如高親和磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體等)的啟動(dòng)子結(jié)合，從而不啟動(dòng)缺磷信號(hào)[7]。在低磷脅迫條件下，由于細(xì)胞內(nèi)IP8含量的下降，導(dǎo)致SPX4與PHR2復(fù)合體解聚。而解聚的SPX4蛋白與SDEL1和SDEL2兩個(gè)E3泛素連接酶結(jié)合，并被泛素化修飾而降解，最終釋放PHR2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)從而啟動(dòng)下游的磷饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)，促進(jìn)水稻磷素吸收能力[8]。因此，SPX蛋白也被認(rèn)為是植物體內(nèi)磷素狀況的感應(yīng)器，參與核心轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器PHRs蛋白的活性調(diào)控。最近的研究發(fā)現(xiàn)PHR2能被E3泛素連接酶HRZ2結(jié)合，并被泛素化修飾而降解[9]。這些磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)重要調(diào)控因子及其降解調(diào)控機(jī)制的解析能更好地幫助我們理解作物磷素養(yǎng)分高效吸收機(jī)制。此外，基于對(duì)這些重要調(diào)控因子和下游磷酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體的認(rèn)知，我們可以非常方便的通過遺傳改良提高作物從外界吸收磷素的能力。如，在水稻中增強(qiáng)表達(dá)PHRs和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體PT等蛋白、敲除負(fù)調(diào)控因子SPXs，都能創(chuàng)制磷素高效吸收，從而提高植株磷含量的水稻種質(zhì)[6,10]。但真正在田間應(yīng)用這些基因和調(diào)控因子進(jìn)行作物磷素養(yǎng)分高效改良，目前仍少有成功案例。究其原因，主要是我們對(duì)于磷素養(yǎng)分在植株體內(nèi)循環(huán)再利用的認(rèn)知缺乏。

與作物中對(duì)磷素信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)磷素吸收分子機(jī)制認(rèn)知較為完善的現(xiàn)狀不同，磷素信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如何介導(dǎo)作物磷素養(yǎng)分體內(nèi)高效利用，尤其是體內(nèi)磷素循環(huán)再利用的分子生理機(jī)制至今仍不清楚。盡管部分參與調(diào)節(jié)器官間磷素分布的調(diào)控因子已經(jīng)相繼被鑒定。如，PHO1是一類SPX-EXS類蛋白，其主要在植物根系的木質(zhì)部表達(dá)，參與根系吸收的磷酸鹽在木質(zhì)部導(dǎo)管的加載。該基因功能喪失的水稻和擬南芥突變體都表現(xiàn)出了地上部磷素含量低的缺陷[11–12]。而PHO2是一類E2 泛素結(jié)合酶，能夠介導(dǎo)PHO1蛋白的降解，從而影響磷素在地上與地下部間的分配。與之相應(yīng)，PHO2功能喪失的水稻和擬南芥突變體都表現(xiàn)出地上部磷素高積累的表型[13–15]。但作物體內(nèi)組織細(xì)胞間磷酸鹽循環(huán)再利用的重要功能基因，如韌皮部磷素回流再利用的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，至今尚不明確；且老葉片中的磷素如何周轉(zhuǎn)再利用，及其與磷素信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間的互作機(jī)制至今仍不清楚。

導(dǎo)致這種問題的主要原因之一是我們?nèi)匀狈?jīng)濟(jì)高效檢測組織細(xì)胞磷素分布的技術(shù)和方法[16]。目前常見的磷含量化學(xué)測定方法都是對(duì)植物樣品進(jìn)行破壞性取樣后，利用樣品中提取的磷酸鹽與特殊化合物(如鉬酸銨和酒石酸銻鉀)特異反應(yīng)，并在特殊條件下形成帶色絡(luò)合物，從而進(jìn)行磷素含量的定量測定。這些化學(xué)方法受制于取樣方法和測定技術(shù)，難以原位對(duì)植物細(xì)胞組織中磷素進(jìn)行精準(zhǔn)測定。后期也有部分技術(shù)通過X射線熒光光譜或31P-NMR核磁共振譜等物理原理對(duì)植物樣品中磷素進(jìn)行測定或成像。但這類方法都需要采用昂貴的儀器設(shè)備，且無法高效地進(jìn)行組織細(xì)胞磷素含量測定。近年來，也有科學(xué)家通過利用基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理創(chuàng)制磷酸鹽熒光指示蛋白，并利用該類指示蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽含量進(jìn)行檢測和測定。如Sahu等[17]通過利用該類蛋白對(duì)擬南芥根系細(xì)胞質(zhì)中的磷酸鹽濃度進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)根系細(xì)胞處于不同發(fā)育階段及外界磷酸鹽供應(yīng)不同時(shí)，其細(xì)胞質(zhì)中的磷含量展現(xiàn)出了一定的變異。但這些技術(shù)需要?jiǎng)?chuàng)制相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因材料，且需要利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。同時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的磷酸鹽濃度一般保持在較穩(wěn)定的水平，主要受到液泡中儲(chǔ)存磷酸鹽的緩沖。該類技術(shù)也不利于我們高效地檢測植物細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽含量的動(dòng)態(tài)變化。因此，為了更好的理解磷素信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及重要功能基因如何影響體內(nèi)磷酸鹽的循環(huán)再利用，我們急需發(fā)展高效經(jīng)濟(jì)的組織細(xì)胞水平磷酸鹽檢測技術(shù)。

液泡磷酸鹽的儲(chǔ)存和利用對(duì)于作物磷素利用效率起著重要作用。在細(xì)胞水平，超出細(xì)胞代謝所需的磷酸鹽由PHT5家族蛋白運(yùn)輸入液泡內(nèi)儲(chǔ)存，作為儲(chǔ)備用于緩沖細(xì)胞磷素需求[18–19]。而這部分液泡儲(chǔ)存的磷酸鹽，能夠在細(xì)胞需要時(shí)通過VPE1和VPE2蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行利用[20]。且在外界磷素供應(yīng)不足時(shí)，原來儲(chǔ)存在液泡中的磷酸鹽不僅要釋放到胞質(zhì)中供細(xì)胞代謝所需，甚至要調(diào)運(yùn)到新葉中進(jìn)行再利用。VPE蛋白對(duì)于水稻體內(nèi)磷素再利用起著非常重要的作用，該類基因的突變將導(dǎo)致老葉中的磷素運(yùn)輸?shù)叫氯~途徑受阻。因此，進(jìn)一步解析PHT5和VPE家族基因協(xié)同作用機(jī)制，將有利于我們明確液泡磷酸鹽儲(chǔ)存平衡對(duì)于磷素內(nèi)部再利用的重要作用，并為提高水稻地上部磷素再利用效率提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)。

植物地上部磷素再利用，尤其是老葉中磷素要提供給新葉進(jìn)行再利用，都需要將磷酸鹽通過韌皮部的伴胞細(xì)胞加載到篩管細(xì)胞，使其隨著韌皮部溶液回流供應(yīng)給其它組織器官。因此，磷酸鹽在韌皮部的伴胞細(xì)胞加載到篩管細(xì)胞的過程對(duì)于磷素的再利用起著非常重要的作用。而影響該加載過程的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體是這一再利用途徑的關(guān)鍵基因。但參與調(diào)控韌皮部磷素回流再利用的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，至今尚不清楚。

因此，建立高效經(jīng)濟(jì)的植物細(xì)胞水平磷酸鹽檢測技術(shù)，并利用該技術(shù)解析水稻體內(nèi)組織細(xì)胞間磷酸鹽的循環(huán)再利用機(jī)制，從而為創(chuàng)制磷素高效利用水稻品種提供理論基礎(chǔ)和手段。

該項(xiàng)目研究內(nèi)容與方案：

1)高效經(jīng)濟(jì)的植物細(xì)胞水平磷酸鹽分布檢測技術(shù)建立和完善：借助不同化學(xué)染料，結(jié)合植物組織細(xì)胞處理及切片等技術(shù)，創(chuàng)建高效經(jīng)濟(jì)的植物細(xì)胞水平磷酸鹽分布檢測技術(shù)。并通過對(duì)已報(bào)道影響磷素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)重要功能基因相關(guān)突變體進(jìn)行系統(tǒng)檢測，進(jìn)一步驗(yàn)證和完善染色技術(shù)系統(tǒng)。

2)水稻磷素內(nèi)部再利用關(guān)鍵功能基因克隆及其調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子鑒定：結(jié)合反向遺傳學(xué)，借助韌皮部傷流液磷酸鹽含量測定等技術(shù)，分離并鑒定韌皮部磷酸鹽加載重要轉(zhuǎn)運(yùn)體和參與磷素由老葉到新葉轉(zhuǎn)運(yùn)的重要功能基因。借助協(xié)同表達(dá)分析等生物信息學(xué)手段，鑒定調(diào)控磷素內(nèi)部再利用關(guān)鍵調(diào)控因子，如調(diào)節(jié)韌皮部磷酸鹽加載轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因。

3)水稻磷素內(nèi)部再利用關(guān)鍵功能基因及其調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)植株內(nèi)磷酸鹽分配機(jī)制解析：對(duì)獲得的潛在影響水稻磷素內(nèi)部再利用的轉(zhuǎn)運(yùn)體基因及其調(diào)控因子相關(guān)遺傳材料進(jìn)行功能解析。并借助細(xì)胞水平磷酸鹽檢測技術(shù)，對(duì)相關(guān)遺傳材料在不同供磷條件下進(jìn)行精細(xì)分析。

4)磷信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與磷素內(nèi)部再利用關(guān)鍵功能基因和調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的遺傳分析：利用實(shí)驗(yàn)室長期研究的水稻磷信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)核心調(diào)控因子PHR2、SPXs等，通過與鑒定的水稻磷素內(nèi)部再利用關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行相關(guān)遺傳材料雜交，進(jìn)行遺傳分析，并建立相關(guān)遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

5)水稻組織細(xì)胞間磷酸鹽循環(huán)再利用的分子生理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及應(yīng)用：結(jié)合遺傳分析工作結(jié)果，選取水稻組織細(xì)胞間磷酸鹽循環(huán)再利用的重要調(diào)控因子相關(guān)遺傳材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組、ChIP-seq等分析，從而構(gòu)建相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，結(jié)合表型分析，對(duì)部分重要節(jié)點(diǎn)進(jìn)行遺傳改良，測試相關(guān)遺傳材料在不同供磷條件下的磷素養(yǎng)分利用效率，并評(píng)價(jià)其潛在應(yīng)用前景。