鐘 想，尹 旭，何天翼，杜佳尚，何志賢△

(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院甲乳外科/南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226000；2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210000；3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院甲乳外科，江蘇 南通 226000)

乳腺囊性增生病又稱為乳腺增生病，是一種內(nèi)分泌紊亂所致的乳腺疾病，屬于乳腺外科最常見疾病[1]。乳腺囊性增生病好發(fā)年齡為25～45歲，發(fā)病率為50%～70%[2]。目前，乳腺囊性增生病的主要病因及具體發(fā)病機制尚不明確，一般認(rèn)為，主要是由于在周期性月經(jīng)、妊娠、青春期及更年期間女性體內(nèi)發(fā)生內(nèi)分泌功能紊亂導(dǎo)致乳腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞增生及復(fù)舊不全所致[3]。乳腺囊性增生病患者主要臨床表現(xiàn)為乳房腫塊及周期性疼痛[4]。乳腺囊性增生病具有反復(fù)發(fā)作、遷延不愈等特征，很大程度上降低了患者生活質(zhì)量。另外，據(jù)文獻(xiàn)報道，該病與乳腺癌的發(fā)生具有一定相關(guān)性，乳腺囊性增生病患者發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險比普通人增加了4倍左右[5]。目前，針對乳腺囊性增生病西醫(yī)主要采取密切隨訪、藥物治療及手術(shù)干預(yù)等治療措施[6]。而中醫(yī)在治療乳腺囊性增生病方面也發(fā)揮著獨特的優(yōu)勢，可在提高臨床療效的同時減少西醫(yī)用藥劑量，改善機體免疫功能。

夏枯草別名“乃東”，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有辛、苦、寒、無毒等特征[7]。關(guān)于夏枯草的功效，《本草分經(jīng)》[8]記載：“解內(nèi)熱，散結(jié)氣，消癭，治目珠夜痛，久服傷胃?！毕目莶葑鳛橐晃稓v史悠久的中藥材，入肝經(jīng)，是散結(jié)止痛的好藥。中藥理論認(rèn)為，乳腺囊性增生病屬“乳癖”范疇，因肝郁氣滯所致，故夏枯草對治療此病具有獨特的優(yōu)勢。李杰茹等[9]臨床試驗結(jié)果顯示，夏枯草對乳腺囊性增生病具有明顯的療效。雖然夏枯草藥已廣泛用于臨床治療，但其治療乳腺囊性增生病的藥理分子作用機制尚未明確。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為研究中藥藥理作用機制的熱門方法，主要涉及中藥活性成分篩選、通路作用機制闡述及中藥配伍機制的探索等方面[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過生物信息技術(shù)構(gòu)建疾病-基因-靶點-藥物互作網(wǎng)絡(luò)，闡述藥物對疾病干預(yù)的藥理作用機制。本研究聯(lián)合運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)分析了夏枯草活性成分，預(yù)測了夏枯草治療乳腺囊性增生病的作用靶點及信號通路，進(jìn)一步闡述了夏枯草治療乳腺囊性增生病的相關(guān)分子機制，旨在為后期的臨床試驗提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 將通過美國TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索夏枯草中有效成分信息及其對應(yīng)的作用研究靶點，運用GeneCards、OMIM、PharmGkb、DrugBank數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)乳腺囊性增生病的臨床疾病靶點作為研究對象。

1.2方法

1.2.1收集中藥成分及靶點 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)[11]檢索夏枯草活性成分。根據(jù)毒藥物動力學(xué)原理設(shè)定2個篩選條件，即口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18，進(jìn)一步篩選夏枯草活性成分，利用所得到的潛在活性成分在該數(shù)據(jù)庫中檢索其對應(yīng)靶點。通過Perl軟件將所得的蛋白名轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的基因名，整理得到夏枯草有效成分的所有靶點。

1.2.2獲取乳腺囊性增生病相關(guān)疾病靶點 采用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)[12]、DurgBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)[13]、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org)[14]、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(https：//www.pharmgkb.org)[15],并以breast cystic hyperplasia為關(guān)鍵詞檢索其在數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)疾病靶點，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel16.0軟件，取去交集刪除重復(fù)靶點，得到乳腺囊性增生病的疾病靶點。以human為主要篩選條件，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將所得乳腺囊性增生病的疾病靶點的蛋白名轉(zhuǎn)化為基因名。

1.2.3構(gòu)建疾病-中藥活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)模型 為探究夏枯草中活性成分作用于乳腺囊性增生病的對應(yīng)靶點，通過Perl語言分析得到乳腺囊性增生病疾病靶點與夏枯草活性成分對應(yīng)靶點的交集靶點，并繪制韋恩圖；再將此中藥的活性成分與相互作用的交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建疾病-中藥活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行進(jìn)一步的拓?fù)浞治?，以研究夏枯草活性成分治療乳腺囊性增生病的藥理作用機制。

1.2.4構(gòu)建核心基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI) 將乳腺囊性增生病的相關(guān)疾病靶點與夏枯草活性成分對應(yīng)的靶點交集數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫[16]，按multiple proteins及Homo sapiens檢索，并隱藏游離節(jié)點，得到PPI。下載STRING數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的tsv格式文件，將所篩選的蛋白節(jié)點建立對應(yīng)關(guān)系并整理在Excel16.0軟件中，利用Cytoscape3.9.0 軟件進(jìn)行可視化，用CytoNCA插件篩選核心靶點，基于核心基因構(gòu)建相應(yīng)的PPI。

1.2.5基因本體(GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 利用R語言對疾病和藥物的交集靶點進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路富集分析，分別選取前10、20個條目，繪制氣泡圖和柱狀圖，得到夏枯草治療乳腺囊性增生病所參與的生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞成分及影響的主要信號通路。

1.2.6中藥關(guān)鍵活性成分與疾病核心靶點的分子對接驗證 運用PubChem數(shù)據(jù)庫下載中藥活性成分的3D結(jié)構(gòu)，并通過Chem3D軟件實現(xiàn)中藥活性成分能量最小化。在PDB數(shù)據(jù)庫檢索獲取靶點的蛋白3D結(jié)構(gòu)。利用SYBYL-X 2.0軟件進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)處理和分子對接。

2 結(jié) 果

2.1中藥有效活性成分及靶點 最終得到11個活性成分。見表1。將所得蛋白靶點通過perl語言轉(zhuǎn)化為186個基因靶點。

表1 夏枯草中藥活性成分情況

2.2乳腺囊性增生病相關(guān)疾病靶點篩選 共得到2 699個疾病相關(guān)靶點。見圖1。

圖1 各數(shù)據(jù)庫中乳腺囊性增生病的相關(guān)靶點

2.3疾病-中藥活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò) 共得到交集基因靶點141個，是夏枯草治療乳腺囊性增生病的作用靶點。見圖2?；赑erl語言，分析141個交集基因與夏枯草11個活性成分，導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件并構(gòu)建“疾病-中藥活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)。見圖3。共有152個節(jié)點和252條邊。與該點連接的邊的數(shù)量、度值越大，顏色越深，三角形的形狀越大，表示該節(jié)點與其他節(jié)點作用越廣泛，在該網(wǎng)絡(luò)中夏枯草有11種活性成分，分別為仙人掌黃素(Vulgaxanthin-I，MOL006767)、β-谷甾醇(beta-sitosterol，MOL000358)、7-豆甾烯酸(stigmast-7-enol，MOL006774)、菠菜甾醇(Spinasterol，MOL004355)、豆甾醇葡萄糖苷(poriferasterol monoglucoside，MOL006772)及木犀草素(luteolin，MOL000006)等。預(yù)測夏枯草是通過這11種活性成分對乳腺囊性增生病起療效的。

圖2 疾病與中藥共同靶點韋恩圖

圖3 疾病-中藥活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4夏枯草治療乳腺囊性增生病PPI及核心基因 將141個交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫獲得PPI信息，應(yīng)用Cytoscape3.9.0軟件將初始PPI可視化。見圖4。初始PPI共141個節(jié)點，2 420個條邊。節(jié)點代表夏枯草有效成分治療乳腺囊性增生病的基因靶點，靶點間的相互度值越大則顏色越深，表明該節(jié)點越重要。進(jìn)一步利用CytoNCA插件篩選核心靶點，取24種算法的交集基因。見圖5。獲得最終的核心靶點NFKBIA、VEGFA、CCND1、MYC等，說明夏枯草是可能通過這些乳腺囊腫增生病對應(yīng)的疾病靶蛋白發(fā)揮治療作用的。

圖4 交集蛋白PPI

圖5 核心靶蛋白獲取

2.5GO富集分析 通過R語言將疾病和中藥交集靶點按P值<0.05、Q值<0.05進(jìn)行GO富集分析得到生物過程、分子功能及細(xì)胞組成的前10條目繪制氣泡圖。見圖6。其中生物學(xué)過程中主要涉及異源刺激過程、脂多糖代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)等；在細(xì)胞成分中主要涉及膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞器外膜等；在分子功能中主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、類泛素蛋白連接酶及核受體活性等。

圖6 中藥與疾病交集靶點GO富集分析(前10條目)

2.6KGEE富集分析 通過R語言將疾病和中藥的交集靶點按P值<0.05、Q值<0.05進(jìn)行KEGG富集分析得到前20通路進(jìn)而繪制條形圖。見圖7。與乳腺囊性增生病密切相關(guān)的通路有晚期糖化終末產(chǎn)物-晚期糖化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號通路等。選取KEGG富集中與乳腺囊性增生病密切相關(guān)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)通路映射作用靶點。見圖8。表明夏枯草可能是通過上述通路對乳腺囊性增生病起治療作用的。

圖7 中藥與疾病交集靶點KEGG信號通路富集分析(前20)

圖8 cAMP信號通路(紅框代表共同基因)

2.7分子對接技術(shù)預(yù)測中藥活性成分和疾病靶點結(jié)合能力 利用SYBYL-X 2.0軟件將疾病-中藥活性成分-交集靶點所得到的的夏枯草治療乳腺囊性增生病的11個活性成分與NFKBIA、VEGFA、CCND1及MYC等24個核心靶點進(jìn)行分子對接，其中對接前4的活性成分與主要核心蛋白對接的總分結(jié)果見表2。這4組蛋白與中藥活性成分對接的總分均大于7分，表明夏枯草與其有較強的結(jié)合能力。其中仙人掌黃素與靶蛋白結(jié)合效果最佳，絲/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)是能與夏枯草中活性成分結(jié)合的最優(yōu)靶蛋白。AKT1受體蛋白與仙人掌黃素(總分為8.35分，與氨基酸殘基A/ARG25、A/ARG23、A/ARG86、A/ASN53、A/LYS14有5個氫鍵連接)見圖9A。絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)受體蛋白與仙人掌黃素(總分為7.59分，與氨基酸殘基A/SER34、A/LYS55、A/ASP169、A/ASN114有4個氫鍵連接)見圖9B。環(huán)加氧酶2(PTGS2)受體蛋白與豆甾醇葡萄糖苷(總分為8.32分，與氨基酸殘基A/GLN457、A/HIS214、A/GLN454有3個氫鍵連接)見圖9C。酪氨酸激酶受體2(ERBB2)受體蛋白與β-谷甾醇(總分為7.88分，B/ASN697、B/ARG696、B/GLU698、B/ARG716)見圖9D。上述配體化合物均能良好地包埋在受體靶蛋白的活性口袋中。

表2 夏枯草治療乳腺囊性增生的11個活性成分與主要核心蛋白分子對接得分(分)

A.仙人掌黃素與ATK1；B.仙人掌黃素與MAPK6；C.豆甾醇葡萄糖苷與PTGS2；D.β-谷甾醇與ERBB2。圖9 夏枯草中關(guān)鍵活性成分與PPI核心靶蛋白分子對接情況

3 討 論

中醫(yī)對乳腺囊性增生病的研究有很長的歷史淵源，早在戰(zhàn)國時期的《中藏經(jīng)》中就已有記載[17]。之后明朝時期的《外科活人定本》首次提出了“乳癖”這一概念，并且明確了其與乳房腫塊的關(guān)系。目前，依據(jù)中醫(yī)學(xué)臟腑經(jīng)絡(luò)理論及臨床治療經(jīng)驗將乳腺囊性增生病的發(fā)病機制主要歸結(jié)于以下方面，即肝氣郁結(jié)、肝郁脾虛、腎元氣損及沖任失調(diào)[18]。夏枯草是一味藥理作用廣泛且歷史悠久的中藥，在明代時期的《滇南本草》就已有關(guān)于夏枯草作為常用中藥材的記載[19]。目前，有研究表明，夏枯草具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫等功效，時常被用于乳腺囊性增生病的治療[20]。國內(nèi)在研究夏枯草治療乳腺囊性增生病的過程中發(fā)現(xiàn)其可以明顯提高三苯氧胺的療效，降低西藥不良反應(yīng)，減輕患者心理及生理負(fù)擔(dān)[21]。然而，目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)夏枯草治療乳腺囊性增生病的活性成分、作用靶點及信號通路等具體作用機制的文獻(xiàn)報道。所以，本研究旨在揭示夏枯草治療乳腺囊性增生病的藥理分子作用機制。

本研究通過聯(lián)合采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)分析其作用機制，結(jié)果顯示，夏枯草共有11個活性成分對乳腺囊性增生病具有關(guān)鍵治療作用，如仙人掌黃素、β-谷甾醇、7-豆甾烯酸、豆甾醇葡萄糖苷及木犀草素等；186個作用基因靶點。搜索得到乳腺囊性增生疾病靶點共2 699個；經(jīng)分析獲得141個交集靶點基因。進(jìn)而構(gòu)建了疾病-有效成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)，分析了有效成分與靶點、靶點與疾病的相互作用關(guān)系，為闡述夏枯草對乳腺囊性增生病治療機制提供了參考依據(jù)。

疾病-有效成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)顯示，仙人掌黃素、β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素及山柰酚相配對的靶點較多，可看作是夏枯草治療乳腺囊性增生病的主要活性成分。β-谷甾醇是一種植物甾醇，具有抗炎、抗氧化衰老及抗癌等功效[22]。有研究表明，β-谷甾醇可通過影響磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[23]。而本研究結(jié)果顯示，夏枯草在治療乳腺囊性增生病的過程中PI3K/Akt信號通路也處于抑制狀態(tài)，表明很有可能是夏枯草中的β-谷甾醇通過影響PI3K/Akt信號通路從而達(dá)到對乳腺囊性增生病的治療效果。仙人掌黃素具有抗炎的作用，可抑制細(xì)胞色素C氧化酶5活性及表達(dá)，進(jìn)而阻斷花生四烯酸代謝過程，發(fā)揮抗炎作用[24]。槲皮素是具有多種生物學(xué)功能的一類黃酮類化合物，可抗腫瘤、抗炎、抗氧化應(yīng)激等[25]。有研究表明，槲皮素在治療乳腺疾病方面也有較好的效果[26]。說明夏枯草中的活性成分可能通過抗炎、抗氧化、抗腫瘤及抑制增生發(fā)揮治療乳腺囊性增生病的療效。

本研究通過CytoCNA插件對PPI中交集靶點篩選得到有AKT1、PTGS2、MAPK8及TP53等24個核心靶點。預(yù)測其可能是夏枯草治療乳腺囊性增生病的主要靶點。AKT1是PI3K下游的一個重要靶蛋白，可促進(jìn)乳管上皮細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[26]。MAPK8可提高成纖維細(xì)胞增殖能力[27]。在乳腺囊性增生病的發(fā)病進(jìn)程中MAPK8可能參與了乳腺的不全修復(fù)。細(xì)胞色素C氧化酶2/PTGS2通過生成前列腺素發(fā)揮調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵作用，一些研究已表明，炎癥刺激可明顯提高PTGS2表達(dá)水平[28-29]。上述靶點的明確揭示了夏枯草治療乳腺囊性增生病的作用機制，也為今后新藥的制作提供科學(xué)的理論依據(jù)。

本研究通過KEGG信號通路富集分析顯示，夏枯草可通過影響AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、cAMP信號通路發(fā)生對乳腺囊性增生病的療效。很多種生物學(xué)過程與AGE-RAGE信號通路有關(guān)，如炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及纖維化等[30]。夏枯草治療乳腺囊性增生病主要涉及氧化應(yīng)激這一生物過程。本研究結(jié)果顯示，夏枯草的有關(guān)活性成分可通過AKT1和MAPKs影響AGE-RAGE信號通路，進(jìn)而抑制正常乳腺上皮細(xì)胞生長。目前，對AGE-RAGE信號通路的研究一般局限于糖尿病及冠狀動脈粥樣硬化等，所以，對乳腺疾病，此信號通路還有很大的探索空間。TNF是一種促炎性細(xì)胞因子，也是其他細(xì)胞因子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，如IL-1β、IL-6、IL-8等。TNF主要參與炎癥急性期反應(yīng)的誘導(dǎo)和趨化[31]。有研究表明，夏枯草可能通過IL-1β、MAPK8、肉瘤病毒癌基因同源物、AKT1等核心靶點影響正常乳腺細(xì)胞中的TNF信號通路，進(jìn)而發(fā)揮其對乳腺增生的抑制作用。IL-17信號通路也是一條參與炎性反應(yīng)的明星通路[32]。核心靶點中的PTGS2可阻斷IL-17信號通路的傳導(dǎo)，發(fā)揮抗炎作用。通過上述信號通路分析顯示，在夏枯草治療乳腺囊性增生病過程中主要作用機制是抗炎及緩解自身氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)揭示了夏枯草治療乳腺囊性增生病的藥理作用機制。夏枯草中的仙人掌黃素、β-谷甾醇、7-豆甾烯酸、豆甾醇葡萄糖苷、木犀草素等活性成分可通過AKT1、MAPK8、PTGS2、ERBB2、IL-1β等核心靶點對AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路進(jìn)行干預(yù)，提高正常乳腺上皮細(xì)胞抗炎和應(yīng)對氧化應(yīng)激能力，進(jìn)而在一定程度上達(dá)到抑制乳腺增生的效果。然而，本研究僅在理論上探討了夏枯草治療乳腺囊性增生病的藥理作用機制，尚有待于后期研究進(jìn)一步證明。