盧旺 白麗 陳煜

肝臟疾病是世界范圍內(nèi)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，全球每年約有200萬(wàn)人死于肝病，約116萬(wàn)人死于肝硬化及其并發(fā)癥，78.8萬(wàn)人死于肝癌，這些疾病加起來(lái)約占全世界死亡人數(shù)的3.5%[1]。如果將非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、藥物性肝病以及遺傳代謝性肝病等死亡原因納入其中，全球因肝病而死亡的患者比例將更高。因此，探究肝病發(fā)病新機(jī)制，以期獲取新的有效治療策略，是目前亟待解決的難題。近期von Meijenfeldt等研究證實(shí)了中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs) 存在于急性肝衰竭 (ALF) 患者肝組織中，并且與ALF患者不良預(yù)后顯著相關(guān)[2- 3]。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的先天性免疫細(xì)胞，因其獨(dú)特的異質(zhì)性和多功能特性，同樣參與調(diào)控病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝癌等多種肝病的病理過(guò)程，發(fā)揮著重要作用。外泌體(Exos)是細(xì)胞間物質(zhì)及信號(hào)傳遞的重要媒介，其攜帶的微小RNAs(miRNA)可通過(guò)靶向下游信號(hào)分子調(diào)控多種肝病的發(fā)病機(jī)制。本文就巨噬細(xì)胞及其來(lái)源Exos攜帶的miRNAs在肝病中的作用作一總結(jié)，希望為肝病的臨床診斷及治療提供新靶點(diǎn)和新思路。

一、巨噬細(xì)胞及其來(lái)源外泌體miRNAs

(一)巨噬細(xì)胞 巨噬細(xì)胞作為重要的先天性免疫細(xì)胞，具有很強(qiáng)的可塑性和多功能特性。受周圍微環(huán)境變化的影響，可通過(guò)JAK/STAT、TLR4/NF-κB、TGF-β/Smads、PPARγ、Notch和miRNA等信號(hào)通路極化為不同的表型，主要為經(jīng)典活化(M1型)巨噬細(xì)胞和替代活化(M2型)巨噬細(xì)胞。也有研究報(bào)道了M3、M4型巨噬細(xì)胞，而M2型巨噬細(xì)胞還可進(jìn)一步分為M2a、M2b、M2c和M2d亞型。M1型巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原提呈能力，能產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β、CXC趨化因子配體10(CXCL10)等，可募集循環(huán)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)入肝臟，在炎癥反應(yīng)、病原體清除、腫瘤抑制等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。M2型巨噬細(xì)胞則主要產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子，如IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等，在抑制炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)/耐受、血管生成、組織愈合及修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮作用。組織中巨噬細(xì)胞同時(shí)表達(dá)M1和M2活化標(biāo)志物，其平衡傾向決定了巨噬細(xì)胞最終執(zhí)行促炎損傷還是抗炎保護(hù)功能[4]。

(二)外泌體及其攜帶的miRNAs Exos是直徑30～150 nm、密度1.13～1.19 g/mL的圓盤狀或杯狀雙層膜包裹的納米囊泡，由質(zhì)膜和核內(nèi)體膜出芽產(chǎn)生。幾乎所有細(xì)胞均可分泌Exos。起初認(rèn)為Exos是細(xì)胞分泌的代謝廢物，后研究發(fā)現(xiàn)其攜帶的多種生物活性物質(zhì)，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等，可被遠(yuǎn)端靶細(xì)胞攝取，改變靶細(xì)胞的基因表達(dá)和功能，形成一種獨(dú)特的細(xì)胞間信號(hào)傳遞模式，在人類健康和疾病中發(fā)揮重要作用。

研究較多并已證實(shí)具有重要調(diào)控意義的Exos內(nèi)容物為miRNAs。miRNA是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過(guò)降解信使RNA(mRNA)或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯調(diào)控靶基因表達(dá)。最新研究證實(shí)，Exos中miRNAs存在主動(dòng)分選機(jī)制，miRNAs具有決定其是被篩選入Exos分泌到細(xì)胞外還是駐留在細(xì)胞本身的核酸序列，且不同細(xì)胞類型優(yōu)先使用特定的排序序列。重編程miRNAs可調(diào)控Exos中miRNAs的分泌，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因表達(dá)。此外，還有兩種miRNA結(jié)合蛋白(Alyref 和Fus)參與了miRNAs的輸出。該研究系統(tǒng)地闡述了Exos中miRNAs的組學(xué)數(shù)據(jù)，并嚴(yán)謹(jǐn)論證了Exos中miRNAs的分選機(jī)制，不僅將循環(huán)Exos中miRNAs與組織起源聯(lián)系起來(lái)，還為RNA靶向治療提供了理論依據(jù)和方法[5]。目前，Exos已逐漸成為新興的重要非侵入性檢測(cè)手段，為疾病早期診斷提供幫助。Exos也因其免疫原性低、生物相容性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)，有望作為天然藥物遞送載體，為新藥研發(fā)和疾病治療提供新靶點(diǎn)和新方向。

二、巨噬細(xì)胞及其外泌體miRNAs在肝病中的作用

(一)病毒性肝炎 病毒性肝炎以乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染最為常見(jiàn)，感染后易發(fā)生慢性化。全球有超過(guò)2.57億慢性HBV感染者，超過(guò)1.8億慢性HCV感染者。慢性HBV或HCV感染可增加肝硬化、肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，每年有超過(guò)80萬(wàn)人死于HBV感染[6- 7]。巨噬細(xì)胞作為重要的天然免疫細(xì)胞，是抵御病原體的第一道防線。肝臟巨噬細(xì)胞由固有巨噬細(xì)胞即庫(kù)普弗細(xì)胞(KCs)和循環(huán)單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MDMs)組成。當(dāng)肝臟受病毒感染時(shí)，KCs首先識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)并募集循環(huán)單核細(xì)胞，隨后募集的循環(huán)單核細(xì)胞局部分化為巨噬細(xì)胞即MDMs。HBV感染初期，KCs和MDMs產(chǎn)生和釋放促炎細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β)，并活化自然殺傷細(xì)胞，抑制HBV基因的表達(dá)和復(fù)制[8-9]。同樣，HCV感染可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β和IL-18[10]。在慢性HBV感染階段，HBV可調(diào)控巨噬細(xì)胞功能，即促炎細(xì)胞因子(IL-6和IL-1β)分泌減少、抗炎細(xì)胞因子(IL-10)分泌增多，導(dǎo)致機(jī)體病毒清除功能受抑制，促進(jìn)病毒感染的建立和持續(xù)感染狀態(tài)[11]。慢性HCV感染可同樣影響M1型巨噬細(xì)胞分化，損害CD8+ T細(xì)胞功能。因此，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)以抑制肝炎病毒的復(fù)制和傳播是治療病毒性肝炎的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，干擾素(IFN)-α誘導(dǎo)的肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(LNPCs)(包括KCs和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞)的抗病毒效應(yīng)可直接通過(guò)其分泌的Exos靶向傳遞給肝細(xì)胞。研究表明，IFN-α誘導(dǎo)LNPCs源性Exos所富含的蛋白(APOBEC3G)、mRNA(618種)和miRNA(hsa-miR-638、has-miR-4284 and hsa-miR-1260)的表達(dá)水平與非IFN-α誘導(dǎo)LNPCs源性Exos存在顯著差異。這些差異表達(dá)的內(nèi)容物存在抗HBV作用，但這種抗病毒效應(yīng)是這些生物活性物質(zhì)的共同作用還是其中某一分子的單獨(dú)效應(yīng)，還有待進(jìn)一步研究[12]。此外，IFN-α可顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性Exos中hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-25-5p和hsa-miR-574-5p的表達(dá)，其中hsa-miR-574-5p可與HBV基因組 2750-2757位點(diǎn)結(jié)合從而抑制HBV復(fù)制[13]。在HCV感染中，Toll樣受體(toll-like receptor , TLR)3激活的巨噬細(xì)胞能夠分泌富含miRNA-29家族的Exos。miRNA-29具有抗HCV作用，抑制miRNA-29可恢復(fù)HCV復(fù)制[14]。

(二)非酒精性脂肪性肝病 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓、高血脂和代謝相關(guān)的肝臟疾病。NAFLD全球患病率約為25%，且呈逐年上升趨勢(shì)[15]。NAFLD包括非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。研究顯示，在NAFLD初期，巨噬細(xì)胞以促炎M1型為主，可分泌促炎因子和趨化因子，加重肝臟炎癥反應(yīng)。隨著NAFLD的疾病進(jìn)展和肝纖維化的產(chǎn)生，巨噬細(xì)胞以M2型為主，在抗炎、促纖維化方面起重要作用。靶向巨噬細(xì)胞可作為NAFLD的治療手段。例如，小分子CCR2/ CCR5拮抗劑(cenicriviroc)可抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞在肝臟募集，有效改善胰島素抵抗，減輕肝臟脂肪變性和纖維化。目前，cenicriviroc已開(kāi)展Ⅱ期臨床試驗(yàn)[16-17]。另外，小劑量糖皮質(zhì)激素(地塞米松)聯(lián)合抗巨噬細(xì)胞CD163抗體復(fù)合物可減輕NAFLD的肝臟炎癥反應(yīng)[18]。利用GR - MD - 02阻斷主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞的半乳凝素(galectin, Gal)- 3 可減緩NAFLD肝纖維化，目前已開(kāi)展針對(duì)該阻斷劑的Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞源性Exos 攜帶的miRNAs也參與NAFLD的疾病過(guò)程。髓系特異性IL-6信號(hào)通路可特異性上調(diào)巨噬細(xì)胞源性Exos中miR-223的表達(dá)，進(jìn)而抑制下游靶分子PDZ結(jié)合基序轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ，一種促進(jìn)NASH肝纖維化的重要分子)的表達(dá)，從而發(fā)揮抗纖維化作用。此研究為NASH提供了新的治療靶點(diǎn)[20]。此外，NAFLD是膿毒血癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且與NAFLD患者肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和能量代謝異常相關(guān)。巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2(TREM2)，抑制TREM2可上調(diào)巨噬細(xì)胞源性Exos中miR-106b-5p表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)阻斷下游線粒體融合蛋白2(MFN2)靶分子，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)改變和能量代謝障礙。TREM2有望作為潛在臨床治療靶點(diǎn)[21]。

(三)酒精性肝病 酒精性肝病(ALD)是一種因長(zhǎng)期大量飲酒所致的肝臟疾病。乙醇可激活KCs中NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體，釋放促炎細(xì)胞因子IL-1β，并募集和活化恒定自然殺傷T(iNKT)細(xì)胞，促進(jìn)肝臟炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[22-23]。而抑制熱休克蛋白90(HSP90)和活化的熱休克因子1(HSF1)可顯著抑制NLRP3炎癥小體活化，減少IL-1β 和 IL-18釋放[24]。另有研究報(bào)道，調(diào)控基因Bmal1(Bmal1)可通過(guò)靶向鈣結(jié)合蛋白A9(S100A9)負(fù)調(diào)控糖酵解途徑，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2極化，減緩ALD炎癥反應(yīng)[25]。此外，菊粉(一種自然界廣泛存在的生物多糖)能調(diào)控腸道菌群產(chǎn)生短鏈脂肪酸，通過(guò)?TLR4-MyD88-NF-κB軸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2極化，減輕ALD炎癥反應(yīng)[26]。

在ALD疾病過(guò)程中，Exos 攜帶的RNA也參與細(xì)胞間物質(zhì)和信號(hào)傳遞。酒精處理的肝細(xì)胞分泌的Exos富含線粒體雙鏈RNA(mtdsRNA)，可活化巨噬細(xì)胞TLR3，促進(jìn)IL-1β和IL-17A表達(dá)。因此，mtdsRNA 和TLR3可作為ALD的治療靶點(diǎn)[27]。研究還發(fā)現(xiàn)，ALD患者血漿Exos和ALD動(dòng)物模型肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞源性Exos中miR-155含量顯著升高，該分子可作用于下游靶分子(mTOR, Rheb，LAMP1和LAMP2)，在mTOR通路和溶酶體水平調(diào)控自噬。而LAMP1和LAMP2表達(dá)下調(diào)可顯著促進(jìn)Exos的產(chǎn)生和釋放。因此，miR-155在酒精誘導(dǎo)的自噬損傷和Exos產(chǎn)生釋放過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[28]。

(四)肝纖維化 肝纖維化是各種原因引起的肝臟反復(fù)炎癥損傷后細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉積或瘢痕形成的病理結(jié)果。在慢性炎癥刺激作用下，巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌TGF-β1、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等促使肝星狀細(xì)胞(HSCs)活化，進(jìn)而分泌ECM促進(jìn)損傷修復(fù)。然而，過(guò)多的ECM累積將導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。另一方面，巨噬細(xì)胞還可通過(guò)自身吞噬作用以及分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、趨化因子受體CX3CR1、抗炎細(xì)胞因子等減輕肝臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)活化的HSCs凋亡和ECM降解，從而抑制肝纖維化發(fā)生、發(fā)展。

巨噬細(xì)胞源性Exos可參與巨噬細(xì)胞和HSCs間信號(hào)傳遞，調(diào)控HSCs增殖和活化。有研究顯示，脂多糖(LPS)可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性Exos中富含的miRNAs發(fā)生顯著改變。LPS處理的巨噬細(xì)胞源性Exos中miR-103-3p顯著上調(diào)，其可通過(guò)靶向抑制Krüppel樣因子(KLF)4促進(jìn)HSCs的增殖和活化。臨床上，肝纖維化S3-S4期患者血清Exos中miR-103-3p水平顯著高于早期肝纖維化組[29]。 此外研究還顯示，LPS處理的巨噬細(xì)胞源性Exos富含miR-500，其可通過(guò)下調(diào)靶分子MFN2表達(dá)，影響Smad2/Smad3磷酸化和TGF-β蛋白水平，促進(jìn)肝纖維化。肝纖維化S4期患者血清中miR-500水平顯著升高、MFN2水平顯著降低，兩者呈負(fù)相關(guān)[30]。miR-103-3p和miR-500可作為診斷肝纖維化的潛在標(biāo)志物。松弛素(relaxin, RLN)與巨噬細(xì)胞表達(dá)的松弛素受體結(jié)合可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，即由促纖維化表型轉(zhuǎn)換為促消融表型，后者釋放的Exos中含有miR-30a-5p，它可通過(guò)靶向作用于細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)促進(jìn)HSCs中PPAR-γ上調(diào)，抑制HSCs活化，發(fā)揮抗纖維化作用。研究者還開(kāi)發(fā)了一種同時(shí)裝載RLN基因和miR-30a-5p模擬物的脂質(zhì)納米顆粒，并證實(shí)這種基因組合治療能夠發(fā)揮更強(qiáng)的抗肝纖維化作用[31]。還有研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種同時(shí)裝載抗纖維化藥物(尼達(dá)尼布)和KCs抑制劑(氯膦酸二鈉)的外泌體-脂質(zhì)體復(fù)合物，體內(nèi)/外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可增強(qiáng)抗肝纖維化治療作用，為抗肝纖維化治療提供了新思路[32]。

(五)肝癌 2020年國(guó)際癌癥研究中心發(fā)布最新數(shù)據(jù)顯示，肝癌是全球第六大常見(jiàn)癌癥，在癌癥相關(guān)死亡原因中排第三位[33]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)因參與腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)而受到廣泛關(guān)注。TAMs主要表現(xiàn)為M2樣極化，具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用。研究顯示，TAMs可通過(guò)其分泌的Exos來(lái)發(fā)揮作用。TAMs源性Exos富含miR-92a-2-5p，該分子可靶向抑制肝癌細(xì)胞的雄激素受體(AR)表達(dá)，通過(guò)調(diào)控PHLPP/p-AKT/β-catenin信號(hào)通路增加肝癌細(xì)胞的侵襲能力[34]。M2巨噬細(xì)胞源性Exos還可通過(guò)其攜帶的miR-27a-3p靶向下調(diào)肝癌細(xì)胞硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的癌干性[35]。此外，在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-660-5p表達(dá)升高，同時(shí)KLF3表達(dá)降低。體內(nèi)/外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，M2巨噬細(xì)胞源性Exos攜帶的miR-660-5p可通過(guò)下調(diào)下游靶基因KLF3促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[36]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞具有抑癌作用。M1型巨噬細(xì)胞源性Exos中攜帶的miR-326可通過(guò)下調(diào)NF-κB表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其凋亡[37]。誘導(dǎo)TAMs向M1型極化可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。最新研究顯示，重編程M1巨噬細(xì)胞源性Exos，即轉(zhuǎn)染NF-κB p50 siRNA 和miR-511-3p以及表面修飾IL4R結(jié)合蛋白，可誘導(dǎo)TAMs向M1極化，下調(diào)相應(yīng)靶基因，減少M(fèi)2細(xì)胞因子和免疫抑制細(xì)胞，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高抗腫瘤免疫能力。該研究提供了一種新型的腫瘤免疫治療方法[38]。

(六)肝衰竭 肝衰竭是多種因素引起的一種嚴(yán)重肝病癥候群，導(dǎo)致肝臟合成、解毒、代謝和轉(zhuǎn)化等功能嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)黃疸、凝血功能障礙、肝腎綜合征、肝性腦病、腹水等臨床表現(xiàn)，具有病因多樣、臨床表現(xiàn)復(fù)雜、病死率高、治療難度大等特點(diǎn)。肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞廣泛壞死，死亡細(xì)胞釋放的損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)與巨噬細(xì)胞上的模式識(shí)別受體結(jié)合，激活炎癥小體(如NLRP3)，隨后誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、CXCL10等促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，發(fā)揮促炎損傷作用。研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞源性Exos可通過(guò)抑制NLRP3通路阻止促炎巨噬細(xì)胞的增殖和活化，減少促炎細(xì)胞因子的分泌，從而顯著改善ALF[39]；還可通過(guò)激活自噬，減少肝細(xì)胞凋亡，發(fā)揮肝保護(hù)作用。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞源性Exos在促進(jìn)肝臟再生方面也具有重要作用[40]。目前，關(guān)于巨噬細(xì)胞源性Exos在肝衰竭中作用機(jī)制的研究較少。有研究報(bào)道，巨噬細(xì)胞源性細(xì)胞外囊泡(EVs)高表達(dá)miR-122-5p和miR-148a-3p，通過(guò)靶向抑制下游炎癥反應(yīng)通路，在Con A誘導(dǎo)的肝損傷模型中發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用[41]。

三、展望

巨噬細(xì)胞作為重要的先天性免疫細(xì)胞，參與多種肝病的炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)。外泌體作為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、免疫原性低、生物相容性好的天然載體，可富集和傳遞多種特異性生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸(mtdsRNA、miRNAs等)，從而發(fā)揮穩(wěn)態(tài)維持、細(xì)胞間物質(zhì)及信號(hào)傳遞、抗原提呈等重要作用，目前已逐漸成為新興的重要非侵入性肝病檢測(cè)手段和靶向藥物載體。巨噬細(xì)胞和Exos均在多種肝病中具有重要作用。然而，巨噬細(xì)胞來(lái)源的Exos及其內(nèi)容物在肝病(尤其肝衰竭)中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。