趙悅竹，金 鑫，張嶼楠，李敬雙，于 洋,

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院，遼寧錦州 121001；

2.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

近代以來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，生物體有著應(yīng)對(duì)細(xì)胞正常代謝活動(dòng)產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮等自由基的一套調(diào)節(jié)系統(tǒng)，且涉及到多種信號(hào)通路間的協(xié)同作用。當(dāng)外界刺激導(dǎo)致ROS過(guò)度積累至超過(guò)機(jī)體的調(diào)節(jié)能力時(shí)，有害物質(zhì)引起抗氧化通路上的某些蛋白表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)失衡，此時(shí)即表現(xiàn)為氧化應(yīng)激狀態(tài)[1]。氧化應(yīng)激與多種疾病的形成有關(guān)，如缺血性腦卒中[2]、阿爾茨海默病[3]、糖尿病[4]等，并在引起人體炎癥反應(yīng)和衰老中起重要作用[5]。因此，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷依舊是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。

蘆薈多糖（aloe polysaccharide，AP）是從蘆薈中提取的天然多糖類化合物，具有增強(qiáng)免疫[6]、促進(jìn)癌細(xì)胞自噬[7]、抗炎[8]等多種藥理作用。已有研究顯示，蘆薈多糖能下調(diào)黃曲霉毒素B1代謝活化酶細(xì)胞色素P4501A2和3A的表達(dá)，減輕黃曲霉毒素B1造成的肝臟損傷[9]；通過(guò)下調(diào)結(jié)腸組織中OX40、OX40L蛋白表達(dá)水平，減弱炎癥性腸病小鼠免疫功能過(guò)度激活而實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥性腸病的治療作用[10]。

劉澤鑫等[11]通過(guò)測(cè)定蘆薈多糖清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2,2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]和超氧陰離子等的能力，得出蘆薈多糖具有體外抗氧化活性的結(jié)論；張曉林等[12]通過(guò)腹腔注射四氯化碳構(gòu)建小鼠肝損傷模型，中華蘆薈多糖能起到提高血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等相關(guān)酶活力，減輕小鼠急性肝損傷程度的作用。但有關(guān)蘆薈多糖對(duì)細(xì)胞抗氧化作用的具體機(jī)制尚缺乏深入系統(tǒng)性的研究，本研究通過(guò)測(cè)定氧化應(yīng)激損傷的HepG2細(xì)胞存活率、抗氧化酶活力、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和相關(guān)基因的表達(dá)水平，探討蘆薈多糖對(duì)D-半乳糖致細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，為蘆薈多糖的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆薈多糖、維生素C（Vitamin C，VC） UV≥98%，源葉生物科技有限公司；D-半乳糖（D-galactose，Dgal） 生物技術(shù)級(jí)，麥克林生化科技有限公司；人肝癌細(xì)胞株HepG2 錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院保存；DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）、胰蛋白酶消化液、青-鏈霉素混合液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 賽默飛世爾科技有限公司；細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑盒、總RNA抽提試劑（Trizol）

碧云天生物技術(shù)研究所；人丙二醛酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、人總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）ELISA試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green? Premix Ex Taq? II試劑盒 大連寶生物工程有限公司。

HR40-B2型生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；Read Max1500型光吸收全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司；Olympus BX53倒置光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；3H12RI智能高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；CB-S 170二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 德國(guó)Binder公司；JY88-IIN超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Mastercyler ep realplex4型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、BioPhotometer plus型蛋白核酸分析儀 德國(guó)Eppendorf公司；Tanon 2500全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 中國(guó)天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)Juan等[13]的實(shí)驗(yàn)方法，以含10% FBS、1%青-鏈霉素雙抗混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2為常規(guī)條件培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到85%時(shí)，PBS洗去破碎的細(xì)胞與代謝產(chǎn)物，胰酶收集細(xì)胞并按1:3比例傳代。剩余細(xì)胞均勻混合至含10% DMSO的FBS中，-80 ℃或液氮條件下凍存。

1.2.2 CCK-8法測(cè)定蘆薈多糖安全濃度范圍 CCK-8溶液可以通過(guò)與活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶發(fā)生還原反應(yīng)生成橙黃色物質(zhì)，使細(xì)胞數(shù)目與顏色呈線性關(guān)系[14]。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以密度為5×104個(gè)/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞充分貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用pH調(diào)節(jié)至7.2～7.4，濃度為0.01 mol/L的PBS漂洗1～2次，并進(jìn)行分組：蘆薈多糖組加入100 μL含蘆薈多糖（終濃度分別為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL）的DMEM完全培養(yǎng)基；對(duì)照組予以等體積完全培養(yǎng)基。于37 ℃、5% CO2條件下與細(xì)胞共培養(yǎng)20 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，常規(guī)孵育2 h，按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的吸光度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。每濃度組設(shè)五個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立 以含1%青-鏈霉素雙抗混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基，按1.2.2的方法，將細(xì)胞以5×104個(gè)/mL接種到96孔板中，每孔100 μL。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，更換為100 μL含D-gal（終濃度為50、100、200、400 mmol/L）的無(wú)血清培養(yǎng)基，對(duì)照組予以等體積無(wú)血清培養(yǎng)基，分別誘導(dǎo)12、24、36 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。每濃度組設(shè)五個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 蘆薈多糖對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞存活率的影響

按1.2.2的方法，將細(xì)胞以5×104個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組、D-gal模型組、VC陽(yáng)性組、蘆薈多糖低、中、高濃度保護(hù)組，每組設(shè)五個(gè)復(fù)孔。

細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h至完全貼壁后棄去培養(yǎng)基，VC陽(yáng)性組加入終濃度為100 μg/mL的含VC完全培養(yǎng)基，蘆薈多糖保護(hù)組每孔加入100 μL終濃度為25、50、100 μg/mL的含蘆薈多糖完全培養(yǎng)基；對(duì)照組與模型組予以等體積完全培養(yǎng)基，常規(guī)條件下與細(xì)胞共培養(yǎng)20 h。棄去培養(yǎng)基，除對(duì)照組外，每孔各加入D-gal濃度為200 mmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，誘導(dǎo)24 h；對(duì)照組加入等體積的無(wú)血清培養(yǎng)基，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.5 細(xì)胞抗氧化酶活力、T-AOC水平及MDA含量測(cè)定 酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法是通過(guò)抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物在辣根過(guò)氧化物酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)的免疫學(xué)分析方法，相比傳統(tǒng)方法靈敏度更高。采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞中T-AOC、MDA含量，能更好地排除其他條件干擾，較真實(shí)地反映出待測(cè)值水平。

SOD活性檢測(cè)采用WST-8比色法[15]，基于甲臢染料的顯色反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞中SOD酶活性；CAT酶可以催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生水和氧氣，通過(guò)計(jì)算其在單位時(shí)間內(nèi)催化產(chǎn)物生成量，可確定細(xì)胞中CAT活力[16]；GPx能特異性催化有機(jī)過(guò)氧化物試劑與還原型谷胱甘肽反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物TNB，定量檢測(cè)GPx酶活力。

參考Wang等[17]的方法，將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL濃度接種于6孔板中，每孔1 mL。鋪板后十字搖勻，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24 h。鏡下觀察細(xì)胞充分貼壁后，移除舊培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，按照1.2.4的方法進(jìn)行分組和給藥，每孔1 mL。D-gal誘導(dǎo)結(jié)束后，收集每孔培養(yǎng)上清液，4000 r/min條件下離心10 min，棄去沉淀，按說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA水平。

取出上清液后，每孔加適量PBS洗1～2次。用無(wú)菌刮刀輕柔刮下孔板底部的細(xì)胞，加入1 mL預(yù)冷的PBS，混勻后置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中，超聲功率200 W，超聲時(shí)間5 s，間隔10 s，重復(fù)30次。鏡下觀察細(xì)胞破碎效果，取充分裂解后的細(xì)胞勻漿，4000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，分別按說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞中SOD、CAT、GPx、T-AOC水平。實(shí)驗(yàn)設(shè)五組平行。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞Keap1、Nrf2、NQO1和HO-1的mRNA表達(dá)量 將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于6孔板中，每孔1 mL。十字搖勻后，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，按照1.2.4的方法進(jìn)行分組與給藥，每孔1 mL。D-gal造模結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，胰酶消化、收集細(xì)胞于無(wú)RNA酶EP管中，加入PBS吹勻，離心1～2次洗凈胰酶。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA純度和濃度。RNA純度A260/280在1.8～2.1之間，濃度用無(wú)RNA酶水調(diào)整至400～600 ng/μL。

按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與TB Green嵌合熒光法實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。PCR體系為25 μL，95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，循環(huán)40次。參考潘聰?shù)萚18]的引物設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1），GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物[19]。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆薈多糖的安全濃度范圍

細(xì)胞存活率是衡量細(xì)胞損傷程度的直觀指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8法測(cè)定不同濃度蘆薈多糖共培養(yǎng)條件下HepG2細(xì)胞的存活率，從而分析藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用，確定蘆薈多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的安全濃度范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在12.5～400 μg/mL范圍內(nèi)，HepG2細(xì)胞的存活率均≥90%；當(dāng)質(zhì)量濃度小于400 μg/mL時(shí)，蘆薈多糖處理組與對(duì)照組之間的差異不顯著（P＞0.05），即此時(shí)蘆薈多糖對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。綜合考慮，選擇質(zhì)量濃度為25、50、100 μg/mL的蘆薈多糖作為低、中、高濃度組來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 1 蘆薈多糖對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of aloe polysaccharide on the survival rate of HepG2

2.2 HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立

D-半乳糖（D-galactose，D-gal）是一種穩(wěn)定性較高的六碳醛糖，在機(jī)體中通過(guò)半乳糖氧化酶進(jìn)行代謝。當(dāng)D-gal大量堆積于細(xì)胞時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞糖代謝異常[20]，進(jìn)而引起細(xì)胞腫脹、壞死，破壞機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，致使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象。

HepG2細(xì)胞存活率與D-gal濃度、誘導(dǎo)時(shí)間的關(guān)系如圖2所示。隨著D-gal濃度增大和誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其中，400 mmol/L濃度組的細(xì)胞存活率均在60%以下，表明通過(guò)Dgal誘導(dǎo)細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型的方法具有可行性。通常情況下，細(xì)胞用作構(gòu)建損傷模型時(shí)的存活率應(yīng)在50%～70%之間，此時(shí)既達(dá)到損傷要求，又不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆?zhèn)21]。結(jié)果表明，當(dāng)D-gal濃度為200 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為24 h時(shí)，細(xì)胞存活率降至66.92%±3.70%，處于構(gòu)建模型的適宜范圍之內(nèi)。由此選擇D-gal誘導(dǎo)條件為200 mmol/L，24 h。

圖 2 D-gal對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of D-gal on the survival rate of HepG2 cells

2.3 蘆薈多糖對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞存活率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。D-gal誘導(dǎo)后的細(xì)胞存活率降至63.68%±2.64%，與對(duì)照組相比有極顯著差異（P＜0.01），且處于構(gòu)建損傷模型的存活率范圍內(nèi)，可視為造模成功。蘆薈多糖低、中、高濃度組細(xì)胞存活率分別為70.27%±4.43%、75.26%±3.49%、82.74%±4.06%，與模型組相比均有顯著提高（P＜0.05），且細(xì)胞存活率與蘆薈多糖濃度呈正相關(guān)，其中終濃度50、100 μg/mL的蘆薈多糖處理組表現(xiàn)為極顯著（P＜0.01）。維生素C作為天然抗氧化劑，可以清除人體內(nèi)過(guò)氧化自由基、猝滅單線態(tài)氧，減輕機(jī)體氧化損傷，并參與修復(fù)受損的組織細(xì)胞[22]。以VC為陽(yáng)性參照組，中、高濃度的蘆薈多糖組細(xì)胞存活率與其沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），體現(xiàn)了相近的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三個(gè)濃度組的蘆薈多糖預(yù)保護(hù)處理均能顯著提高氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞存活率（P＜0.05）。

圖 3 蘆薈多糖對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of aloe polysaccharide on cell survival rate of oxidative stress injury

圖 4 蘆薈多糖對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞MDA含量的影響Fig.4 Effect of aloe polysaccharide on MDA content in oxidative stress induced injury cells

2.4 蘆薈多糖對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化能力的影響

2.4.1 細(xì)胞上清液MDA含量測(cè)定 MDA是由ROS作用于細(xì)胞膜發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化而產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，其過(guò)量積累會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)溢出，損害細(xì)胞功能[23]。因此，可通過(guò)MDA含量檢測(cè)細(xì)胞受氧化損傷程度[24]。如圖4所示，D-gal模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA含量為（14.53±0.82）nmol/mL，與對(duì)照組（6.78±0.55）nmol/mL相比有極顯著增加（P＜0.01）。在實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞經(jīng)過(guò)25～100 μg/mL蘆薈多糖的預(yù)保護(hù)處理，MDA的含量均較模型組顯著降低（P＜0.05），分別為（11.83±0.99）、（10.56±0.82）、（8.39±0.45）nmol/mL，表明蘆薈多糖可以在一定程度上緩解ROS對(duì)細(xì)胞造成的損傷，且其保護(hù)作用隨濃度的增高而逐漸加大，其中高濃度組的蘆薈多糖處理較VC組（9.95±0.84 nmol/mL）效果更顯著（P＜0.05）。

2.4.2 細(xì)胞抗氧化酶系活力測(cè)定 ROS由過(guò)氧化氫、超氧陰離子、羥基自由基、單線態(tài)氧等組成，炎癥反應(yīng)、冷熱應(yīng)激、衰老、紫外線、過(guò)量攝入酒精等內(nèi)外界因素都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS大量積累。清除ROS是保護(hù)生物體減輕氧化應(yīng)激損傷的重要途徑，在人體中主要靠抗氧化酶系來(lái)實(shí)現(xiàn)。SOD、CAT、GPx屬于常見(jiàn)的抗氧化酶類，參與組成生物對(duì)氧化損傷的防御體系，降低ROS對(duì)細(xì)胞的侵害[25-26]。實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)HepG2細(xì)胞中三種酶活力的變化，來(lái)初步評(píng)價(jià)蘆薈多糖的抗氧化能力。結(jié)果見(jiàn)表2。

D-gal造模后，三種酶活力均較正常細(xì)胞極顯著降低（P＜0.01），D-gal對(duì)細(xì)胞抗氧化酶活性起明顯抑制作用。與模型組相比，中、高濃度蘆薈多糖處理組細(xì)胞中三種酶的活力水平均顯著增強(qiáng)（P＜0.05），其中，SOD、GPx活力上升趨勢(shì)與蘆薈多糖呈濃度依賴關(guān)系。在25 μg/mL的蘆薈多糖處理組中，GPx活力與模型組相比顯著升高（P＜0.05），SOD、CAT活性雖有所提高但差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)蘆薈多糖濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞中SOD的活性顯著高于VC陽(yáng)性組（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，蘆薈多糖能增強(qiáng)氧化應(yīng)激條件下HepG2細(xì)胞中SOD、CAT、GPx的活性，作用效果與其濃度呈正相關(guān)。

2.4.3 細(xì)胞總抗氧化能力 總抗氧化能力（T-AOC）代表能夠平衡細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的各種抗氧化活性物質(zhì)和酶系的總體水平，通常用來(lái)綜合評(píng)價(jià)生物抵御氧化應(yīng)激損傷的能力[27]。由表2可知，D-gal誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞總抗氧化能力極顯著降低（P＜0.01）。經(jīng)過(guò)蘆薈多糖三個(gè)濃度組的預(yù)保護(hù)處理后，細(xì)胞中T-AOC顯著提高，與模型組相比表現(xiàn)為極顯著（P＜0.01），其中，100 μg/mL的蘆薈多糖組總抗氧化能力提升幅度最大，和VC組得到了近似結(jié)果。

結(jié)合2.3結(jié)果分析，各組細(xì)胞存活率的變化趨勢(shì)與2.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，其原理可能為蘆薈多糖在一定程度上提高了細(xì)胞中SOD、CAT、GPx等抗氧化酶活力，從而起到增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界氧化損傷的能力，減少細(xì)胞的死亡數(shù)量。

2.5 蘆薈多糖對(duì)細(xì)胞Keap1、Nrf2、NQO1和HO-1的mRNA表達(dá)水平的影響

表 2 HepG2細(xì)胞中SOD、CAT、GPx、T-AOC水平Table 2 SOD, CAT, GPx, T-AOC levels in HepG2 cells

核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2）是在機(jī)體抵御氧化應(yīng)激損傷時(shí)起重要作用的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì)位于其下游靶基因的表達(dá)起活化作用。在機(jī)體內(nèi)氧化還原處于平衡狀態(tài)時(shí)，Nrf2在胞漿中被Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelchlike ECH-associated protein 1，Keap1）的相互作用所結(jié)合，與cullin 3（CUL3）/RBX E3泛素連接酶形成復(fù)合體，最終導(dǎo)致Nrf2蛋白酶體降解[28]。當(dāng)平衡被打破后，氧化應(yīng)激導(dǎo)致Keap1構(gòu)象發(fā)生變化，Nrf2泛素化中止的同時(shí)半衰期延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中與抗氧化反應(yīng)原件（antioxident responsed element，ARE）結(jié)合[29]，并激活下游醌氧化還原酶1（Quinone oxidoreductase 1，NQO1）、血紅素加氧酶-1（Hemeoxygenase1，HO-1）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶[30]等Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá)。

Keap1/Nrf2是調(diào)節(jié)人體氧化失衡、降低炎癥反應(yīng)、提高線粒體功能[31]的重要通路，在細(xì)胞抗氧化損傷、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過(guò)程中起著必不可少的作用。通過(guò)qRT-PCR測(cè)定HepG2細(xì)胞中Keap1、Nrf2、NQO1和HO-1基因的表達(dá)量，可以進(jìn)一步明確蘆薈多糖對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3及圖5。

圖 5 HepG2細(xì)胞Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of Keap1, Nrf2, NQO1 and HO-1 in HepG2 cells

D-gal處理后，HepG2細(xì)胞Nrf2、NQO1、HO-1mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與D-gal模型組相比，蘆薈多糖處理后的細(xì)胞Keap1基因表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01），當(dāng)蘆薈多糖的質(zhì)量濃度為50、100 μg/mL時(shí)，Keap1表達(dá)與對(duì)照組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；細(xì)胞中Nrf2、NQO1和HO-1的mRNA表達(dá)水平與模型組相比均顯著提高（P＜0.05），并與蘆薈多糖濃度呈正相關(guān)，其中，蘆薈多糖高濃度組的Nrf2和NQO1表達(dá)水平顯著高于VC陽(yáng)性組（P＜0.05）。結(jié)果表明，D-gal會(huì)抑制Nrf2及下游蛋白的mRNA表達(dá)，而蘆薈多糖可以有效緩解D-gal造成的Nrf2抑制作用，減輕細(xì)胞氧化損傷程度。

表 3 HepG2細(xì)胞Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1的相對(duì)表達(dá)量Table 3 Relative expression of Keap1, Nrf2, NQO1 and HO-1 in HepG2 cells

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：蘆薈多糖在12.5～400 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)毒性作用；在D-gal濃度為200 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間24 h條件下，通過(guò)25、50、100 μg/mL三個(gè)濃度的蘆薈多糖預(yù)保護(hù)處理，可以不同程度地提高氧化損傷細(xì)胞的存活率，減少細(xì)胞MDA的生成量，提高細(xì)胞SOD、CAT、GPx活力和T-AOC水平，濃度依賴性地上調(diào)Nrf2、NQO1、HO-1基因的表達(dá)并降低Keap1的表達(dá)。由此可以推斷，蘆薈多糖能負(fù)向調(diào)節(jié)Keap1的表達(dá)以抑制Nrf2泛素化降解，提高NQO1、HO-1的轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶系活性并調(diào)控細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)，以達(dá)到減輕細(xì)胞氧化損傷程度、提高細(xì)胞抗氧化能力的效果。

本研究通過(guò)構(gòu)建D-gal誘導(dǎo)的體外損傷模型，證明了蘆薈多糖對(duì)氧化應(yīng)激損傷的HepG2細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低Keap1的表達(dá)水平從而抑制Keap1-CUL3/RBX E3復(fù)合體間的相互作用，激活Nrf2在細(xì)胞質(zhì)的合成和核積累，啟動(dòng)下游ARE調(diào)控的抗氧化代謝途徑中NQO1、HO-1等Ⅱ相解毒酶和包括SOD、CAT、GPx在內(nèi)的抗氧化酶系基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。Nrf2作為生物體抵御外源性刺激的核心轉(zhuǎn)錄因子，除了Keap1蛋白發(fā)揮主要調(diào)控功能外，其磷酸化活化與蛋白激酶C（protein Kinase C，PKC）、胞內(nèi)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等多種信號(hào)通路分子也存在相關(guān)性[32]。李建學(xué)[33]的研究結(jié)果表明，蘆薈多糖能促進(jìn)PKC蛋白的表達(dá)及磷酸化，引起絲裂原活化蛋白激酶反應(yīng)以促進(jìn)創(chuàng)面愈合。在細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激損傷的調(diào)節(jié)過(guò)程中，PKC介導(dǎo)的Nrf2磷酸化修飾在Nrf2核易位過(guò)程中起重要作用[34]，由此可以猜測(cè)，蘆薈多糖對(duì)Nrf2的激活效應(yīng)不僅體現(xiàn)在Keap1/Nrf2通路上，可能還涉及到PKC/Nrf2/HO-1等信號(hào)通路間的級(jí)聯(lián)調(diào)控作用。

目前關(guān)于蘆薈多糖的提取方式正不斷優(yōu)化，分離純化水平進(jìn)一步提升，蘆薈多糖在食品行業(yè)中的應(yīng)用有廣闊前景。本研究對(duì)于將蘆薈多糖作為功能性成分進(jìn)行食品新產(chǎn)品的研發(fā)，提供了一定的理論依據(jù)和參考價(jià)值。然而，功能因子在生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)途徑較為復(fù)雜，影響因素更多，因此對(duì)于蘆薈多糖在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制以及與信號(hào)通路間的調(diào)控關(guān)系，還需進(jìn)行更深入的研究。