王 晴，洪 葉，柳振宇，林長青

（延邊大學(xué)，醫(yī)學(xué)院，吉林延吉 133000）

甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）又名國老、甜草，為豆科甘草屬多年生草本植物[1]。目前，已經(jīng)從甘草中分離出大量的生物活性物質(zhì)，如香豆素類、揮發(fā)油類、皂苷類、多糖類等[2]。多糖是一類結(jié)構(gòu)多樣的大分子，由單糖殘基通過糖苷鍵相互連接而成的聚合物[3]。甘草多糖是一種酸性吡喃多糖，內(nèi)部有小氣泡狀孔洞。研究發(fā)現(xiàn)，甘草多糖因其具有抗氧化[4]，調(diào)節(jié)免疫活性[5]，抗菌[6]，抑制腫瘤生長[7]，抗炎[8]，生物制藥[9]等特性而備受關(guān)注。另有研究指出，甘草多糖可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，有助于緩解高血糖[10]。

1型糖尿?。═1DM）的發(fā)展受多重因素的影響，其中遺傳和環(huán)境因素最為主要[11]，在世界范圍內(nèi)，患病人數(shù)激增，已引起越來越多學(xué)者們的重視。T1DM的發(fā)病原因主要由于體內(nèi)胰島素分泌不足，不能將攝入的物質(zhì)及時分解，使得機(jī)體內(nèi)糖代謝失調(diào)，最終導(dǎo)致血糖升高，引發(fā)糖尿病。T1DM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，不僅是單一的異常血糖代謝疾病，更是全身代謝紊亂疾病，它已嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。近年來，隨著T1DM患者數(shù)量的增加，治療藥物也越來越多。但目前市面上的降糖藥物主要以西藥為主，西藥具有很多的副作用，長期服用會造成內(nèi)分泌失調(diào)，產(chǎn)生較強(qiáng)依賴性，甚至?xí)T發(fā)癌變等[12]，因此更加青睞對藥食兩用的中藥資源在降血糖方面的開發(fā)。

但目前有關(guān)甘草多糖的報道多集中在甘草多糖的提取工藝以及純化研究[13-14]，對于甘草多糖對降血糖的作用還鮮有報道。實(shí)驗(yàn)擬研究甘草多糖的抗氧化及降血糖作用，旨在開發(fā)出更多甘草產(chǎn)品，為臨床治療糖尿病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草 市售，產(chǎn)自甘肅，2020年9月收獲，規(guī)格為二等甘草；6周齡C57BL/6小鼠 雄性，無特定病原體（SPF）級，50只，體重（25±2）g，長春億斯實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證書：SCXK（吉）2018-0007。符合《延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理守則》，獲得延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)；DPPH自由基（DPPH·）清除能力檢測試劑盒、ABTS自由基（ABTS+·）清除能力檢測試劑盒、總膽固醇（Total Cholesterol, TC）、甘油三酯（Triglyceride, TG）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein, HDL-C）、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein, LDL-C）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ） 99.9%，美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍緩釋片 北京太洋藥業(yè)有限公司；超氧化物歧化酶（Super Oxide Dismutase, SOD）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（Catalase,CAT）檢測試劑盒、總谷胱甘肽 （Glutathione, GSH）檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化（Malondialdehyde, MDA）檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

HH-4型四孔數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇科析儀器有限公司；DHG-9070A型立式鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XL-10B型扣壓搖擺式粉碎機(jī)

杭州旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司； SuPerMax 3100型多功能酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甘草多糖提取及純化 將甘草烘干，粉碎后過40目篩，參照張光輝等[15]的方法并稍作改動，甘草:水比為1:20（g/mL），提取時間3 h，提取溫度80 ℃，浸提兩次，合并提取液，用85%乙醇醇沉24 h，取沉淀，用氯仿-正丁醇除去提取物中蛋白，凍干成粉，4 ℃保存?zhèn)溆?。取甘草多糖粗提物，用分子量?500 Da的透析袋透析24 h，過DEAE-52纖維素柱，分別用水、0.1 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaCl進(jìn)行洗脫，速度為1 mL/min，再過葡聚糖凝膠G-200柱子，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，速度為1 mL/min，旋蒸濃縮，并凍干成為甘草多糖。

1.2.2 甘草多糖的多糖含量測定 采用苯酚硫酸法[16]測定多糖含量，稱取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖10 mg于250 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，各以蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，加入1 mL 6%苯酚，5.0 mL濃硫酸，30 ℃水浴30 min，486 nm測吸光度，以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取樣品1 mg，溶于1 mL水中，按上述方法進(jìn)行測定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

1.2.3 甘草多糖的抗氧化性測定

1.2.3.1 DPPH·清除率的測定 根據(jù)王秋丹等[17]方法并稍作改動，稱取5 mg甘草多糖，溶于5 mL蒸餾水中，原液濃度為1000 μg/mL，將原液按梯度稀釋為800、400、200、100、50 μg/mL，以VC作為對照組，樣品組：取不同濃度樣品液1 mL于5 mL離心管中，并加入3 mL DPPH溶液，樣品對照組：樣品液加3 mL甲醇溶液吸光度為Aj，空白對照組：1 mL甲醇溶液加3 mL DPPH溶液吸光度為A0。3500 r/min離心20 min，在517 nm處測吸光度，按公式（1）進(jìn)行計算。

式中：Ai：樣品組吸光度；Aj：樣品對照組吸光度；A0：空白對照組吸光度。

1.2.3.2 ABTS+·清除率的測定 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的ABTS標(biāo)準(zhǔn)品180 mg，加入50 mL蒸餾水，加入33 mg過硫酸鉀，室溫避光放置12～24 h備用。用蒸餾水稀釋并調(diào)節(jié)至405 nm照射吸光度OD值調(diào)節(jié)在0.70±0.02范圍內(nèi)。

樣品溶液的制備：用蒸餾水配制1000、800、400、200、100、50 μg/mL的甘草多糖提取液、VC溶液作對照，取不同濃度樣液30 μL加入配好的ABTS溶液270 μL，酶標(biāo)儀于405 nm處測定吸光度值A(chǔ)i，等體積蒸餾水代替ABTS溶液做空白對照組Aj，蒸餾水替代樣品作為對照組A0。每個樣品濃度平行三次實(shí)驗(yàn)，取平均值。ABTS+·清除率按公式（2）進(jìn)行計算。

式中：Ai為30 μL甘草多糖溶液加入270 μL ABTS溶液于405 nm處的吸光度；Aj為30 μL甘草多糖溶液加入270 μL蒸餾水于405 nm處的吸光度；A0為30 μL蒸餾水加入270 μL ABTS溶液于405 nm處的吸光度。

1.2.4 甘草多糖的降血糖作用研究

1.2.4.1 動物分組及給藥 50只C57BL/6小鼠，分為5組，每組10只，正常組（灌胃蒸餾水200 mg/kg·BW），模型組（灌胃蒸餾水200 mg/kg·BW），甘草多糖低劑量組（甘草多糖200 mg/kg·BW），甘草多糖高劑量組（甘草多糖400 mg/kg·BW），陽性組（二甲雙胍200 mg/kg·BW），劑量設(shè)定通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)而定。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，除正常組外，其他組別連續(xù)5 d腹腔注射STZ（30 mg/kg·BW）建立T1DM模型，每天上午9:00進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃8周，實(shí)驗(yàn)期間對所有小鼠的體重進(jìn)行記錄，造模成功后每兩周對小鼠進(jìn)行隔夜禁食，禁食不禁水，次日采用尾尖取血測定空腹血糖值（FBG）并記錄。

1.2.4.2 小鼠口服糖耐量測定 參照王秋丹等[17]的方法進(jìn)行口服糖耐量（OGTT）實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)最后一天灌胃1 g/kg·BW葡萄糖溶液，分別于灌胃0、30、60、90 min使用尾尖取血測定小鼠血糖值。

1.2.5 小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，眼球取血，室溫靜置2 h，3000 r/min離心10 min，將離心后的上清液吸至1.5 mL離心管中，即為血清，按試劑盒要求取上血清行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1.2.6 小鼠SOD、GSH、CAT、MDA測定 小鼠解剖后，將肝臟取出并稱重，按肝臟：生理鹽水為1:3的比例制備成組織勻漿，并按試劑盒說明書依次加入反應(yīng)液，測定肝臟組織中SOD、GSH、CAT、MDA活性及含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和顯著性差異分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草多糖的含量

多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=10.1741x+0.0237（R2=0.9901），計算出多糖含量為690 mg/g。

2.2 甘草多糖對DPPH·、ABTS+·的清除能力

圖1為甘草多糖在不同濃度下對DPPH·、ABTS+·的清除能力，在50～1000 μg/mL范圍內(nèi)，甘草多糖對DPPH·、ABTS+·的清除能力呈現(xiàn)劑量依賴性升高，且在1000 μg/mL濃度下達(dá)到最高，對二者的清除能力分別為82.84%±0.80%，85.52%±2.27%，但均與VC有極顯著性差異（P＜0.01）。甘草多糖清除DPPH·和ABTS+·的IC50值為162.8 μg/mL和74.3 μg/mL，可見甘草多糖有著良好的抗氧化性。

圖 1 甘草多糖對DPPH·、ABTS+·的清除能力Fig.1 The scavenging capacity of Glycyrrhiza polysaccharide on DPPH·, ABTS+·

2.3 甘草多糖對小鼠體重、FBG的影響

體重減輕以及FBG升高是糖尿病的典型特征[18]。表1為T1DM小鼠體重，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，與正常組相比，模型組小鼠的體重顯著降低（P＜0.05），但經(jīng)高、低劑量的甘草多糖灌胃后的T1DM小鼠體重下降得到緩解，且高劑量組與低劑量組間無顯著性差異（P＞0.05），高劑量組與陽性組間無顯著性差異（P＞0.05）。表2為T1DM小鼠FBG，經(jīng)8周的灌胃后，各小鼠的FBG差異顯著（P＜0.05）。與模型組相比，灌胃了甘草多糖的T1DM小鼠的FBG顯著下降（P＜0.05），在第8周時，甘草多糖高劑量組與低劑量組和陽性組間均無顯著性差異（P＞0.05）。這表明，甘草多糖能夠緩解T1DM小鼠體重的下降，并控制其FBG的升高，具有一定的治療糖尿病的潛力。

表 1 T1DM小鼠體重（g）Table 1 Body weight of T1DM rats (g)

表 2 T1DM小鼠空腹血糖值（mmol/L）Table 2 Fasting blood glucose of T1DM rats (mmol/L)

2.4 甘草多糖對T1DM小鼠OGTT的影響

OGTT能夠反映機(jī)體對葡萄糖的耐受能力。由圖2所示，在灌胃葡萄糖后，小鼠血糖含量在30 min內(nèi)急劇升高，在30 min時血糖均達(dá)到了最高值，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，且高劑量組的糖耐量極顯著優(yōu)于模型組（P＜0.01）。經(jīng)甘草多糖灌胃后，可能調(diào)節(jié)了T1DM小鼠體內(nèi)對葡萄糖的攝取及利用，從而降低了其FBG水平，提高了機(jī)體的OGTT水平?？梢姡什荻嗵悄軌蛱岣逿1DM小鼠對葡萄糖的耐受能力。

圖 2 甘草多糖對T1DM小鼠OGTT的影響Fig.2 Effect of Glycyrrhiza polysaccharide on OGTT of T1DM rats

2.5 甘草多糖對小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響

機(jī)體中TC、TG、HDL-C、LDL-C能夠反映機(jī)體對脂代謝的調(diào)控能力。圖3為甘草多糖對T1DM小鼠血脂水平的影響，與正常組相比，模型組中TC、TG、LDL-C水平極顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平極顯著降低（P＜0.01），甘草多糖高劑量組TC、TG、HDL-C、LDL-C分別為2.79±0.36、0.98±0.12、1.28±0.23、1.67±0.29 mmol/L，可見經(jīng)其治療后能夠極顯著降低TC、TG、LDL-C的水平（P＜0.01），極顯著提高HDL-C的水平（P＜0.01）。這可能由于甘草多糖在體內(nèi)水解吸收后，參與了T1DM小鼠的脂代謝反應(yīng)，從而改善了異常血脂水平。由此能夠說明甘草多糖具有調(diào)節(jié)脂代謝的作用。

2.6 甘草多糖對T1DM小鼠氧化指標(biāo)的影響

在上述實(shí)驗(yàn)中已證明甘草多糖在體外具有良好的抗氧化性，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中測定其是否具有調(diào)節(jié)相關(guān)氧化酶的作用。SOD是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員，GSH是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，CAT促使過氧化氫分解為分子氧和水，使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，MDA是一種由脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物[19]。圖4為甘草多糖對T1DM小鼠SOD、GSH、CAT、MDA水平的影響，結(jié)果顯示，模型組中SOD、GSH、CAT、MDA水平分別為224.3 U/mg、121.5 μmol/g、50.2 U/mg、16.4 nmol/mgprot，與正常組相比均有極顯著性差異（P＜0.01），經(jīng)甘草多糖高劑量組治療后，SOD、GSH、CAT、MDA水平為425.4±16.37 U·mg-1、169.3±13.28 μmol·g-1、61.6±3.16 U·mg-1、7.5±0.83 nmol/mg prot，與模型組相比有極顯著性差異（P＜0.01），且趨于陽性組。這是由于T1DM小鼠體內(nèi)不能分泌足夠的胰島素，間接導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)酶水平發(fā)生顯著變化，經(jīng)甘草多糖治療后可有效改善這些指標(biāo)的水平。由此證明，甘草多糖不僅在體外具有抗氧化作用，在體內(nèi)也具有調(diào)節(jié)抗氧化酶的作用。由此推測，甘草多糖可能是通過改善T1DM小鼠機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平從而起到降血糖作用。

圖 3 甘草多糖對T1DM小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響Fig.3 The effect of Glycyrrhiza polysaccharide on TC, TG,HDL-C, LDL-C in T1DM mice

圖 4 甘草多糖對T1DM小鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影響Fig.4 The effect of Glycyrrhiza polysaccharide on SOD、GSH、CAT、MDA in T1DM mice

3 討論與結(jié)論

正常情況下，機(jī)體氧化還原系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激、病理狀態(tài)時，會產(chǎn)生·OH、DPPH·等強(qiáng)氧化自由基[20]。植物多糖可通過直接或間接清除自由基，或是提高抗氧化酶活性或降低氧化酶活性起到抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)中，顯示在甘草多糖清除DPPH·和ABTS+·的IC50值分別為162.8 和74.3 μg/mL?？梢姡什荻嗵窃隗w外具有良好的抗氧化性。

本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步研究了其對T1DM小鼠的降血糖作用以及體內(nèi)抗氧化性。糖尿病的典型癥狀為“三多一少”，對葡萄糖的耐受能力減弱，因此選取體重、FBG以及OGTT作為基礎(chǔ)測定指標(biāo)，結(jié)果顯示，經(jīng)甘草多糖治療后的T1DM小鼠體重下降緩慢，F(xiàn)BG也明顯下降，OGTT有所提高。胰島素代謝失調(diào)會引發(fā)血脂異常，體內(nèi)胰島素的缺乏導(dǎo)致攝入的脂肪等不能被利用，使得機(jī)體內(nèi)脂肪加速分解，脂肪分解所產(chǎn)生的游離脂肪酸（FFA）進(jìn)入肝臟生成TG和酮體，會間接導(dǎo)致TC、HDL-C、LDL-C發(fā)生變化，最終導(dǎo)致體內(nèi)血脂異常[21-22]。T1DM會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)異常脂代謝情況的發(fā)生[23]，其中甘油三酯水平顯著升高為1型糖尿病最為突出的脂代謝紊亂表現(xiàn)[24]。結(jié)果顯示，甘草多糖能夠改善T1DM小鼠的異常脂代謝情況。其原因可能是T1DM小鼠對葡萄糖利用失調(diào)，脂肪分解增加，從而產(chǎn)生了大量的游離脂肪酸，組織吸收脂肪酸的能力降低，F(xiàn)FA大量釋放到血液和肝臟中[25]，導(dǎo)致TC、TG、LDL-C的含量增多。糖尿病患者機(jī)體內(nèi)氧自由基含量增多，過多的氧自由基與脂質(zhì)相互作用產(chǎn)生過氧化反應(yīng)生成MDA。GSH在體內(nèi)既是重要的抗氧化劑又是自由基清除劑，能夠與體內(nèi)過多的自由基結(jié)合，從而將過多的有害物質(zhì)清除，排泄出體外[26]。CAT與SOD在機(jī)體中具有較強(qiáng)的抗氧化能力，在體內(nèi)能夠抑制氧自由基的生成，能夠減少氧自由基對細(xì)胞造成的傷害，并且能夠降低MDA的生成量[27]。在本試驗(yàn)中，與正常對照組相比，T1DM小鼠血清的MDA濃度極顯著增加（P＜0.01），而SOD、GSH、CAT濃度極顯著降低（P＜0.01），表明T1DM小鼠出現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)。與正常對照組小鼠相比，甘草多糖治療后能夠顯著抑制這些標(biāo)志物的變化。

本文結(jié)果說明甘草多糖具有良好的抗氧化活性以及降血糖作用，認(rèn)為其對1型糖尿病的降血糖作用可能是通過改善異常脂代謝以及機(jī)體氧化應(yīng)激從而發(fā)揮作用，該研究可為甘草多糖在1型糖尿病的治療方面提供新的思路，后續(xù)可對甘草多糖的降血糖機(jī)制以及在細(xì)胞層面進(jìn)行深入研究。