龔志強(qiáng)，夏雨弘，韓 沙，黃艷紅，霍 宇，陳曉蘭，蒙田秀，楊立芳,

（1.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530008；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西南寧 530222）

非酒精性脂肪性肝?。∟onalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的獲得性代謝應(yīng)激性肝損傷[1]。飲食和生活方式的改變造成糖尿病、肥胖癥等代謝相關(guān)疾病持續(xù)流行，NAFLD已發(fā)展成為危害人類健康的世界性衛(wèi)生問題[2]，影響了全球約24%的人口[3]。NAFLD的治療包括非藥物治療（生活方式改變）和藥物治療兩種，前者為治療NAFLD的基礎(chǔ)[4]，藥物治療主要包括胰島素增敏劑、降脂藥、保肝抗炎藥物等。但由于NAFLD常伴隨代謝異常，西藥的單靶點(diǎn)治療往往得不到很好的療效，目前尚沒有一款FDA批準(zhǔn)的NAFLD藥物，NAFLD可持續(xù)惡化為肝硬化及肝癌，進(jìn)而對社會公共醫(yī)療資源造成重大負(fù)擔(dān)[5]。

白鶴靈芝為爵床科白鶴靈芝屬植物Rhinacanthus nasutus（L.）Kurz的干燥枝、葉，別名癬草[6]，主產(chǎn)于云、桂、貴等地深山，是壯族等少數(shù)民族秘傳的珍貴藥材，壯藥名為Go’gyak（棵絳），壯藥中歸類清熱毒藥，主治能晗能累（濕疹）、痂（疥癬）、額哈（毒蛇咬傷）等，具有清熱疏肝、殺蟲止癢、收斂止血等功效[7]。白鶴靈芝中化學(xué)成分復(fù)雜，含有萘醌及其苷類、黃酮類、香豆素類及羧酸類，包含20余種類胡桃醌酯類衍生物的萘醌，其中含量較高的為rhinacanthin-C，是研究報道的主要活性物質(zhì)[8-9]。白鶴靈芝在壯族少數(shù)民族地區(qū)有著悠久的用藥歷史，具有清熱疏肝的作用，廣泛用于肝炎的治療，蒙田秀等[10-11]研究肯定了白鶴靈芝不同提取部位對高脂飲食誘導(dǎo)的鵪鶉高血脂癥及動脈粥樣硬化有較好的保護(hù)作用，還可以有效降低腎上腺素所致的小鼠高血糖；Supaporn等[12]研究表明白鶴靈芝葉提取物對改善HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠葡萄糖和脂質(zhì)代謝受損有很好的調(diào)節(jié)作用；Muhammad等[13]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)白鶴靈芝富含萘醌的提取物（RRE）對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，其中，rhinacanthin-C可通過抑制α-葡萄糖苷酶活性而達(dá)到治療糖尿病的作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明RRE可顯著改善大鼠血脂、肝腎生化指標(biāo)，對糖尿病大鼠胰島有修復(fù)功能，可作為治療糖尿病的有效天然藥物[14]。中醫(yī)藥防治高脂血癥等糖、脂代謝疾病具有整體調(diào)整和多環(huán)節(jié)綜合治療的優(yōu)勢。這類疾病臨床上多見與“肝”相關(guān)的證候，可用多種“疏肝理氣、調(diào)肝化濁”等中草藥進(jìn)行防治[15]。較多研究已表明白鶴靈芝提取物可有效降血脂、降血糖及心血管保護(hù)作用，而其作用的確切物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不明確。

本文通過反復(fù)柱色譜層析法富集白鶴靈芝藥材提取物中的總萘醌（RRE）成分，以高脂飼料（HFD）誘導(dǎo)建立NAFLD小鼠模型，從體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)研究白鶴靈芝總萘醌的體內(nèi)降血脂、改善脂質(zhì)沉積的作用，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)對RRE治療NAFLD的有效活性物質(zhì)及作用機(jī)制進(jìn)行探究，為進(jìn)一步闡明白鶴靈芝降血脂、保護(hù)肝臟的有效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級昆明（KM）雄性小鼠 60只，體重（25±2 g），廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中學(xué)，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK（桂）2014-0002；小鼠基礎(chǔ)飼料（Standard Diet，STD） 北京科澳協(xié)力飼料有限公司（批號：21037003）；小鼠刨花墊料 江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司（批號：21030307）；D12492小鼠高脂飼料（High Fat Diet，HFD：60%脂肪、20%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)） 江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司（批號：21030116）；T-CHO、TG、HDL-C、LDLC、AST、ALT、AKP測定試驗(yàn)試劑盒 南京建成生物工程研究所；熊果酸（批號：C6213-25）、拉帕醇（批號：201206，含量＞98%） 上海阿拉丁生化科技有限公司；白鶴靈芝素-C（自制，含量＞98%，經(jīng)NMR鑒定，Anna Sendl et al.，1996）、鋅粉（批號：20201019）、亞甲基藍(lán)（批號：20200113） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；柱層析硅膠（批號：0170245） 青島海洋化工有限公司；磷酸、二氯甲烷、乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯等 其余常規(guī)試劑均為分析純（AR），西隴化工；白鶴靈芝藥材 采收于廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)謝麗莎教授鑒定為爵床科白鶴靈芝Rhinacanthus nasutus（L.） Kurz，藥材標(biāo)本保存于廣西中醫(yī)藥大學(xué)會展中心標(biāo)本館（編號：

20210305001）。

ALPHA 1-4 LSC冷凍干燥機(jī) 德國Martin Christ公司；Adventurer系列電子天平 美國奧豪斯公司；EYELA N1210BV旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化；Agilent Cary 60紫外可見分光光度計(jì) 美國安捷倫科技有限公司；ZHJH-C11068型超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；Olympus CKX41型倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；Epoch型全波長酶標(biāo)儀 美國Bio Tek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白鶴靈芝總萘醌（RRE）的制備及含量測定白鶴靈芝藥材粗粉（6.0 kg）經(jīng)95%乙醇回流提取，減壓低溫濃縮，石油醚、乙酸乙酯依次萃取，乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠色譜柱色譜分離，以二氯甲烷：甲醇（100:1→1:1）梯度洗脫，通過薄層色譜（TLC），以無色亞甲藍(lán)顯色劑檢識萘醌類成分并富集，結(jié)果顯示：萘醌類成分主富集于50:1→25:1的流分，富集此流分，減壓濃縮得RRE浸膏（21.4 g）。以拉帕醇甲醇溶液為對照品[16]，紫外分光光度法測定樣品在251 nm波長的吸光度，以進(jìn)樣濃度（Y）和吸光度（X）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=9.6694X-0.0736（R2=0.9996），精密稱取RRE，用甲醇定容，稀釋至一定濃度后，于251 nm波長處測量其吸光度值，重復(fù)測定6次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算RRE浸膏中萘醌含量為452.6 mg/g。RRE浸膏經(jīng)冷凍干燥碾磨，制備成羥甲基纖維素鈉懸浮儲備液，儲備液濃度為（10 mg/mL），備用。

1.2.2 NAFLD小鼠造模及分組給藥 NAFLD小鼠模型建立[17-19]：雄性KM小鼠60只，體重25±2 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，飼養(yǎng)溫度25±1 ℃，相對濕度60%±5%，光照晝夜各12 h，隨機(jī)分為6組，每組10只，空白組實(shí)驗(yàn)全程STD喂養(yǎng)，剩余50只小鼠給予HFD喂養(yǎng)。HFD持續(xù)喂養(yǎng)6周后，禁食不禁水12 h，斷尾尖取血，分離血清，測定各小鼠血脂水平，與空白組血脂水平比較，若P＜0.05或P＜0.01，則NAFLD造模成功。將50只NAFLD小鼠按TC水平隨機(jī)分成5組，分別為模型組（n=10）、熊果酸組（n=10）、RRE高、中、低劑量組（n=10）。給藥方法：RRE高（300 mg/kg）、中（200 mg/kg）、低劑量（100 mg/kg），熊果酸組（200 mg/kg），藥物均配制成適當(dāng)濃度的羥甲基纖維素鈉懸浮液以灌胃；各組小鼠均按照10 mL/kg的體積灌胃，即灌胃RRE高（30 mg/mL）、中（20 mg/mL）、低劑量（10 mg/mL），熊果酸（20 mg/mL）。每天相同時間灌胃給藥一次，空白組和模型組給予等劑量的蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥6周，每周稱一次體重。實(shí)驗(yàn)通過動物倫理委員會審查，嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》執(zhí)行。

1.2.3 指標(biāo)測定 灌胃給藥6周后，實(shí)驗(yàn)動物不禁水禁食12 h，摘眼球取血后，處死小鼠并進(jìn)行解剖，離心分離血清（3000 r/min，4 ℃），采用酶標(biāo)儀按照試劑盒中的方法測定血清中的TC、TG、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、AKP水平。剝離肝臟并稱重，計(jì)算肝臟系數(shù)后。肝臟系數(shù)計(jì)算公式為：

1.2.4 組織病理學(xué)分析 小鼠處死后，分離肝組織后拍照留存，取一部分肝臟置于10%甲醛組織固定液中固定，24 h后石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色；另取一部分肝臟，采用OTC（optimal cutting temperature compound）包埋，冰凍切片，油紅O進(jìn)行染色；顯微鏡下觀察各切片肝臟組織病理情況以及肝臟脂肪顆粒沉積情況。

1.2.5 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的技術(shù)預(yù)測作用機(jī)制 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺（TCMSP）及OMIM、Drug Bank及Dig See在線數(shù)據(jù)庫檢索白鶴靈芝與NAFLD病變相關(guān)靶點(diǎn)富集相互關(guān)聯(lián)，應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建交集基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交匯（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，獲取核心預(yù)測靶點(diǎn)。采用Autodock 4.2.6分子對接軟件，可視化軟件采用Autodocktools-1.5.6，在蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫（www.rcsb.org）中獲取相關(guān)靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行可視化分子對接。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入；采用SPSS 20.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述；方差齊時用方差分析進(jìn)行t檢驗(yàn)組間比較，方差若不齊則用秩和檢驗(yàn)作以分析；檢驗(yàn)方法采用One-way ANOVA分析和Dunnett-t多組間比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 RRE對實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟系數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)過程中，各組均無小鼠死亡，空白組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)順滑；模型組小鼠多食少動，毛發(fā)略微稀疏，精神倦??；熊果酸組及RRE給藥組與模型組比較，精神狀態(tài)明顯改善。RRE干預(yù)后對小鼠體重及肝臟系數(shù)影響如表1所示，與空白對照小鼠相比，模型組小鼠體重明顯增加，具有極顯著差異（P＜0.01）；與模型組相比，熊果酸組以及白鶴靈芝RRE高、中、低劑量組小鼠體重均有顯著性差異（P＜0.05）。中劑量組顯著降低小鼠肝臟重量及肝臟系數(shù)（P＜0.05）；高劑量極顯著降低小鼠肝臟重量及肝臟系數(shù)（P＜0.01）。綜上，白鶴靈芝RRE高、中劑量組均能顯著降低NAFLD小鼠體重及肝臟重量（P＜0.05），并降低小鼠的肝臟系數(shù)。

表 1 白鶴靈芝總萘醌對NAFLD小鼠肝臟系數(shù)的影響（n=10）Table 1 Effects of RRE on liver coefficient of NAFLD mice (n=10)

2.2 RRE對實(shí)驗(yàn)小鼠血脂水平的影響

血脂是血漿中脂類物質(zhì)的總稱，包括甘油三脂和總膽固醇，為機(jī)體供應(yīng)能量和儲存能量的同時，亦可維持生物膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。血脂四項(xiàng)包括TC、TG、HDL-C和LDL-C，血脂異常及肝細(xì)胞脂肪變性與NAFLD病理進(jìn)程緊密相關(guān)[20]。經(jīng)過6周HFD喂飼后，與空白組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均極顯著性升高（P＜0.01），HDL-C含量極顯著性下降（P＜0.01），表明HFD飲食成功誘導(dǎo)小鼠高脂血癥。

高脂血癥小鼠經(jīng)RRE灌胃給藥后，RRE對NAFLD小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響結(jié)果如圖1所示，與模型組相比，熊果酸組、各劑量組RRE均不同程度地降低了NAFLD小鼠血清中TC、TG、LDLC水平，升高HDL-C水平含量，改善NAFLD小鼠高血脂水平。其中，RRE高、中劑量組具有極顯著性降低TC、TG水平（P＜0.01）；熊果酸組、RRE高、中、低劑量組均能極顯著升高HDL-C、降低LDL-C含量（P＜0.01）。其中，血清中TC、TG、LDL-C含量與灌胃RRE劑量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，HDL-C含量與灌胃RRE劑量呈現(xiàn)正相關(guān)。

圖 1 白鶴靈芝總萘醌對NAFLD小鼠血脂TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影響（n=10）Fig.1 Effects of RRE on the levels of TC, TG, HDL-C and LDL-C in blood lipids of NAFLD mice (n=10)

2.3 RRE對實(shí)驗(yàn)小鼠AST、ALT、AKP的影響

慢性肝膽系統(tǒng)疾病中，血液中ALT和AST活性測定是肝功能實(shí)驗(yàn)所必須的重要指標(biāo)，ALT、AST一般都存在肝臟細(xì)胞中，在肝細(xì)胞受到損傷時，轉(zhuǎn)氨酶代謝異常，肝細(xì)胞中ALT和AST兩種酶進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中ALT和AST水平升高[21]。AKP是一種磷酸單酯酶，臨床上主要用于肝癌、肝硬化等肝膽系統(tǒng)疾病的診斷[22]。因此，ALT、AST和AKP三者的水平可以反映肝細(xì)胞的受損程度。經(jīng)過6周HFD喂飼后，與空白組相比，模型組血清中AST、ALT、AKP含量極顯著性升高（P＜0.01），表明HFD飲食成功誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞受損。RRE給藥后對NAFLD小鼠血清中AST、ALT、AKP含量測測定結(jié)果如圖2所示，與模型組比較，熊果酸組、RRE各劑量組小鼠血清AST、ALT、AKP水平均呈現(xiàn)下降趨勢，RRE高、中劑量組均能顯著降低NAFLD小鼠血清中AST、ALT、AKP水平（P＜0.05或P＜0.01），且效果均優(yōu)于熊果酸組；RRE低劑量組可極顯著降低AST水平（P＜0.01），下調(diào)ALT、AKP水平，但無顯著性差異（P＞0.05）。

圖 2 白鶴靈芝總萘醌對NAFLD小鼠血清中ALT、AST、AKP水平的影響（n=10）Fig.2 Effects of RRE on the levels of AST、ALT、AKP in blood lipids of NAFLD mice (n=10)

2.4 RRE對小鼠HFD造模后肝臟脂質(zhì)堆積的影響

HFD造模后，經(jīng)肝臟組織觀察發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠肝臟顏色呈鮮紅色，表面具有光滑，并彈性好較好，質(zhì)地柔軟，沒有出血點(diǎn)；HFD造模后的小鼠的肝臟偏大，顏色發(fā)白，表面有明顯的白色點(diǎn)狀，粗糙脂肪粒，肝組織彈性一般，脂肪堆積程度較重，并存在出血點(diǎn)；經(jīng)高、中、低劑量的RRE作用后，NFLAD小鼠肝臟發(fā)黃以及油膩感等癥狀得到不同程度地改善，表面光滑度增加，表面白色點(diǎn)狀物減少，出血點(diǎn)消失，小鼠肝臟病理變化得到顯著逆轉(zhuǎn)（結(jié)果見圖3）。

圖 3 RRE對NAFLD小鼠肝臟病理影響Fig.3 Effects of RRE on representative picture of liver change in NAFLD mice

2.5 RRE對實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織病理學(xué)觀察

肝臟組織經(jīng)HE染色及油紅O染色后的檢測結(jié)果如圖4所示。肝臟組織經(jīng)HE染色后，空白組小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，邊界清晰，排列整齊，細(xì)胞胞質(zhì)未見溶解和空泡；模型組小鼠肝臟組織排列混亂，細(xì)胞間隙含有大量脂肪空泡，邊界模糊，大量細(xì)胞核仁發(fā)生偏移和破裂，胞質(zhì)有溶解現(xiàn)象，可見較大的脂質(zhì)液滴，呈現(xiàn)顯著的細(xì)胞炎性損傷及肝臟脂肪病變；RRE高、中、低劑量組小鼠肝臟組織脂肪空泡較模型組明顯減少，核仁偏移明顯改善，邊界較模型組清晰，細(xì)胞核萎縮或破裂等現(xiàn)象明顯減少，顯著降低了小鼠肝臟的脂肪變性程度。油紅O染色觀察結(jié)果同樣顯示，給予RRE高、中、低劑量處理后，其肝臟組織中的脂肪油滴顯著減少，細(xì)胞形態(tài)得到明顯改善。上述檢測結(jié)果表明，RRE可有效改善NAFLD小鼠肝臟病理病變、減少脂肪堆積，具有改善非酒精性脂肪肝的功效。

2.6 基于網(wǎng)絡(luò)藥理預(yù)測白鶴靈芝防治NALFD的作用靶點(diǎn)

基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺及OMIM、Drug Bank 及Dig See在線數(shù)據(jù)庫，檢索藥物“白鶴靈芝”、“白鶴靈芝素”、“Rhinacanthus nasutus”及“HFD”、“NAFLD”等相關(guān)關(guān)鍵詞進(jìn)行藥物和疾病作用靶點(diǎn)富集，借助DAVID數(shù)據(jù)庫對交集基因進(jìn)行GO功能注釋，及OmicShare Tools在線作圖平臺實(shí)現(xiàn)富集結(jié)果可視化，結(jié)果顯示，白鶴靈芝作用靶點(diǎn)與NAFLD病變相關(guān)靶點(diǎn)交集基因經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)圖連線，SREBP-1c、SIRT1、NF-κB經(jīng)處于核心位置，結(jié)果圖5、圖6所示。

圖 4 白鶴靈芝總萘醌對NAFLD小鼠肝臟組織病理組織影響Fig.4 Effect of RRE on liver histopathology of NAFLD mice

2.7 基于分子對接技術(shù)篩選白鶴靈芝總萘醌防治NALFD的活性分子

白鶴靈芝萘醌為主要報道的活性分子[23-25]，從RRE中提取分離鑒定了5個萘醌類化合物rhinacanthin-B、rhinacanthin-C、rhinacanthin-D、rhinacanthin-H、rhinacanthin-N和1個苯丙素類化合物Ficucaricone B，其中對白鶴靈芝素-C研究多與心血管疾病相關(guān)[26-28]，通過分子對接技術(shù)分別將上述6個化合物與AMPKα和SIRT1靶蛋白進(jìn)行分子對接，篩選RRE中分離的單體化合物對相關(guān)預(yù)測靶點(diǎn)的分子作用。蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫中獲取預(yù)測蛋白的晶體結(jié)構(gòu)AMPKα（編號：2ya3）、SIRT1（編號：5btr）。分子對接結(jié)果表明rhinacanthin-C和2ya3的結(jié)合能為-5.63 kJ/mol，rhinacanthin-C能與AMPKα和SIRT1的表面空腔結(jié)合，但暴露在蛋白質(zhì)外的連接部分不同，rhinacanthin-C與AMPKα的3D結(jié)合如圖7所示，His397與苯環(huán)之間的N-H-π相互作用，同時rhinacanthin-C上的羰基和萘環(huán)上的羥基與Arg401之間的氫鍵相互作用都在結(jié)合親和力中起主要作用。同時色酮母核和酯基與鏈1上的Lle400、Val549，鏈2上Lle246、Ser245、Ala243、Lle272之間存在溶劑接觸，對接結(jié)果如圖7所示。此外，苯環(huán)位于Lle543、Thr548等形成的疏水孔中，表明疏水相互作用可能也是一個重要因素。rhinacanthin-C與SIRT1的3D結(jié)合如圖8所示，rhinacanthin-C上的羰基與Phe414之間存在氫鍵相互作用，在結(jié)合親和力中起主要作用。然而，由于烯烴長鏈的內(nèi)部折疊，其疏水性降低了氫鍵的作用，羥基被包裹在分子內(nèi)，從而阻止羥基形成氫鍵。此外，rhinacanthin-C分子還和Lle223、Leu202、Lle210、Leu206、Thr209、Leu215、Pro211、Gin294、Lys444存在溶劑接觸，同時萘環(huán)位于由Arg446、Val445、Pro212、Gly415等形成的疏水孔中，表明疏水相互作用可能也是一個重要因素。

圖 5 NALFD干預(yù)的信號通路功能富集圖Fig.5 Signal pathway function enrichment map of NAFLD

圖 6 白鶴靈芝作用靶點(diǎn)與NAFLD病變相關(guān)靶點(diǎn)交集基因經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 PPI network diagram of target intersection between Rhinacanthus nasutus action target and NAFLD lesion related target

圖 7 AMPKα（2ya3）蛋白與rhinacanthin-C分子表面的3D結(jié)合模型Fig.7 3D binding model of rhinacanthin-C on the molecular surface of AMPKα (2ya3)

圖 8 SIRT1（5btr）蛋白與rhinacanthin-C分子表面的3D結(jié)合模型Fig.8 3D binding model of rhinacanthin-C on the molecular surface of SIRT1 (5btr)

3 討論

3.1 RRE對HFD誘導(dǎo)小鼠血清血脂四項(xiàng)水平的影響

多分子途徑研究揭示了NAFLD患者與高階病變NASH疾病的機(jī)制及其臨床表現(xiàn)具有高度的異質(zhì)性，其中游離脂肪酸是NAFLD發(fā)病機(jī)制的核心[29]。HFD誘導(dǎo)的模型動物常伴隨體重、血清TC、TG、LDL-C、HDL-C等生化指標(biāo)改變，其機(jī)制可能是進(jìn)食高脂營養(yǎng)食物經(jīng)消化吸收后形成游離脂肪酸在肝內(nèi)循環(huán)形成TG，TG可以作為VLDL進(jìn)入血液或儲存在脂滴中，當(dāng)脂肪酸供應(yīng)過量時可作為脂肪毒性物質(zhì)產(chǎn)生的底物引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)激和肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致游離脂肪酸氧化和VLDL減少，減少TG運(yùn)出肝細(xì)胞，導(dǎo)致TG在肝細(xì)胞基質(zhì)代謝過程中有毒脂質(zhì)沉積，加重肝臟的脂肪變性，誘發(fā)NAFLD的病理形成[30]。因此檢測血脂四項(xiàng)的水平，可作為評價NAFLD病理進(jìn)程改善的重要指標(biāo)。RRE灌胃給藥后，血清中TC、TG、LDL-C含量與灌胃RRE劑量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，HDL-C含量與灌胃RRE劑量呈現(xiàn)正相關(guān)，因此RRE可通過改善HFD小鼠高血脂癥，減少血液中的游離脂肪酸，減少LDL-C含量，升高HDL-C水平，延緩NAFLD的病理進(jìn)程。

3.2 RRE對HFD誘導(dǎo)小鼠肝臟指標(biāo)的影響

在臨床上，肝臟脂肪變性是NAFLD的標(biāo)志性特征，同時伴隨血清中AST、ALT、AKP的含量升高[31]。AST分布于肝細(xì)胞漿和線粒體中，ALT主要分布與肝細(xì)胞漿，如果肝細(xì)胞壞死，血清中ALT升高提示肝細(xì)胞膜損傷，AST升高則提示肝細(xì)胞損傷到了細(xì)胞器水平。因此，大多數(shù)情況下AST、ALT升高程度與肝細(xì)胞受損程度相一致，是目前最常用的肝功能檢測指標(biāo)[32]。AST/ALT的比值也能反映肝炎患者的病理進(jìn)程，HFD誘導(dǎo)的小鼠模型組中與空白組比較，AST增加了107.3%、ALT上升了130.2%，AST/ALT=1.12，結(jié)果表明小鼠成功誘導(dǎo)產(chǎn)生中度、重度慢性肝炎，肝細(xì)胞線粒體也受到了嚴(yán)重破壞，AST從線粒體和胞漿內(nèi)釋放。經(jīng)過灌胃不同劑量的RRE的小鼠，均出現(xiàn)抑制血清中AST、ALT、AKP含量上升的現(xiàn)象，而且下降趨勢和劑量呈正性相關(guān)，表明RRE對NAFLD肝臟的損傷有良好的保護(hù)作用。

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接對RRE活性物質(zhì)及作用機(jī)制的預(yù)測

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過疾病與藥物共同靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的建立與分析，預(yù)測物質(zhì)基礎(chǔ)與關(guān)鍵靶點(diǎn)，闡釋中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，本文基于TCMSP等在線數(shù)據(jù)庫檢索藥物與疾病關(guān)鍵詞，對白鶴靈芝防治肝臟疾病的作用靶點(diǎn)進(jìn)行富集和預(yù)測，其中AMPKα、SIRT1與脂質(zhì)代謝異常的靶點(diǎn)以及NF-κB炎性損傷相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)被富集。AMPK是機(jī)體能量代謝重要的通路，SIRT1通過參與脂質(zhì)和碳水化合物代謝在各種代謝組織中發(fā)揮作用，包括肝臟、脂肪組織、骨骼肌等，AMPK-SIRT1-NF-κB是與能量代謝密切相關(guān)的一條信號通路，通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)受到機(jī)體能量代謝改變的影響[33]。肝臟細(xì)胞中AMPK-SIRT1介導(dǎo)的能量代謝與NF-κB介導(dǎo)的炎癥因子相互激活，肝臟炎癥損傷NF-κB上調(diào)可激活SIRT1介導(dǎo)的脂質(zhì)合成，造成脂質(zhì)沉積和下游SREBP-1c脂代謝紊亂，在NAFLD的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過分子對接技術(shù)對白鶴靈芝中分離的6個萘醌類化合物分別與AMPKα和SIRT1靶蛋白進(jìn)行分子對接，其中rhinacanthin-C結(jié)合能最強(qiáng)，分別為-5.63 kJ/mL和-3.93 kJ/moL，表明rhinacanthin-C可能基于AMPKSREBP1c-SIRT1信號通路，參與調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)合成改善NAFLD脂質(zhì)代謝紊亂發(fā)揮降血脂減少脂肪堆積和保護(hù)肝臟的作用。

4 結(jié)論

本研究通過HFD誘導(dǎo)小鼠建立NAFLD小鼠模型，對白鶴靈芝總萘醌提取物的降血脂、降血糖、減少脂質(zhì)沉積和改善脂肪肝的作用進(jìn)行評價。結(jié)果表明，RRE高、中劑量組能顯著降低NAFLD小鼠血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT、AKP水平，升高HDL-C水平；減少肝臟脂肪顆粒，減少炎癥損傷，改善肝組織病理學(xué)，緩解NAFLD小鼠肝臟組織損傷。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法將NAFLD疾病網(wǎng)絡(luò)與白鶴靈芝研究報道進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)整合，由尋找單一靶點(diǎn)轉(zhuǎn)向綜合網(wǎng)絡(luò)分析，預(yù)測了AMPK-SREBP1c-SIRT1信號通路可能是白鶴靈芝防治NAFLD的作用靶點(diǎn)之一，并采用分子對接技術(shù)篩選了白鶴靈芝素-C可能為白鶴靈芝防治NAFLD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究為闡明壯藥白鶴靈芝改善NAFLD的作用及有效活性物質(zhì)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為尋找治療NAFLD疾病的先導(dǎo)化合物，開發(fā)和利用好少數(shù)民族地區(qū)特色壯藥資源提供參考依據(jù)。