褚佳豪，居瑞軍，樊遠紅，吳發(fā)亮，彭效明，楊思敏

（北京石油化工學院，恩澤生物質(zhì)精細化工北京市重點實驗室，北京 102617）

肝臟是人體代謝酒精的關(guān)鍵器官。酒精性肝?。ˋlcoholic liver disease，ALD）是長期大量飲酒引起的一種肝臟疾病，每年導致約330萬的死亡人數(shù)，占全球疾病負擔的5.1%，并且是60多種主要疾病的風險因素，在全球疾病和殘疾風險因素中排名第三[1]，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)一個重要的健康和經(jīng)濟問題。盡管ALD具有嚴重的有害影響，但在治療方面進展甚微。因此，為了改善酒精性肝損傷，人們嘗試使用抗氧化劑和抗炎藥物來增強肝臟的抗氧化和抗炎能力[2-4]，但在長期給藥中存在毒性[5]。近年來，從傳統(tǒng)藥用植物中開發(fā)出預防和治療ALD的藥物，具有多個靶點和較少的毒副作用等特點，在ALD的預防和治療方面越來越有吸引力[6-9]。因此，開發(fā)安全有效的傳統(tǒng)藥用植物是十分迫切的。

蘆薈是一種經(jīng)典的傳統(tǒng)藥食同源植物，含有多種生物活性成分，并具有抗氧化、抗炎等[10-14]作用。在酒精性肝損傷研究中，發(fā)現(xiàn)蘆薈素可以加快酒精氧化速度[15]，并減輕慢性酒精性肝損傷的脂質(zhì)積累，氧化應激和脂多糖誘導的炎癥反應[9]。蘆薈凝膠[16]可以通過降低MDA和增加谷胱甘肽來減少酒精誘導的氧化應激，對慢性飲酒導致的肝損傷具有保護作用。以上結(jié)果都說明蘆薈的有效成分對慢性酒精性肝損傷有保護作用。葉青等[17]發(fā)現(xiàn)蘆薈苷和蘆薈粗多糖對急性酒精中毒小鼠具有明顯的解酒作用，能夠明顯降低小鼠血液中的乙醇濃度，這一結(jié)果說明蘆薈的有效成分對急性酒精毒性也有緩解作用，但針對其主要作用分子機制還未有報道。在蘆薈膠生產(chǎn)過程中大量的蘆薈皮被丟棄，蘆薈皮中也具有多種活性成分[18]，蘆薈皮提取物對急性酒精性肝損傷是否有保護作用以及具體的保護機制，尚未有文獻報道，因此本研究通過建立急性酒精性肝損傷體內(nèi)外模型，檢測細胞和小鼠肝臟中分子水平和生化指標的變化，觀察小鼠肝臟病理組織，探究急性酒精性肝損傷的保護效應與相關(guān)分子機制，可為庫拉索蘆薈作為潛在天然保肝保健藥物或食物的綜合開發(fā)利用提供方向，為后續(xù)蘆薈皮相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C57BL/6J雄性小鼠（8周齡） 30只，體重20±2 g，均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證：SCXK（京）2021-0006，動物福利倫理審查批文號：P2021088；胎牛血清、雙抗 伊奧邦公司；人肝癌 HepG2 細胞 億奧邦公司，用含 10% 胎牛血清的 Dulbecco’s Modified Eagle Medium （DMEM） 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入 1% 雙抗，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；庫拉索蘆薈 四年生，由云南萬綠公司提供；抗壞血酸、無水甲醇、無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；蘆薈苷 大連美侖生物技術(shù)有限公司（純度≥98%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍溴化四唑（MTT） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；過硫酸鉀 阿法埃莎化學有限公司；水楊酸 MREDA；30%過氧化氫、硫酸亞鐵 北京化工廠；MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所；All-in-One?First-Strand cDNA Synthesis Kit 美國Gene Copoeia公司；BCA試劑盒、TriQuick Reagent總RNA提取試劑、AST試劑盒、ALT試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；2X Fast qPCR Master Mixture 北京迪寧生物科技有限公司。

ZN-20L型粉碎機 北京興時利和科技發(fā)展有限公司；XH-100A型微波催化合成萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展技術(shù)有限公司；TF881型電熱鼓風干燥箱

上海一恒科學儀器有限公司；Thermo二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技有限公司；YT-CJ-1ND型超凈工作臺 北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心；熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；R-1020型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HY-4型調(diào)速多用振蕩器 國華電器有限公司；Nikon Eclipse E100型正置光學顯微鏡、Nikon DS-U3型成像系統(tǒng) 日本尼康。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 參考韓宗元[19]的方法，并略有改進，具體方法如下；取新鮮的蘆薈葉片洗凈剝皮，取蘆薈皮，剪斷后55 ℃熱風循環(huán)烘干，粉碎機粉碎并過60目篩，取30 g蘆薈干粉，25 ℃下47%乙醇浸提40 min，25 ℃微波功率400 W萃取2 min，加入10倍體積的去離子水提取3次，合并提取液后40 ℃減壓濃縮至合適體積后冷凍干燥，得到紅棕色的蘆薈皮提取物（ABE），得率為44.07%，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 體外抗氧化活性測定

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的測定 稱取0.1984 g DPPH用無水甲醇溶解并定容至50 mL，配制成0.1 mmol/L DPPH儲備質(zhì)量濃度液。用無水甲醇分別配制成質(zhì)量濃度0.01、0.25、0.5、1.5、4、6、8、10 mg/mL的ABE溶液。準確吸取200 μL樣品加入1.5 mL離心管中待用，每管再加入600 μL DPPH溶液，充分振蕩混勻，室溫避光反應30 min。設(shè)置對照組，即各個濃度的提取物200 μL，加入600 μL甲醇。8000 r/min離心2 min，以甲醇為參比，以VC為陽性對照，分別配制質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.25、0.5、1、2 mg/mL，每組分別設(shè)置3個平行，在517 nm處檢測吸光值[20]。計算公式如下：

式中：A0：空白的Abs；Ai：樣品顯色后的Abs；Aj：樣品自身的Abs。

1.2.2.2 ABTS自由基清除率的測定 將10 mL、7 mmol/L ABTS溶液和440 μL、140 mmol/L過硫酸鉀混合，在25 ℃避光條件下孵育12～16 h，作為ABTS儲備液。將儲備液用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）稀釋20倍。用無水甲醇分別配制成質(zhì)量濃度0.01、0.25、0.5、1.5、4、6、8、10 mg/mL的ABE溶液。準確吸取200 μL樣品加入1.5 mL離心管中待用，每個離心管中加入800 μL ABTS溶液，設(shè)置對照組，即不同濃度的提取物200 μL，加入600 μL甲醇，在30 ℃水浴中反應6 min。以甲醇為參比，以VC為對照，分別配制質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.25、0.5、1、1.5、2 mg/mL，每組分別設(shè)置3個平行，在734 nm處測定吸光值[21]。計算公式如下：

式中:A0：空白的Abs；Ai：樣品顯色后的Abs；Aj：樣品自身的Abs。

1.2.2.3 羥基自由基清除率的測定 用無水甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.25、0.5、1.5、4、6、8、10 mg/mL的ABE溶液，準確吸取200 μL樣品加入1.5 mL離心管中待用，依次加入9 mmol/L硫酸亞鐵、9 mmol/L水楊酸、8.8 mmol/L過氧化氫溶液各200 μL。設(shè)置對照組，即不同濃度提取物200 μL，加入600 μL甲醇。充分混勻，在37 ℃水浴中反應30 min后。以甲醇為參比，以VC為對照，分別配制質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.25、0.5、0.7、1、2 mg/mL，在510 nm處測定吸光值[22]。計算公式如下：

式中:A0：空白的Abs；Ai：樣品顯色后的Abs；

Aj：樣品自身的Abs。

1.2.3 細胞實驗

1.2.3.1 酒精及ABE對HepG2細胞活力的影響HepG2細胞在96孔板中以每孔8×104個細胞接種，12 h后，每孔用含不同濃度（100、200、400、600、800、1000、2000 mmol/L）的含乙醇或ABE（0、5、10、40、60、80、100、200 μg/mL）的培養(yǎng)基37 ℃處理24 h，加入5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h后，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），25 ℃振蕩10 min，在492 nm處測吸光值，計算HepG2細胞活力，計算公式如下。每組做6個復孔，重復三次。在乙醇處理過程中，用Parafilm密封平板。

1.2.3.2 ABE對細胞酒精損傷模型的保護作用 將HepG2細胞在96孔板中以每孔8×104個細胞接種。12 h后，對照組加入正常培養(yǎng)基，給藥組和酒精模型組每孔用含732 mmol/L乙醇的培養(yǎng)基預處理6 h，然后給藥組用含不同濃度ABE（5、10 μg/mL）的培養(yǎng)基處理18 h，模型組繼續(xù)用含732 mmol/L乙醇的培養(yǎng)基處理18 h。加入5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h后，棄去上清，加入150 μL的DMSO，搖床振蕩10 min，492 nm測定吸光度。每組做6個復孔，重復三次。

1.2.3.3 ABE對細胞酒精損傷模型轉(zhuǎn)氨酶及氧化損傷產(chǎn)物的影響 將HepG2細胞以每孔8×105個細胞接種于在6孔板中。12 h后，對照組加入正常培養(yǎng)基，給藥組和酒精模型組每孔用含732 mmol/L乙醇的培養(yǎng)基預處理6 h，然后給藥組用含不同濃度ABE（5、10 μg/mL）的培養(yǎng)基處理18 h，模型組繼續(xù)用含732 mmol/L乙醇的培養(yǎng)基處理18 h。按照商品化試劑盒檢測ALT、AST和MDA含量。每組做3個復孔，重復三次。

1.2.3.4 ABE對細胞酒精損傷模型中酒精代謝和炎癥細胞因子表達水平的影響 用Tri Quick Reagent從細胞中提取總RNA，使用All-in-One? First-Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR?Green Mix和CFX96TM實時PCR系統(tǒng)進行PCR。細胞樣本引物序列如表1所示。

表 1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.4 動物實驗

1.2.4.1 造模及給藥方式 取雄性C57BL/6J小鼠30只，適應環(huán)境3 d后，隨機分為5組，每組6只。實驗過程中需每天測量小鼠體重。分別設(shè)置空白組、酒精模型組（50%乙醇，14 mL/kg）[23]、低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg）[24]，各給藥組每天給藥1次，給藥體積為15 mL/kg，空白組給予相同劑量的生理鹽水。末次給藥前12 h給予酒精造模（造模前需禁食12 h）。末次給藥6 h后處死小鼠，收集肝臟組織用于后續(xù)檢測。

1.2.4.2 ABE對小鼠肝組織病理變化的影響 在左肝葉同一部位，同時取小塊肝組織以4%多聚甲醛溶液固定，做常規(guī)石蠟包埋、切片以及蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-eosin staining，H & E），觀察肝組織病理改變。

1.2.4.3 ABE對小鼠酒精性肝損傷中血清及肝臟組織各項生化指標的影響 末次灌胃酒精6 h后處死小鼠，心臟取血，靜置30 min，4 ℃下6000 r/min離心10 min，常規(guī)分離血清。稱取100 mg肝組織置于提取液中勻漿，制備10%肝臟勻漿液，離心后收集上清。按試劑盒說明書要求，用微量法分別測定血清中丙ALT、AST和肝組織中MDA含量。

1.2.4.4 ABE對小鼠酒精肝損傷中酒精代謝基因表達水平的影響 用TriQuick Reagent從小鼠組織中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR?Green Mix和RT-PCR系統(tǒng)進行擴增實驗（如表2、3）。

表 2 qRT-PCR 反應體系Table 2 qRT-PCR reaction system

表 3 qRT-PCR程序設(shè)置Table 3 qRT-PCR program settings

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，該數(shù)據(jù)來自至少三個獨立的實驗。使用Excel 2016對結(jié)果進行單因素方差分析比較。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABE的體外抗氧化能力

ABE的自由基清除能力如圖1所示，ABE對DPPH、ABTS、羥基自由基的清除活性在不同濃度下均較明顯，清除能力呈濃度依賴性增加。通過計算可知，ABE和VC的DPPH自由基清除率的IC50分別為2.03和0.003 mg/mL，ABTS自由基清除率的IC50分別為0.131和0.03 mg/mL，羥基自由基清除率的IC50分別為0.74和0.33 mg/mL。根據(jù)IC50可知ABE具有良好的自由基清除能力，但相對于VC較弱。酒精代謝產(chǎn)生大量的OH-、超氧陰離子（O2-·）及H2O2等ROS，一次大量飲酒會造成體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)紊亂，氧化還原水平失衡，引起氧化應激[25]，對機體補充外源抗氧化劑可以清除體內(nèi)活性氧，降低酒精對肝臟的損傷程度?；谔J薈皮提取物對DPPH、ABTS和羥基自由基具有很好的清除能力，可以作為天然抗氧化劑治療ALD。

2.2 細胞實驗

2.2.1 酒精及ABE對HepG2細胞活力的影響 細胞活力檢測可直接反映藥物對細胞存活和增殖的影響?；诩毎盍z測，能夠確定酒精對肝細胞的體外損傷劑量并觀察ABE對細胞損傷的保護作用。圖2顯示，隨著酒精濃度在100～2000 mmol/L范圍內(nèi)增加，HepG2細胞活力呈劑量依賴性降低，IC50值為732 mmol/L，因此本研究選擇732 mmol/L作為誘導肝細胞損傷的濃度。隨著ABE濃度的增加，未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，因此在一定濃度范圍內(nèi)ABE使用安全無明顯毒性。與對照組相比，732 mmol/L酒精作用24 h后，HepG2細胞活力極顯著降低（P＜0.01），加入ABE后，細胞活力顯著增加（P＜0.05）。圖2（C）中顯示了ABE對酒精損傷細胞的保護作用。在ABE的作用下，與模型組的細胞相比，細胞存活率分別提高了35.91%和39.07%，說明ABE對酒精誘導的肝細胞損傷有保護作用。

圖 1 不同濃度ABE對DPPH、ABTS和羥基自由基清除率的影響Fig.1 Effects of ABE at different concentrations on the scavenging efficiency of DPPH, ABTS and hydroxyl radicals

圖 2 不同濃度的酒精和ABE對HepG2細胞活力的影響Fig.2 Effects of different doses of ethanol and ABE on the viability of HepG2 cells

2.2.2 ABE對細胞酒精損傷模型轉(zhuǎn)氨酶及氧化損傷產(chǎn)物的影響 ALT及AST是評價肝損傷的核心生化指標也是臨床常用指標，MDA是評價組織和細胞氧化損傷程度的重要指標。因此，通過把ALT、AST和MDA的檢測初步判斷ABE對酒精造成的肝細胞損傷的保護效應。圖3顯示了酒精損傷細胞模型中ALT和AST水平的變化。與對照組相比，急性酒精攝入導致ALT和AST極顯著升高（P＜0.01），分別提高了123.44%、43.26%。說明急性酒精性肝損傷細胞模型成功建立。與模型組相比，ABE低、高劑量組細胞ALT水平分別降低了36.91%和33.75%；AST水平分別下降18.05%和26.17%，結(jié)果顯示，ABE可以抑制酒精導致的細胞中AST、ALT水平的升高。與對照組相比，急性酒精攝入極顯著增加了細胞MDA水平（P＜0.01），為正常組的328.39%，表示大量攝入酒精可增加肝脂質(zhì)過氧化。與模型組相比，ABE低、高劑量組的MDA活性分別降低了34.52%和58.16%。結(jié)果表明，ABE可抑制酒精引起的脂質(zhì)過氧化。

2.2.3 ABE對細胞酒精損傷模型中酒精代謝和炎癥細胞因子表達水平的影響 酒精可造成肝細胞氧化應激和炎性損傷，因此本研究對酒精代謝、抗氧化酶及炎癥因子相關(guān)基因的表達進行了檢測。如圖4所示，與對照組相比，模型組中Nrf2和SOD的mRNA表達下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），ABE低、高劑量組中Nrf2和SOD的mRNA表達較模型組顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），說明ABE通過上調(diào)Nrf2和SOD的mRNA的表達來增加肝細胞的抗氧化能力，緩解酒精誘導的氧化應激，結(jié)果表明，ABE可通過調(diào)控體內(nèi)抗氧化基因的表達，來保護酒精誘導的肝臟氧化應激。與對照組相比，模型組中IL-1β和IL-6的mRNA表達極顯著上調(diào)（P＜0.01），ABE低、高劑量組中IL-1β和IL-6的mRNA表達下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；說明ABE可抑制酒精導致的炎癥因子的表達，來保護酒精誘導的炎癥反應。在肝細胞中，酒精的代謝涉及多種代謝酶，其中乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）是酒精代謝過程中重要的兩種酶[26]。與對照組相比，模型組中ADH的mRNA表達極顯著下調(diào)（P＜0.01），ABE低、高劑量組中ADH的mRNA表達顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），說明ABE可提高ADH的mRNA表達水平，可加速乙醇向乙醛轉(zhuǎn)化。而ABE同時還能提高Nrf2和SOD的表達，說明ABE具有促進乙醛代謝的潛力。綜合以上結(jié)果，ABE可通過加速酒精代謝，來減輕急性酒精性肝損傷。

圖 3 不同劑量的ABE對酒精損傷HepG2細胞內(nèi)ALT（A）、AST（B）活性和MDA（C）含量的影響Fig.3 Effects of different doses of ABE on ALT (A), AST (B)activities and MDA (C) content in alcoholic -injured HepG2 cells

圖 4 不同劑量ABE對酒精損傷HepG2細胞中Nrf2（A）、SOD（B）、ADH （C）、IL-1β（D）、IL-6（E）水平的影響Fig.4 Effects of different doses of ABE on Nrf2 (A)、SOD (B)、ADH (C)、IL-1β (D)、IL-6 (E)in alcoholic -injured HepG2 cells

2.3 動物實驗

2.3.1 ABE對小鼠肝組織病理變化的影響 組織病理學檢測可通過組織切片直觀的判定組織病變損傷的程度和特點，此處使用H&E染色對小鼠肝臟組織進行觀察。如圖5所示，正常對照組小鼠的肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，細胞核正常，未發(fā)生脂肪變性。酒精組肝形態(tài)細胞結(jié)構(gòu)不完整，細胞間排列紊亂，細胞間的界限模糊不清，還出現(xiàn)了廣泛的空泡變性。相對于酒精模型組，ABE低、中、高劑量組均能不同程度地減少細胞漿內(nèi)的空泡變性。單次大量飲酒會導致嚴重的肝臟氧化應激、炎癥和脂肪變性，而其中脂肪變性是最早和最常見的酒精性肝損傷形式。以上結(jié)果表明，ABE可以有效改善急性酒精性肝損傷。

圖 5 ABE對酒精性肝損傷小鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（200×）Fig.5 Effects of ABE on the morphological structure of liver tissue in mice with alcoholic liver injury （200×）

圖 6 不同劑量ABE對急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT（A）、AST（B）及肝臟MDA（C）水平的影響Fig.6 Effects of different doses of ABE on serum ALT (A),AST (B) and liver MDA (C) levels in mice with acute alcoholic liver injury

2.3.2 ABE對小鼠酒精性肝損傷中血清及肝臟組織各項生化指標的影響 在動物實驗中，本研究檢測小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶水平以及肝臟組織中MDA的水平，用于評價酒精損傷小鼠模型中ABE的保肝作用。如圖6所示，與正常組相比，急性酒精攝入導致ALT、AST極顯著升高（P＜0.01），分別提高了133.5%、63.3%。說明急性酒精性肝損傷動物模型成功建立。與酒精組相比，ABE低、中、高劑量組小鼠肝臟ALT水平分別降低了27.42%、33.32%和51.28%；AST水平分別降低了27.05%、32.72%和27.05%；結(jié)果表明，ABE可抑制急性酒精性肝損傷小鼠中AST、ALT水平的升高。與正常組相比，急性酒精攝入極顯著增加小鼠肝臟MDA水平（P＜0.01），為正常組的327.27%，表示大量攝入酒精可增加肝脂質(zhì)過氧化。與酒精組相比，ABE低、中、高劑量組的MDA活性分別降低了22.53%、52.15%和54.90%。結(jié)果表明，ABE具有抑制酒精引起的脂質(zhì)過氧化的作用。

2.3.3 ABE對小鼠酒精肝損傷中酒精代謝基因表達水平的影響 基于細胞實驗的結(jié)果，本研究進一步對酒精代謝相關(guān)酶的表達水平進行了檢測。如圖7所示，與對照組相比，模型組中HO-1和SOD的mRNA表達極顯著下調(diào)（P＜0.01），Nrf2和CAT的mRNA表達顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。ABE低、中、高劑量組中Nrf2、HO-1、CAT和SOD的mRNA表達均較模型組上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），說明ABE通過上調(diào)Nrf2、HO-1、CAT和SOD的mRNA的表達來緩解酒精誘導氧化應激。以上結(jié)果中Nrf2和CAT的表達亦受到酒精的調(diào)控，可能是由于酒精導致的肝臟ROS產(chǎn)生增加，應激性的刺激Nrf2表達的上調(diào)，進而對CAT的表達產(chǎn)生影響[25,27]。結(jié)果表明，ABE可通過調(diào)控體內(nèi)抗氧化基因的表達，來保護酒精誘導的肝臟氧化應激。在肝細胞中，乙醇可由ADH代謝為乙醛，再由乙醛脫氫酶（ALDH）代謝為無毒的乙酸。與對照組相比，酒精模型組中ADH的mRNA表達極顯著上調(diào)（P＜0.01），模型組中ALDH的mRNA表達下調(diào)，ABE低、中、高劑量組中ADH和ALDH的mRNA表達水平較模型組上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），說明ABE可提高ADH和ALDH的mRNA表達水平。以上結(jié)果中ADH的表達亦受到酒精的調(diào)控，主要由于機體大量攝入酒精后會應激刺激肝臟組織上調(diào)ADH以幫助酒精分解，但其對ADH的影響與酒精的劑量和作用時間密切相關(guān)[28]。綜上所述，ABE通過增加酒精代謝基因的水平來促進酒精的分解代謝，減輕急性酒精性肝損傷。

圖 7 不同劑量ABE對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟中Nrf2（A）、HO-1（B）、SOD（C）、CAT（D）、ADH（E）、ALDH（F）水平的影響Fig.7 Effects of different doses of ABE on Nrf2 (A), HO-1 (B), SOD (C), CAT (D), ADH (E) and ALDH (F) levels in the liver of mice with acute alcoholic liver injury

3 討論

隨著酒精消費量的增加，酒精已成為引起肝病的重要原因[29]，近年來，ALD的發(fā)病率也逐年上升，已成為繼病毒性肝炎之后，肝損傷的第二大原因[30]，然而，關(guān)于ALD的治療方法還很少，人們嘗試使用合成抗氧化劑，但是發(fā)現(xiàn)存在一定毒性[5]，所以開發(fā)植物來源的生物活性成分，是本領(lǐng)域研發(fā)的一個趨勢。蘆薈是一種經(jīng)典的傳統(tǒng)藥物，含有豐富的生物活性成分，具有多種藥理作用。本研究旨在探索蘆薈皮提取物對酒精誘導的HepG2細胞及動物模型肝損傷的保護作用及潛在機制，為今后開發(fā)治療急性酒精性肝損傷的新型藥物提供依據(jù)。

酒精在肝臟中可通過三條途徑進行代謝：a.細胞質(zhì)基質(zhì)上的乙醇脫氫酶系代謝途徑；b.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的細胞微粒氧化途徑（MEOS）；c.過氧化氫酶體上的過氧化氫酶氧化途徑。其中ADH代謝是最主要的代謝途徑，該代謝途徑中ADH和ALDH表達對酒精代謝至關(guān)重要。在本研究中，對ADH和ALDH基因的表達進行了檢測，結(jié)果顯示給藥組能夠顯著上調(diào)ADH和ALDH的表達。因此ABE能夠促進酒精的代謝，酒精代謝的加速能夠很大程度上降低酒精對肝臟造成的損傷。

細胞質(zhì)內(nèi)的ALT和AST會在肝細胞發(fā)生嚴重壞死或破壞時泄露到全身循環(huán)中。因此,這兩種酶是肝功能檢測的重要指標，血漿中兩種酶的升高初步表明肝組織造成的損傷,其中ALT是檢測肝臟損傷程度更為準確的指標[31-32]。在本研究中，AST和ALT水平的變化以及組織學檢查的結(jié)果證實了急性酒精引起的肝損傷。給藥組顯著抑制了細胞內(nèi)和小鼠心臟血漿中AST和ALT水平的升高，表明ABE對急性酒精性肝損傷有保護或治療作用。此外，本研究通過H＆E染色，觀察了ABE對酒精誘導的肝組織形態(tài)學變化的影響。結(jié)果表明ABE能顯著減輕酒精引起的肝組織形態(tài)變化。

在酒精代謝的過程中會產(chǎn)生ROS。ROS的產(chǎn)生和積累造成了肝細胞的氧化應激，過氧化會導致細胞膜結(jié)構(gòu)的滲透性和完整性的改變[33-34]，是引發(fā)ALD的一個重要因素[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)蘆薈皮提取物對自由基具有良好的清除能力，對ALD體內(nèi)外實驗都具有明顯的防治作用，可以作為未來治療ALD的潛在藥物。MDA作為脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物，通常用作評價自由基誘導的氧化應激的指標[37]。在本研究中，體內(nèi)和體外酒精模型組中MDA濃度的增加，說明酒精誘導的ROS積累增加了肝細胞脂質(zhì)過氧化，這將進一步導致肝臟組織的損傷以及抗氧化防御系統(tǒng)的失效[38-39]。Zhu等[40]證明了蘆薈通過抑制脂質(zhì)過氧化和炎癥來減輕乙醇誘導的大鼠胃損傷。Gupta等[41]證明了蘆薈葉的水提取物可以明顯改善農(nóng)藥中毒的Wistar大鼠血清中AST和ALT的活性以及大鼠肝臟中MDA的活性水平。由此來看，蘆薈對于抑制脂質(zhì)過氧化是非常有效的。與該結(jié)果對應，在給藥組中，蘆薈皮提取物顯著抑制了細胞和小鼠肝臟中MDA的增加，表明蘆薈皮提取物對急性酒精性誘導的脂質(zhì)過氧化有抑制作用。

機體具備一套抗氧化防御系統(tǒng)，其中酶促和非酶促抗氧化劑共同發(fā)揮作用清除ROS并減少氧化應激[42]。因此，增強機體自身的抗氧化放于體系，這可有效清除急性酒精誘導產(chǎn)生的ROS并降低氧化應激，緩解酒精造成的損傷。Nrf2（核因子紅系2相關(guān)因子2）是一種在氧化刺激下誘導細胞保護信號的重要轉(zhuǎn)錄因子，其下游調(diào)控多種抗氧化酶的表達，如HO-1和SOD等[27]。SOD是內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)清除ROS和維持細胞氧化還原平衡[43]。有研究表明，Nrf2的激活在酒精性肝損傷的保護中發(fā)揮重要作用[44]。因此，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，可以增加多種抗氧化酶的表達，包括HO-1、CAT及SOD等，以此可顯著降低ROS水平，降低機體的氧化應激損傷。證據(jù)表明[8,45-46]，氧化應激、炎癥損傷和脂質(zhì)積累是引發(fā)ALD的主要誘因。因此，炎癥因子表達異常是ALD的另一個主要特征[47]，TNF-α、IL-1β和IL-6是重要的炎癥細胞因子，且IL-1β在ALD中發(fā)揮重要作用。本文進一步研究了ABE對急性酒精性肝損傷的保護作用是否與炎癥因子的表達有關(guān)。結(jié)果表明，ABE可通過增加抗氧化基因表達的同時抑制炎癥因子的表達來減輕急性酒精性肝損傷。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究對蘆薈皮進行探究，發(fā)現(xiàn)其對急性酒精性肝損傷具有保護作用。結(jié)果表明，蘆薈皮提取物具有良好的體外抗氧化活性，可以抑制AST、ALT的釋放，清除MDA，顯著抑制了急性酒精導致肝臟受損和脂質(zhì)過氧化。機制結(jié)果表明，蘆薈皮提取物可通過增加抗氧化mRNA和抑制炎癥因子mRNA的表達來減輕急性酒精性肝損傷，可能是緩解了酒精引起的肝臟細胞氧化應激和炎癥，并促進酒精在肝臟中代謝，從而達到護肝的功效。因此，蘆薈皮提取物可能是成為一種預防或改善急性酒精性肝損傷的藥物或食品的潛在活性原料。