宮艷超，趙 靖，崔 迎，吳國(guó)旭

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化工學(xué)院，天津 300402）

抗病毒藥物是一類用于預(yù)防和治療人和動(dòng)物病毒感染的藥物，目前較常用的抗病毒藥物主要有核苷類（阿昔洛韋、奧司他韋、泛昔洛韋、嗎啉胍）、非核糖苷類（阿比多、三環(huán)胺類美金剛、金剛烷胺）、非核苷類（奈韋拉平）以及異環(huán)胺類（咪喹莫德）等[1-2]。由于抗病毒藥物對(duì)動(dòng)物常見(jiàn)的病毒性流感疾病有一定的預(yù)防和治療效果，且價(jià)格低廉[3-4]，常被用在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中。但是在使用過(guò)程中用量控制不好或者濫用會(huì)使這些抗病毒藥物在動(dòng)物體內(nèi)形成藥物殘留等問(wèn)題，嚴(yán)重的還可能會(huì)使病毒菌株發(fā)生變異，危害人類健康[5-6]。目前抗病毒藥物多組分的檢測(cè)方法尚不完善，有必要建立一種方法快速檢測(cè)這些組分，加強(qiáng)抗病毒藥物在動(dòng)物源性食品中的殘留監(jiān)控。

現(xiàn)如今對(duì)食品的安全性要求較高，市場(chǎng)上以動(dòng)物源為基質(zhì)的食品品種繁多，所占市場(chǎng)份額也越來(lái)越大。加之近些年食品中獸藥殘留事件頻頻曝光，所以人們對(duì)這類特殊食品中的藥物殘留越來(lái)越重視，而抗病毒藥物的殘留檢測(cè)就是其中研究的熱點(diǎn)[7-9]。目前食品中抗病毒藥物殘留的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法[10-12]、高效液相色譜法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]等。由于大多數(shù)抗病毒藥物屬于強(qiáng)極性化合物，在常規(guī)反相色譜柱上保留性能不佳，強(qiáng)極性和高水溶性也給樣品前處理和色譜分離增加了難度。采用溶劑萃取的前處理方式處理動(dòng)物源性食品，目標(biāo)物回收率不理想。酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法較為常用，但由于儀器精度所限，檢測(cè)的靈敏度不高；常用的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖靈敏度較色譜法有所提高，但檢測(cè)時(shí)流動(dòng)相中需加入離子對(duì)試劑，會(huì)存在系統(tǒng)穩(wěn)定性差以及容易出現(xiàn)高離子強(qiáng)度抑制待測(cè)物電離等問(wèn)題[16]。親水交互作用色譜（Hydrophilic interaction chromatgraphy，HILIC）是一種組分分離模式介于正相色譜和反相色譜之間的色譜技術(shù)，適用于分析強(qiáng)親水性和強(qiáng)極性化合物，可解決樣品中多種強(qiáng)極性組分分離難的問(wèn)題[17-18]。國(guó)內(nèi)將親水交互作用色譜法應(yīng)用于食品中抗病毒藥物檢測(cè)方面的研究較少，本研究通過(guò)式固相萃取凈化技術(shù)，結(jié)合親水色譜分離技術(shù)對(duì)強(qiáng)極性較難分離的9種抗病毒藥物組分進(jìn)行提取后，通過(guò)親水交互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HILIC-tandem mass spectrometry，HILIC-MS/MS）檢測(cè)動(dòng)物源性食品中9種抗病毒藥物組分的殘留，克服了常規(guī)方法目標(biāo)物難分離的缺陷，以期為此類藥物殘留的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奈韋拉平（98.5%）、泛昔洛韋（99.2%）、阿比多（99.0%）、阿昔洛韋（99.0%）、咪喹莫德（99.5%）、美金剛（99.0%）、金剛烷胺（98.5%）、奧司他韋（99.2%）、嗎啉胍（98.5%） 標(biāo)準(zhǔn)品，上海安譜實(shí)驗(yàn)科學(xué)科技有限公司；乙酸銨、三氯乙酸、偏磷酸 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈 色譜純，德國(guó)Merck公司；MCX、MAX以及PRiME HLB固相萃取小柱（規(guī)格均為100 mg/3 mL） 美國(guó)Waters公司；動(dòng)物源性食品（牛肉干、豬肉脯、羊肉卷、雞肉腸、火腿腸、醬鹵肉、醬鴨翅、雞蛋、牛奶）

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Waters Xevo TQ-S三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀、ZIC-HILIC色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm） 美國(guó)Waters公司；Inert Sustain Amide色譜柱（3.0 mm×150 mm，3.5 μm）、TSKgel Amide-80色譜柱（3.0 mm×150 mm，2 μm） 日本島津有限公司；Sielc ObeliscR色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 美國(guó)Sielc科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜柱的選擇 不同的親水色譜柱類型對(duì)抗病毒藥物組分分離效果不同，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]，選擇4種色譜柱ZIC HILIC色譜柱（鍵合相為硅膠）、InertSustain Amide色譜柱（鍵合相為酰胺基）、TSKgel Amide-80色譜柱（鍵合相為酰胺基）以及Sielc Obelisc R色譜柱（鍵合相為含電荷的極性和非極性混合基團(tuán)），比較分離9種抗病毒藥物組分的效果。

1.2.2 儀器條件 質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI+源）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子源溫度為200 ℃；脫溶劑氣流量為20 L/min；錐孔氣流量為2.0 L/min。

色譜條件：Sielc Obelisc R色譜柱，流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2.0 μL；流動(dòng)相中A：10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），B：乙腈，梯度洗脫步驟如表1所示。

表 1 流動(dòng)相梯度洗脫步驟Table 1 Mobile phase gradient elution step

1.2.3 樣品前處理 稱取2.0 g樣品至50 mL離心管中，加入20 mL提取液（20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液、20 g/L三氯乙酸溶液，20 g/L偏磷酸-甲醇溶液，1%乙酸-乙腈溶液），使用2000 W功率超聲儀常溫下超聲10 min后離心2 min （5000 r/min），取10 mL上清液進(jìn)固相小柱（MCX、MAX以及PRiME HLB）進(jìn)行凈化，固相萃取過(guò)程按照上樣、淋洗、洗脫等步驟進(jìn)行后，收集濾液過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取適量的9種抗病毒藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇超聲溶解并配制成1000.0 ng/mL的中間儲(chǔ)備液，檢測(cè)前以流動(dòng)相配制成0.1～50.0 ng/mL濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，經(jīng)儀器進(jìn)行分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 樣品檢測(cè)及方法的適用性 對(duì)10份不同品牌動(dòng)物源性食品中9種抗病毒藥物組分殘留分別用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法（SN/T 4253-2015 出口動(dòng)物組織中抗病毒類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法）和本研究方法進(jìn)行測(cè)定，并比較結(jié)果，分析方法的適用性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)5次，并利用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，采用Origin 8.5和TBtools軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

結(jié)果如圖1所示，比較ZIC HILIC柱、TSKgel Amide-80柱、InertSustain Amide柱以及Sielc Obelisc R柱4款親水作用色譜柱發(fā)現(xiàn)，ZIC HILIC柱分離9種抗病毒藥物組分的效果不理想，目標(biāo)組分出峰重疊，分離度較差（圖1a）；而TSKgel Amide-80柱在乙腈-1%甲酸為流動(dòng)相等度洗脫模式下，可以實(shí)現(xiàn)部分抗病毒藥物組分的分離（圖1b）；在InertSustain Amide柱色譜柱上對(duì)9種組分的保留效果不好，在前2 min內(nèi)有6種待測(cè)組分基本分離出峰，而阿比多、阿昔洛韋、嗎啉胍由于其極性較大，在此色譜柱上沒(méi)有保留，整體分離效果也較差（圖1c）；而Sielc Obelisc R色譜柱由于含電荷的極性和非極性混合基團(tuán)，所以對(duì)9種組分的分離效果較好，出峰時(shí)間適宜，各組分也有較好的分離度（圖1d），不同鍵合固定相的色譜柱在分離目標(biāo)物組分的過(guò)程中保留機(jī)制迥異，故本研究最終采用Sielc Obelisc R色譜柱。

圖 1 4種色譜柱的分離效果比較Fig.1 Comparison of purification of 4 kinds of chromatographic columns

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

本研究檢測(cè)的9種抗病毒藥物組分結(jié)構(gòu)中均含有胺基基團(tuán)，在離子化過(guò)程中易與H離子結(jié)合后帶有正電荷，所以在分析時(shí)采用正離子掃描模式對(duì)9種組分的混標(biāo)溶液進(jìn)行母離子和子離子的質(zhì)譜掃描，并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，具體質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表2。

表 2 9種組分的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of nine components

2.3 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

在流動(dòng)相的選擇上比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.05%甲酸）、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）和乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）等不同流動(dòng)相在Sielc Obelisc R親水色譜柱的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中含有一定比例的乙酸銨會(huì)維持流動(dòng)相pH的穩(wěn)定性，能改善峰形，減少拖尾，洗脫效果最好；并在乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相的基礎(chǔ)上比較發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中沒(méi)有甲酸存在的情況，9種抗病毒藥物組分的電離效果不理想，出現(xiàn)峰型不對(duì)稱性等情況，將流動(dòng)相中的水更換為甲酸溶液后，流動(dòng)相體系為酸性，待測(cè)組分電離更充分，分離情況得到改善。故又比較了流動(dòng)相中甲酸溶液濃度分別為0.05%、0.1%和0.2%的情況下，各組分的檢測(cè)響應(yīng)值。通過(guò)測(cè)定各組分的響應(yīng)值發(fā)現(xiàn)，含0.1%甲酸流動(dòng)相組成，各組分的響應(yīng)值最高，因此本研究以乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相，通過(guò)適度的梯度洗脫步驟，可以保證各個(gè)化合物有良好的峰形、分離度及響應(yīng)強(qiáng)度，在Sielc Obelisc R親水色譜柱上分離9種抗病毒藥物組分的總離子流（total ion chromatography,TIC）圖見(jiàn)圖2。

圖 2 9種抗病毒藥物組分的TIC圖Fig.2 TIC diagrams of 9 kinds of antiviral drug components

2.4 提取溶劑的選擇

考慮到肉制品、奶制品、蛋制品等動(dòng)物源性樣品中有大量蛋白和磷脂類物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)所用提取液最好既能沉淀蛋白，又能降低基質(zhì)效應(yīng)。參考相關(guān)文獻(xiàn)[21-22]，本研究分別比較：提取溶液Ⅰ：20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液，提取溶液Ⅱ：20 g/L三氯乙酸溶液（9:1，V/V），提取溶液Ⅲ：20 g/L偏磷酸-甲醇溶液（8:2，V/V），提取溶液Ⅳ：1%乙酸-乙腈溶液，分別添加了50 μg/kg的陽(yáng)性樣品中的目標(biāo)組分，比較各目標(biāo)組分峰面積，分析不同類型的提取溶液對(duì)9種組分提取的影響。

由圖3可知，1%乙酸-乙腈的提取效果整體優(yōu)于其他3種提取溶液，能夠有效提取9種組分，且不同提取溶液間提取效果差異顯著（P＜0.05）。這可能是由于在提取液偏酸性的環(huán)境中，目標(biāo)組分在提取液中的分配系數(shù)較高，實(shí)現(xiàn)較滿意的提取效果[23]。結(jié)合上述流動(dòng)相中乙腈作為樣液溶劑，為了減少溶劑轉(zhuǎn)化步驟，因此選擇1%乙酸-乙腈作為該方法的提取液。

圖 3 不同提取溶液對(duì)峰面積的影響Fig.3 Effects of different extraction solutions on peak area

2.5 固相萃取柱的選擇

動(dòng)物源性食品提取液中雜質(zhì)組分易對(duì)目標(biāo)組分產(chǎn)生干擾[24]，本研究采用固相萃取法進(jìn)行凈化提取液，比較了HLB、MCX、MAX共3款小柱對(duì)提取液的凈化效果，以各組分加標(biāo)回收的峰面積為比較依據(jù)，結(jié)果如圖4所示。

圖 4 不同固相小柱對(duì)峰面積的影響Fig.4 Effect of different solid phase columns on peak area

由圖4可知，綜合比較來(lái)看HLB固相小柱的凈化效果最好，各組分的峰面積最高，與其他兩款固相小柱的效果大部分差異顯著（P＜0.05）。這是因?yàn)镠LB固相小柱適用范圍廣，特異性不強(qiáng)，適合大多數(shù)化合物，而MCX和MAX固相小柱特異性強(qiáng)，對(duì)部分待測(cè)組分的保留性較差，所以使用HLB小柱回收效果較好[25]。且本研究采用了新型PRiME HLB固相萃取柱，樣品提取液采用通過(guò)式凈化方式，省去了活化和洗脫步驟，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了效率，故選擇PRiME HLB固相小柱。

2.6 方法的線性范圍與靈敏度

將9種抗病毒藥物組分的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液以乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表3所示，9種組分在線性范圍內(nèi)均具有較好的線性關(guān)系，依據(jù)色譜峰的信噪比（S/N）3倍確定檢出限（LOD），信噪比（S/N）的10倍確定定量限（LOQ），得到目標(biāo)組分的LOD范圍為0.1～0.5 μg/kg，LOQ范圍為0.3～1.5 μg/kg，方法靈敏度高。

表 3 9種組分的回歸方程和決定系數(shù)Table 3 Regression equation and determination coefficients of nine kinds components

2.7 方法回收率與精密度

本研究加標(biāo)回收樣品分別添加相對(duì)于9種抗病毒藥物組分定量限的低、中、高的三個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)結(jié)果測(cè)定5次，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)（表4）。

表 4 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of the method (n=5)

由表4可見(jiàn)，9種抗病毒藥物組分的加標(biāo)回收率為82.3%～95.7%，RSD為3.2%～5.9%，說(shuō)明本試驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和精密度可靠。

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)及方法的適用性

在上述優(yōu)化試驗(yàn)條件下，對(duì)10份不同品牌動(dòng)物源性食品中9種抗病毒藥物組分殘留進(jìn)行了分析。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9種目標(biāo)物組分含量均未檢出，結(jié)果良好，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。為驗(yàn)證方法的適用性和可靠性，對(duì)陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)處理后（加標(biāo)2.0、10.0、50.0 μg/kg），分別用標(biāo)準(zhǔn)方法（SN/T 4253-2015）和本研究的方法進(jìn)行測(cè)定，并比較結(jié)果，結(jié)果如表5所示。從表5的結(jié)果可以看出，本研究的方法所測(cè)定的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法所能測(cè)定的組分結(jié)果在合理的誤差范圍內(nèi)，表明本方法適用于動(dòng)物源性食品中9種抗病毒藥物組分殘留的測(cè)定。

3 結(jié)論

本文通過(guò)4種HILIC機(jī)理色譜柱的比較、流動(dòng)相的選擇以及樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，建立了一種親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中9種抗病毒殘留的分析方法。樣品由1%乙酸-乙腈溶液進(jìn)行提取，并經(jīng)PRiME HLB固相小柱凈化處理后，可實(shí)現(xiàn)對(duì)9種待測(cè)組分的有效檢測(cè)。本方法有效解決了抗病毒組分在反相色譜柱上保留效果不佳、加標(biāo)回收率低的檢測(cè)難點(diǎn)，與目前的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)方法相比，在保證準(zhǔn)確性好、靈敏度高的同時(shí)，盡可能省去了復(fù)雜的前處理，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)目標(biāo)種類和效率，可為動(dòng)物源性食品中9種抗病毒藥物殘留的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。