劉騰飛，張 麗，楊代鳳, ，朱 松，周鋒杰

（1.江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇蘇州 215105；2.蘇州市職業(yè)大學食品安全與營養(yǎng)研究中心，江蘇蘇州 215104；3.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122；4. 蘇州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，江蘇蘇州 215128）

茶葉是我國重要的經(jīng)濟作物之一，也是我國傳統(tǒng)的特色農(nóng)產(chǎn)品，具有悠久的歷史和文化底蘊[1-2]。茶葉質(zhì)量安全是保障茶產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要基礎，而茶鮮葉作為茶葉加工的原材料，其安全性決定了茶葉的質(zhì)量安全。在茶葉生產(chǎn)中，病蟲害的發(fā)生嚴重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。為保障茶葉優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，農(nóng)藥的使用不可避免。其中，有機磷農(nóng)藥具有價廉、高效、殘留期短等優(yōu)點，是我國茶葉種植過程中使用的主要農(nóng)藥種類之一[5]，但由于長期使用或使用不當，造成其在茶葉及茶鮮葉中的殘留問題時有發(fā)生[6-11]，由于此類農(nóng)藥高毒，可引起神經(jīng)系統(tǒng)中毒[12]，從而給消費者健康帶來安全隱患，因此采取靈敏、可靠的檢測技術對有機磷農(nóng)藥殘留進行分析十分重要。

目前，在檢測茶葉中有機磷農(nóng)藥殘留時，國家已制定了相應的檢驗標準，例如GB/T 23204-2008[13]、GB 23200.13-2016[14]和GB 23200.121-2021[15]等，但針對茶鮮葉中有機磷殘留檢測的標準卻仍為空白，但相關的非標準方法報道較多[11,16-19]。在使用標準方法或某些非標準方法檢測有機磷殘留時，樣品的稱量和前處理、溶液的配制等過程，都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。由于檢測結(jié)果直接反映了茶產(chǎn)品質(zhì)量的好壞，當使用這些結(jié)果作為決策依據(jù)時，科學評價結(jié)果的準確性尤為重要。測量不確定度是用于表征測量值分散性的參數(shù)，它定量地描述了測量值的可信區(qū)間，是評價檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量高低的一項重要指標，檢測結(jié)果的可靠性極大程度上取決于其不確定度的大小[20-21]。通過對分析方法中不確定度的評定，可以量化影響檢測結(jié)果的主要因素，便于改進實驗方案，使檢測結(jié)果更加準確可信[22-24]。近年來，很多分析工作者對茶葉中有機磷農(nóng)藥檢測的不確定度開展了研究。例如，羅發(fā)美[25]、李建珍[26]、李志[27]等分別對茶葉中草甘膦、乙酰甲胺磷、敵敵畏殘留量檢測的不確定度進行了評定，得出了影響不確定度的主要因素，為實驗室改進和提高檢測質(zhì)量提供了依據(jù)。但是，對于茶鮮葉中有機磷殘留檢測的不確定度分析，目前國內(nèi)外尚未見研究報道。

本研究在實驗室前期建立的氣相色譜-火焰光度檢測器測定茶鮮葉中有機磷農(nóng)藥殘留方法[16]的基礎上，選擇在我國茶樹上登記使用及在茶葉中具有最大殘留限量的有機磷農(nóng)藥[5,28]敵敵畏、樂果、馬拉硫磷和殺螟硫磷為研究對象，依據(jù)《化學分析中測量不確定度評估指南》[29]和《測量不確定度評定與表示》[30]，對該方法測定茶鮮葉中4種有機磷農(nóng)藥殘留量的不確定度進行評定，分析測定過程中不確定的來源，找出影響不確定度的主要因素，并提出針對性的控制方法，為正確評價和使用檢測結(jié)果提供依據(jù)，同時也為茶鮮葉中其他農(nóng)藥殘留檢測的不確定度評定提供參考范例。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶鮮葉 按一芽二、三葉標準取自蘇州東洞庭山碧螺春茶園，取樣時間為2022年4月份，將樣品充分粉碎、混勻，裝入聚乙烯塑料袋，-20 ℃貯存，備用；有機磷農(nóng)藥標準品包括：敵敵畏、樂果、馬拉硫磷和殺螟硫磷 質(zhì)量濃度均為1000 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所（天津）；PSA吸附劑、GCB吸附劑 天津博納艾杰爾公司；C18吸附劑 美國賽分公司；乙腈、丙酮、乙酸、無水乙酸鈉、無水MgSO4分析純，上海國藥集團。

7890A氣相色譜儀（配火焰光度檢測器） 美國Agilent公司；JY20002電子天平 上海舜宇恒平科學儀器；KQ-500DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器公司；CenLee16R高速離心機 湖南湘立公司；HSC-24 B氮吹儀 天津恒奧公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器檢測條件 色譜柱：DB-1701毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣為高純氮氣，流速3.0 mL/min；氫氣流速75 mL/min；空氣流速100 mL/min；升溫程序：90 ℃保持1 min，以20 ℃/min升溫至200 ℃保持9 min，再以30 ℃/min升溫至245 ℃保持8 min；進樣口溫度220 ℃；檢測器溫度245 ℃；進樣量1.0 μL，不分流進樣。

1.2.2 標準溶液配制 準確吸取4種有機磷農(nóng)藥標準品各1.0 mL于25 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配成濃度為40 μg/mL的單標溶液。根據(jù)各農(nóng)藥在檢測器上的響應，取單標溶液敵敵畏0.5 mL、樂果2.0 mL、馬拉硫磷和殺螟硫磷各1.0 mL于10 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，得混合標準中間液。然后用空白茶鮮葉基質(zhì)溶液將該中間液逐級稀釋成標準系列工作溶液，其中敵敵畏濃度為0.01、0.025、0.05、0.25、0.5、1.0 μg/mL，樂果濃度為0.04、0.1、0.2、1.0、2.0、4.0 μg/mL，馬拉硫磷和殺螟硫磷濃度為0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 μg/mL。

1.2.3 樣品處理 稱取5.0 g茶鮮葉試樣于50 mL離心管中，加入10 mL 1%乙酸的乙腈溶液和2 g無水乙酸鈉，混勻，超聲提取15 min，然后加入1 g無水MgSO4，渦旋2 min，9000 r/min離心4 min。移取4.0 mL提取液至裝有0.15 g C18、0.15 g PSA、0.12 g GCB和0.3 g無水MgSO4的離心管中，渦旋2 min，9000 r/min離心5 min。移取2.0 mL凈化液，在50 ℃水浴下氮吹近干，準確加入1.0 mL丙酮溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，濾液作為待測溶液，備用。

1.2.4 樣品檢測 用氣相色譜-火焰光度檢測器分析基質(zhì)標準溶液，以農(nóng)藥的峰面積對其相應的質(zhì)量濃度做標準曲線。采用同樣的方法分析待測溶液，將測得的峰面積代入標準曲線，計算得到待測溶液的濃度，最后計算得到樣品中農(nóng)藥的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent Chemstation B.04.03[54]進行數(shù)據(jù)采集與處理，Microsoft Excel 2016和Origin 2019b進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度測定數(shù)學模型

根據(jù)方法測定原理和過程，茶鮮葉中4種被測農(nóng)藥殘留含量按公式（1）計算[18]：

式中：X為茶鮮葉中農(nóng)藥的含量，mg/kg；ρ為由標準曲線計算得到的樣品溶液中農(nóng)藥的濃度，mg/L；V為試樣溶液的定容體積，mL；m為稱取試樣的質(zhì)量，g；f為樣品溶液的稀釋因子，f=1。

2.2 不確定度來源分析

測量結(jié)果的不確定度由若干個分量組成，按其數(shù)值評定方法，分為A類和B類。A類評定是指采用統(tǒng)計方法對在規(guī)定測量條件下測得的量值進行的不確定度分量的評定，由重復性檢測引入的不確定度屬于A類不確定度。B類評定是指采用不同于A類評定方法進行的不確定度分量的評定，其信息來源一般包括生產(chǎn)廠的說明書、檢定規(guī)程、校準規(guī)范、檢定或校準證書提供的數(shù)據(jù)等[29-30]。

根據(jù)數(shù)學模型，茶鮮葉中4種有機磷農(nóng)藥殘留量測定的不確定度來源包括：樣品測定重復性引入的相對標準不確定度urel(X)；標準溶液配制引入的相對標準不確定度urel(S)；標準曲線擬合引入的相對標準不確定度 urel(Cur)；樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(m)；樣品提取、凈化和定容等前處理過程引入的相對標準不確定度urel(V)；樣品中農(nóng)藥添加回收率引入的相對標準不確定度urel(R)；儀器測定引入的相對標準不確定度urel(GC)。

2.3 不確定度分量的評定

2.3.1 樣品測定重復性引入的相對標準不確定度urel(X)在重復性條件下，對已添加4種有機磷農(nóng)藥標準品的陽性茶鮮葉樣品（敵敵畏、樂果的理論濃度分別為0.1 mg/kg和0.4 mg/kg，馬拉硫磷和殺螟硫磷的理論濃度為0.2 mg/kg）進行前處理，平行測定6次。根據(jù)測得數(shù)據(jù)，采用A類評定，計算樣品測定重復性引入的標準不確定度u (X)和相對標準不確定度 urel(X)，計算式分別為公式（2）和公式（3），結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，茶鮮葉中4種被測農(nóng)藥由測定重復性引入的相對標準不確定度較小，其值在1.20×10-3～9.90×10-3之間，表明方法測定得到的數(shù)據(jù)具有良好的重復性，而在4種被測農(nóng)藥中，樂果測定重復性引入的不確定度最大，這主要是由于樂果在氣相色譜檢測過程中，在儀器進樣口較容易發(fā)生吸附降解，從而增加了不確定的引入。

表 1 茶鮮葉中4種有機磷農(nóng)藥重復測定結(jié)果和不確定度Table 1 Repeatability test result and uncertainty of 4 organophosphorus pesticides in fresh tea leaves

2.3.2 標準溶液配制引入的相對標準不確定度urel(S)通過逐級稀釋的方法將4種有機磷農(nóng)藥標準品稀釋至工作濃度，該過程引入的不確定度主要來源于標準品質(zhì)量濃度、標準中間液及標準工作溶液的稀釋定容3個方面。

2.3.2.1 標準品質(zhì)量濃度引入的相對標準不確定度urel(Sc)根據(jù)標準物質(zhì)證書，敵敵畏、樂果、馬拉硫磷和殺螟硫磷標準品的質(zhì)量濃度（C）均為1000 μg/mL，擴展不確定度（Urel）分別為0.6、1.0、1.3和1.0 μg/mL，包含因子k=2，根據(jù)公式（4）計算4種農(nóng)藥標準品質(zhì)量濃度引入的相對標準不確定度urel(Sc)依次為：敵敵畏樂果馬拉硫磷殺螟硫磷

2.3.2.2 標準中間液稀釋定容引入的相對標準不確定度 urel(Ss) 根據(jù)1.2.2節(jié)標準中間液的配制方法，該部分使用的量器為1 mL可調(diào)移液器及10 mL和25 mL A級容量瓶，產(chǎn)生的不確定度主要由移液器、容量瓶及溫度變化對丙酮體積的影響共同引入。1 mL移液器移取0.5 mL和1 mL的容量允差分別為±0.005 mL和±0.01 mL[31]，按矩形分布和25 mL A級容量瓶的容量允差分別為±0.02 mL和±0.03 mL[32]，按三角形分布實驗室環(huán)境溫度為（20±5）℃，丙酮的膨脹系數(shù)為1.49×10-3/℃，按矩形分布計算各分量的相對標準不確定度，結(jié)果見表2。

敵敵畏標準中間液稀釋定容過程中，使用1 mL移液器移取0.5 mL和1 mL各1次，10 mL和25 mL A級容量瓶各1次；樂果標準中間液稀釋定容過程中，使用1 mL移液器移取1 mL 2次，10 mL和25 mL A級容量瓶各1次；馬拉硫磷和殺螟硫磷標準中間液稀釋定容過程中，使用1 mL移液器移取1 mL 1次，10 mL和25 mL A級容量瓶各1次。根據(jù)量器的使用次數(shù)，計算4種農(nóng)藥標準中間液配制引入的相對標準不確定度 urel(Ss)依次為：敵敵畏 urel(Ss,1)=1.19×10-2，樂果 urel(Ss,2)=1.19×10-2，馬拉硫磷 urel(Ss,3)=9.48×10-3，殺螟硫磷

2.3.2.3 標準工作溶液稀釋定容引入的相對標準不確定度u (Sw) 用空白茶鮮葉基質(zhì)溶液將標準中間液逐級稀釋定容至2 mL，得4種農(nóng)藥的不同濃度的標準工作溶液。此過程產(chǎn)生的不確定度主要由容量瓶、移液器的體積及溫度變化所引入，均為B類評定。實驗室環(huán)境溫度為（20±5）℃，20 ℃時丙酮的膨脹系數(shù)為1.49×10-3/℃，按矩形分布容量瓶按三角形分布移液器按矩形分布依據(jù)檢定規(guī)程[31-32]規(guī)定的容量誤差，計算各分量的相對標準不確定度，結(jié)果見表3。

表 2 標準中間液配制過程中引入的不確定度Table 2 Uncertainty introduced by the preparation of standard intermediate solution

表 3 標準工作溶液配制過程中引入的不確定度Table 3 Uncertainty introduced by the preparation of standard working solution

在標準工作溶液的稀釋定容過程中，使用2 mL A級容量瓶6次，1 mL移液器移取1 mL 4次，200 μL移液器移取0.2 mL 6次，則4種農(nóng)藥標準工作溶液稀釋定容引入的相對標準不確定度urel(Sw)為：

將 urel(Sc)、 urel(Ss) 及 u(Sw)按公式（6）進行合成，計算4種農(nóng)藥標準溶液配制過程中的相對標準不確定度urel(S)依 次為：敵敵畏urel(S,1) =3.28×10-2，樂果urel(S,2)=3.28×10-2，馬拉 硫磷 urel(S,3)=3.20×10-2，殺螟硫 磷

2.3.3 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(Cur)取1.2.2中配制的6個不同濃度水平的標準工作溶液上機測定，每個濃度測定2次，以標準溶液濃度X為橫坐標，以色譜峰面積Y為縱坐標，采用最小二乘法擬合，得到4種有機磷農(nóng)藥的線性回歸方程Y=AX+B（A為斜率，B為截距）和決定系數(shù)（R2）。根據(jù)測得的數(shù)據(jù)，按公式（7）和公式（8）計算由標準曲線擬合引入的標準不確定度u (Cur)和相對標準不確定度 urel(Cur)，結(jié)果見表4。從中可知，4種有機磷農(nóng)藥標準曲線擬合引入的相對標準不確定度均較大，在4.67×10-2～9.89×10-2之間，對合成不確定度的貢獻率達到62.0%～86.7%（圖1），是引起本方法測定時不確定度的主要因素，在實際測定工作中應進行重點控制。

圖 1 4種有機磷農(nóng)藥不確定度分量在合成不確定度中的占比Fig.1 The proportion of uncertainties of 4 organophosphorus pesticides in combined uncertainties

表 4 標準曲線擬合引入的不確定度Table 4 Uncertainties resulting from standard curve fitting

式中： SR為標準溶液中農(nóng)藥峰面積殘差的標準差，按公式（9）計算；A為擬合曲線的斜率；p為樣品平行測定次數(shù)，p=6；n為標準溶液測定總次數(shù)，本實驗中6個質(zhì)量濃度重復測定2次，n=12；為樣品溶液中農(nóng)藥的平均濃度，μg/mL；為標準溶液濃度的平均值；為標準溶液中農(nóng)藥濃度的測定值，μg/mL。

式中：B為擬合曲線的截距；A為擬合曲線的斜率；Yi,Std為標準溶液各濃度點對應農(nóng)藥的峰面積。

2.3.4 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(m) 稱取茶鮮葉樣品5.0 g，所用電子天平檢定證書上標明其稱量50 g以下質(zhì)量范圍的最大允差a為±0.05 g，天平去皮歸零后再稱量，操作兩次得到樣品的質(zhì)量，采用B類評定，按矩形分布，取包含因子（k）為，則由樣品稱量引入的標準不確定u (m)和相對標準不確定度urel(m)為：

依據(jù)檢定規(guī)程[31-32]對容量允差的規(guī)定，吸量管按三角形分布移液器按矩形分布實驗室的溫度為20 ℃，乙腈和丙酮的膨脹系數(shù)分別為1.37×10-3/℃和1.49×10-3/℃，室溫在±5 ℃范圍內(nèi)波動，按矩形分布計算各分量的相對標準不確定度，結(jié)果見表5。

根據(jù)吸量管和移液器的使用次數(shù)，樣品前處理引入的相對標準不確定度urel(V)為：

2.3.6 回收率引入的相對標準不確定度urel(R) 回收率作為衡量分析方法準確度的重要指標，無論檢測結(jié)果是否折算回收率，其對檢測結(jié)果的不確定度均存在顯著影響[33]。在茶鮮葉陰性樣品中加入4種有機磷農(nóng)藥混合標準溶液，進行6次添加回收試驗。采用A類評定，分別按公式（13）和公式（14）計算回收率引入的標準不確定度u (R)和 相對標準不確定度urel(R)，結(jié)果見表6。從表中可知：本文所用方法對茶鮮葉中4種有機磷農(nóng)藥測定的回收率在95.8%～100.5%之間，具有較好的準確度。由4種農(nóng)藥回收率引入的相對標準不確定度在7.31×10-3～9.90×10-3之間，其中樂果回收率引入的不確定度最大，不同農(nóng)藥回收率引入的不確定存在差異，這與測定方法中農(nóng)藥的提取凈化效率、樣品基質(zhì)及儀器測量狀態(tài)等影響因素有關。

表 5 前處理過程引入的不確定度Table 5 Uncertainty caused in sample pretreatment

表 6 茶鮮葉中4種有機磷農(nóng)藥的添加回收率和不確定度Table 6 Recovery and uncertainty of 4 organophosphorus pesticides spiked fresh tea leaves

2.3.7 儀器測定引入的相對標準不確定度urel(GC)利用氣相色譜儀測定茶鮮葉中4種有機磷農(nóng)藥的含量，根據(jù)儀器檢定證書，其定量重復性的相對標準偏差（RSD）為1.4%，采用B類評定，按矩形分布則氣相色譜儀測定引入的相對標準不確定度urel(GC)為：

2.4 相對合成標準不確定度urel(ω)

對上述各個相對標準不確定度分量進行匯總，結(jié)果見表7。由表7結(jié)果可見：A類評定時4種有機磷農(nóng)藥的不確定度分量存在差異，而B類評定時不確定度分量對所評定的4種農(nóng)藥基本一致，這是由于A類不確定度來自于系列測量結(jié)果的統(tǒng)計評定，而B類不確定度由儀器和設備的水平?jīng)Q定，與分析人員和測量次數(shù)無關。

表 7 各分量的相對標準不確定度Table 7 The relative standard uncertainty of each component

將各分量的相對標準不確定度代入公式（16）計算，則茶鮮葉中敵敵畏、樂果、馬拉硫磷、殺螟硫磷的相對合成標準不確定度urel(ω)分別為0.106、0.0929、0.0932、0.0593。

圖1為4種有機磷農(nóng)藥的不確定度分量在合成不確定度中的占比情況。從圖中可以看出，7種不確定分量對合成不確定度的貢獻存在較大差異，其中標準溶液配制、標準曲線擬合的不確定度占比總計達到90%以上，是合成不確定度的主要貢獻因子，而其它分量的不確定度貢獻較小可以忽略不計[34]?？梢姴捎帽痉椒y定茶鮮中4種有機磷農(nóng)藥時，標準溶液配制及標準曲線擬合是測定結(jié)果準確與否的關鍵。在實際檢測分析中，可采取使用精度更高的量器、簡化標準溶液的配制步驟、增加標準溶液的測定次數(shù)、選擇合適的標準曲線濃度范圍等措施，規(guī)避或減少由此引入的不確定度，從而提高結(jié)果的準確性。

2.5 擴展不確定度與檢測結(jié)果表示

依據(jù)JJF 1059.1-2012[30]，在置信概率P=95%時，取包含因子k=2，根據(jù)表1中4種有機磷農(nóng)藥含量測定的平均值，按公式（17）計算擴展不確定度U，4種有機磷農(nóng)藥在茶鮮葉中的擴展不確定度見表8。

從表中可知，4種有機磷農(nóng)藥的擴展不確定度在0.021～0.073 mg/kg之間，從高到低依次為樂果＞馬拉硫磷＞殺螟硫磷＞敵敵畏，其中樂果的擴展不確定度最大，這與其殘留含量最高有關。茶鮮葉中4種有機磷農(nóng)藥殘留量的檢測結(jié)果可表示為：敵敵畏：0.096±0.021 mg/kg，k=2；樂果：0.39±0.073 mg/kg，k=2；馬拉硫磷：0.19±0.036 mg/kg，k=2；殺螟硫磷：0.19±0.023 mg/kg，k=2。

表 8 茶鮮葉中4種有機磷農(nóng)藥的擴展不確定度Table 8 The expanded uncertainties of four organophosphorus pesticides in fresh tea leaves

3 結(jié)論

本文采用氣相色譜外標法測定茶鮮葉中4種有機磷農(nóng)藥殘留的含量，分析了該方法不確定度各個分量，對不確定度評定中的數(shù)學建模、分量計算及其合成與擴展等進行了研究。通過測定模擬陽性茶鮮葉樣品，當置信概率為95%（k=2）時，檢測結(jié)果可表示為：敵敵畏，0.096±0.021 mg/kg；樂果：0.39±0.073 mg/kg；馬 拉 硫 磷：0.19±0.036 mg/kg；殺 螟 硫 磷：0.19±0.023 mg/kg。

從評估結(jié)果可以看出，標準溶液的配制及標準曲線的擬合是該方法不確定度的主要影響因素，其他因素的影響較小，可以不予考慮。依據(jù)本研究結(jié)果，建議在采用該方法檢測茶鮮葉中有機磷農(nóng)藥時，應重點關注標準溶液的相關操作過程，通過使用精度更高的量器、簡化標準溶液的配制步驟、增加標準溶液的測定次數(shù)、選擇合適的標準曲線濃度范圍等措施降低檢測結(jié)果的不確定度。該評定結(jié)果為客觀評價檢測方法和結(jié)果的可靠性與準確性提供了參考。