李曉貞，陳 旭，楊傅佳，黃 丹，黃建聯(lián)，劉永樂，汪少蕓,2,

（1.福州大學生物科學與工程學院，福建福州 350108；2.福州海洋研究院食品研發(fā)中心，福建福州 350108；3.福建省冷凍調理水產品加工重點實驗室，福建廈門 361022；4.安井食品集團股份有限公司，福建廈門 361022；5.長沙理工大學食品與生物工程學院，湖南長沙 410114）

冷凍貯藏技術被廣泛用于魚糜制品的長期儲存[1-2]，但在實際生產中，冷凍設備不穩(wěn)定、運輸步驟多等因素可能導致魚糜在運輸和儲存過程中出現(xiàn)反復凍融現(xiàn)象[3]，該現(xiàn)象會加速魚糜品質劣變，嚴重破壞魚糜制品風味、質地和功能特性[1]。添加低溫保護劑可最大限度降低魚糜凍藏品質的劣變，食品行業(yè)中的低溫保護劑主要包括蔗糖、山梨醇、磷酸鹽等[4]，其中，4%蔗糖和4%山梨醇的組合被稱為商業(yè)抗凍劑（SUSO），因其價格低廉、抗凍效果好，成為冷凍魚糜中最常用的抗凍劑[5]，但過量攝入添加了商業(yè)抗凍劑的冷凍魚糜會使消費者間接攝入過量糖分，給消費者的健康帶來隱患[4,6]，因此，需尋找可替代商業(yè)抗凍劑的低溫保護劑。

研究表明，魚糜凍藏品質劣變的根本原因是凍藏過程中冰晶導致魚糜蛋白質的冷凍變性[1,7]，因此，抑制魚糜冷凍過程中的冰晶生長和重結晶，是提升魚糜及魚糜制品加工與貯藏品質的關鍵。抗凍多肽在抑制冰晶生長和重結晶方面具有良好效果[8-10]，且安全、營養(yǎng)價值高，有望成為魚糜及魚糜制品冷凍加工與貯藏更為理想的新型冷凍保護劑。抗凍多肽多以食用膠原蛋白、明膠[11]或動物皮[10,12-14]、魚鱗[15]、動物肌腱等加工副產物通過生物酶解技術獲取具有特異性的高活性多肽片段。白鰱魚作為四大家魚之一，也是養(yǎng)殖產量最高的淡水魚之一，2020年全國白鰱魚養(yǎng)殖產量為381.03萬噸，占全國淡水養(yǎng)殖產量12.6%[16]。在其精加工過程中，會產生大量的魚鱗廢棄物，約占魚體總重2%～5%[17]，造成嚴重的資源浪費與環(huán)境污染，而白鰱魚鱗自身富含50%～80%優(yōu)質蛋白質[18]，正是制備抗凍多肽良好的來源。因此，本研究利用生物酶解技術制備白鰱魚鱗抗凍多肽（ScAFPs），通過單因素、響應面優(yōu)化試驗研究其最佳制備工藝，表征ScAFPs基本性質并將其應用于凍融魚糜的低溫保護中，探究ScAFPs對凍融魚糜凝膠特性的影響，為ScAFPs作為低溫保護劑應用于魚糜及魚糜制品冷凍貯藏奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白鰱魚鱗 安井食品集團股份有限公司提供；體重約1.5 kg左右新鮮草魚 購自福建永輝超市；嗜熱鏈球菌 上海交通大學農業(yè)與生物學院提供；復合風味蛋白酶（20 U/mg） 廣州市華琪生物技術有限公司；木瓜蛋白酶（2000 U/mg） 北京博奧拓達科技有限公司；胰蛋白酶（250 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；中性蛋白酶（100 U/mg） 諾維信（中國）生物技術有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg） 大連美侖生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

LDZF-50L立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；YC-S30水浴恒溫震蕩搖床、SY-550B全溫型恒溫培養(yǎng)搖床 天津市泰斯特儀器有限公司；752紫外可見分光光度計 上海安亭科學儀器廠；Waters 1525高效液相色譜儀 美國Waters公司；ZEN3600納米粒度電位儀 英國Malvern公司；Fluoro Max-4熒光分光光度計 美國HORIBA公司；DSC214差示掃描量熱儀 德國耐馳儀器制造公司；ADCI-60-C色差儀 北京辰泰克儀器技術有限公司；TA.XT PLUS型質構儀 英國SMS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白鰱魚鱗預處理及基本成分測定 新鮮的白鰱魚鱗經(jīng)清水洗凈，瀝干水分后置于50 °C電熱鼓風干燥箱中烘6～8 h，然后用粉碎機將魚鱗粉碎過80目篩后備用。白鰱魚鱗水分、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪含量分別參照GB 5009.3-2016、GB 5009.4-2016、GB 5009.5-2016、GB 5009.6-2016進行測定。

1.2.2 ScAFPs的制備工藝優(yōu)化

1.2.2.1 白鰱魚鱗酶解液制備 粉碎后的白鰱魚鱗中加入適量蒸餾水，將其超聲（50 °C，200 W）處理90 min后再進行60 min高溫高壓處理（121 °C，0.1 MPa），待混合液冷卻至室溫后調節(jié)其pH至相應蛋白酶最適pH，添加適量蛋白酶混合均勻，迅速放置于水浴恒溫震蕩搖床中酶解一定時長后進行沸水浴滅酶10 min，最后待酶解液冷卻至室溫后離心（4 °C，10000 r/min）10 min，取上清液，上清液即為白鰱魚鱗酶解液。

1.2.2.2 單因素實驗 以嗜熱鏈球菌低溫存活率為主指標，水解度（DH）為輔助指標，對ScAFPs酶解工藝進行單因素實驗，依次按照蛋白酶、底物濃度、酶底比、酶解時間的篩選順序進行實驗，每次實驗嚴格控制單一變量。篩選蛋白酶時，設置酶解初始條件為：底物濃度3%（w/v），酶底比5%（w/w），酶解時間6 h，隨后根據(jù)每次篩選結果對初始條件中的相應因素條件替換后，再進行下一因素的篩選。各因素變量分別為：蛋白酶種類選取復合風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，這5種蛋白酶最適pH與溫度分別為：7.0，50 °C；8.0，37 °C；8.0，37 °C；7.0，50 °C；8.0，50 °C；底物濃度選取1%、2%、3%、4%、5%（w/v）；酶底比選取1%、3%、5%、7%、9%（w/w）；酶解時間選取1、2、3、4、5、6、7 h。

1.2.2.3 響應面優(yōu)化試驗 在單因素實驗結果的基礎上，對ScAFPs酶解制備工藝進行響應面優(yōu)化試驗。選擇A：底物濃度（%）、B：酶底比（%）、C：酶解時間（h）三個因素，以嗜熱鏈球菌存活率為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken design模型設計響應面試驗方案，其因素水平表如表1所示。

表 1 因素水平編碼表Table 1 Factor level coding table

1.2.2.4 嗜熱鏈球菌存活率測定 取200 μL二次活化的嗜熱鏈球菌菌液至20 mL M17液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 h后取4 mL菌液離心（4 °C，5000 r/min）10 min，去除上清液，再加入4 mL生理鹽水洗滌離心（4 °C，5000 r/min）10 min后保留菌泥，該步驟重復兩次，最后將菌泥重懸于8 mL生理鹽水中。取60 μL重懸的菌液分別與540 μL的生理鹽水（空白對照組）和魚鱗酶解液混合均勻，魚鱗酶解液預先使用0.22 μm濾菌膜過濾，然后吸取50 μL于4 mL M17液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 h，利用紫外分光光度計檢測600 nm處的吸光值A0。將剩余混合菌液放入-20 °C冰箱冷凍24 h，在冷凍的前4 h內，每隔2 h進行一次凍融循環(huán)（37 °C水浴，10 min）。冷凍24 h后將菌液水浴解凍（37 °C ，10 min），再次取50 μL接種培養(yǎng)7 h后測吸光值A1。嗜熱鏈球菌的低溫存活率計算公式為：

式中：A0：冷凍前菌液600 nm處的OD值；A1：冷凍后菌液600 nm處的OD值。

1.2.2.5 水解度（DH）的測定 采用甲醛滴定法，首先在100 mL燒杯中加入2.5 mL酶解液和30 mL蒸餾水混合均勻，將混合液與甲醛溶液的pH均調至8.2，往混合液中加入10 mL甲醛溶液，然后用0.02 mol/L氫氧化鈉標準溶液將所混合的溶液滴定至9.2，記錄下所消耗氫氧化鈉的體積△V，參照LIN等[19]的方法計算DH。

1.2.3 白鰱魚鱗抗凍多肽基本性質表征 根據(jù)響應面試驗優(yōu)化的ScAFPs最佳制備工藝條件，制備得到液態(tài)ScAFPs，將其凍干后置于-20 °C冰箱中備用。

1.2.3.1 肽基本成分的測定 ScAFPs中的多肽含量參照劉聃等[20]的方法稍作修改后測定，首先向酶解制備所得的ScAFPs溶液中按照1:1的比例添加10%三氯乙酸溶液（去離子水配制），混合均勻后靜置10 min，離心（4 °C，10000 r/min）10 min后，取上清液凍干成粉末，參照GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法測定多肽含量。ScAFPs中水分與粗灰分含量測定分別參照GB 5009.3-2016 中直接干燥法和GB 5009.4-2016中食品總灰分的測定。

1.2.3.2 分子量分布 將ScAFPs配制成20 mg/mL的水溶液，選用TSK-Gel-G2000SWXL凝膠色譜柱，進樣量為10 μL，流速為0.5 mL/min，利用WatersTM650E高級蛋白質純化系統(tǒng)的高效液相色譜儀進行分子量分布測定[19]。

1.2.3.3 表面疏水性測定 通過8-苯胺基-1-萘磺酸銨（ANS）熒光探針測定ScAFPs的表面疏水性，具體測定方法參照曾茂茂等[21]的方法稍作修改。利用PBS（0.1 mol/L、pH7.0），分別配制8 mmol/L ANS溶液、100 μg/mL BSA溶液和100 μg/mL ScAFPs溶液。以牛血清蛋白（BSA）為對照，利用PBS分別將BSA與ScAFPs溶液稀釋成梯度濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL的樣品溶液。各取梯度稀釋后的樣品溶液4 mL，加入20 μL ANS溶液混合均勻后，立即使用熒光分光光度計測定其熒光強度。儀器參數(shù)條件設置為：激發(fā)波長374 nm、狹縫校正寬度5 nm；發(fā)射波長485 nm、狹縫校正寬度5 nm；靈敏度為2。樣品表面疏水性值以樣品濃度（橫坐標）和熒光強度（縱坐標）擬合的線性方程的斜率表示。

1.2.3.4 等電點測定 ScAFPs的等電點利用納米粒度電位儀進行測定。首先使用去離子水配制1 mg/mL ScAFPs溶液，用0.1 mol/L鹽酸將其pH分別調節(jié)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0與8.0后在25 °C下測定其Zeta電位，上樣量為1 mL。將各pH與相對應的Zeta電位值繪制成折線圖，當多肽樣品溶液Zeta電位為0時，說明此時溶液的pH在等電點附近。

1.2.3.5 熱穩(wěn)定性測定 稱取適量ScAFPs樣品，使用無菌水配制15 mg/mL ScAFPs溶液，用0.22 μm濾菌膜過濾后分裝4份于玻璃試管中，將其用封口膜封口后置于沸水浴中分別加熱0、10、20、30 min，冷卻至室溫后，按照實驗方法1.2.2.4測定其嗜熱鏈球菌低溫存活率。

1.2.3.6 熱滯活性（THA）測定 ScAFPs的THA測定參照WU等[22]的方法稍作變化，用去離子水配制15 mg/mL BSA溶液（對照組）與ScAFPs溶液，使用帶有Proteus熱分析軟件的差示掃描量熱儀測定其THA，上樣量為5 μL。a：選取測定過程中的保留溫度：將樣品置于10 °C中保溫5 min后，以-2 °C/min的速率使樣品由10 °C降至-30 °C，平衡5 min，使樣品全部結冰，然后根據(jù)DSC曲線選取保留溫度（Th1：-0.5 °C、Th2：0 °C和Th3：0.3 °C）；b：測定過程的溫度梯度流程設定為：以-2 °C/min速率降溫至-30 °C，平衡5 min，樣品全部結冰；以2 °C/min升溫/降溫速率在保留溫度與-10 °C之間凍融循環(huán)，每個保留溫度下恒溫5 min。使用Proteus熱分析軟件計算樣品的熔化焓（ΔHm）、結晶開始溫度（T0）和放熱焓（ΔHf），THA與樣品中冰的含量（φ）計算公式如下：

式中：Th：保留溫度，°C；T0：結晶開始溫度，°C；ΔHf：樣品放熱焓，J/g；ΔHm：樣品熔化焓，J/g。

1.2.4 魚糜的制備 新鮮草魚擊暈后，去除頭部、魚鱗、內臟、魚皮與紅肉，取白色魚肉沖洗干凈，用絞肉機將其粉碎成魚糜。按照LIN等[23]所描述的方法洗滌魚糜，以1:3（w/v）的比例往魚糜中加入去離子水（4 °C），用電動攪拌器勻速攪拌10 min，然后離心（4 °C，6000 r/min）5 min，倒出上清液，該清洗過程重復兩次。將洗滌兩遍后的魚糜重新分散在3倍體積的0.5%氯化鈉溶液中（4 °C），攪拌10 min，離心（4 °C，6000 r/min）15 min脫水后即得到草魚魚糜。

1.2.5 魚糜樣品的處理及凍融循環(huán)處理 將制備所得的草魚魚糜平均分為六部分，分別在魚糜中加入0%、2%、4%、6%、8% ScAFPs和8% SUSO（w/w），其中，0% ScAFPs魚糜組為空白對照組，8% SUSO作為陽性對照組。每組樣品用手動攪拌器勻速攪拌5 min以確保添加劑和魚糜混合均勻。各魚糜樣品組均經(jīng)過5次凍融循環(huán)，每次循環(huán)在-20 °C冷凍72 h后于25 °C解凍1 h。新鮮未凍藏樣品立即進行指標測定，經(jīng)過冷凍的樣品于每次解凍后進行指標測定。

1.2.6 魚糜凝膠的制備 在新鮮或解凍后的魚糜樣品中加入2%氯化鈉（w/w），利用研砵研磨3 min，攪拌均勻，制得魚糜溶膠，將魚糜溶膠塞進預先切掉頭部的5 mL注射器，避免魚糜溶膠在注射器中產生空隙而影響后續(xù)實驗，然后用保鮮膜將注射器兩端封緊，利用兩段加熱法（40 °C 30 min，90 °C 30 min）制備魚糜凝膠。加熱結束后的魚糜凝膠立即放置于冰水中冷卻15 min，并在4 °C保存以供進一步分析。分析魚糜凝膠特性前，將制備所得的魚糜凝膠切成1 cm高的圓柱體。

1.2.7 白度的測定 在室溫中利用色差儀測定魚糜凝膠L*、a*、b*值，每組樣品測4次平行，結果取平均值，白度計算公式如下[24]：

式中：W：樣品的白度；L*：樣品的亮度；a*：樣品顏色的紅綠值；b*：樣品顏色的黃藍值。

1.2.8 質構特性（TPA）的測定 參照YE等[24]的方法稍作修改。利用質構儀測定魚糜凝膠TPA，設定參數(shù)為：探頭P/36R，測前速度5.00 mm/s，測中速度1.00 mm/s，測后速度10.00 mm/s，觸發(fā)力5.0 g，壓縮比40.0%。選擇硬度、咀嚼性、彈性與粘黏性作為檢測指標。

1.2.9 凝膠強度的測定 參照LIU等[25]的方法稍作修改。利用質構儀測定魚糜凝膠強度，參數(shù)設定為：探頭P/0.5，測前速度5.00 mm/s，測中速度1.00 mm/s，測后速度10.00 mm/s，觸發(fā)力20.0 g，壓縮比50.0%。凝膠強度試驗曲線上第一個峰對應的力和距離分別是破斷力與斷裂距離，破斷力可反映凝膠硬度，斷裂距離則反映凝膠彈性，凝膠強度大小為二者乘積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2021軟件作圖，實驗數(shù)據(jù)結果均以平均值±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05作為差異顯著。DSC數(shù)據(jù)利用NETZSCH Proteus Analysis軟件進行分析處理。使用Origin 2021軟件的Principal Component Analysis、Multivariate Analysis對魚糜凝膠白度、質構特性（硬度、咀嚼性、彈性、粘黏性）與凝膠強度指標進行PCA主成分分析與聚類分析。

2 結果與分析

2.1 白鰱魚鱗基本成分

由表2可知，白鰱魚鱗富含蛋白質，脂肪含量較低。白鰱魚鱗主要由蛋白質和灰分組成，占魚鱗干重的87.51%左右，其中粗蛋白含量為64.78%±0.15%，該結果表明白鰱魚鱗是制備膠原基多肽的理想原料。

表 2 白鰱魚鱗的基本成分（%，w/w，干基）Table 2 The basic components of sliver carp scales (%, w/w, dry basis)

2.2 ScAFPs的制備工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗分析 以嗜熱鏈球菌凍融存活率和DH為雙指標，對ScAFPs酶解制備工藝中常見蛋白酶制劑種類、底物濃度、酶底比及酶解時間這4個因素進行篩選，其篩選結果如圖1所示。圖1a所示，利用胰蛋白酶制備的酶解液抗凍活性最強，其嗜熱鏈球菌凍融脅迫后存活率為81.56%±4.50%；因此選取胰蛋白酶進行后續(xù)實驗。在確定酶種類后，依次對底物濃度、酶底比、酶解時間進行分析，其結果分別如圖1b、1c、1d所示。酶解液的抗凍活性隨著底物濃度、酶底比以及酶解時間的變化而變化，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，根據(jù)以嗜熱鏈球菌低溫存活率為主指標的原則，選取底物濃度4%（w/v）、酶底比3%、酶解時間3 h進行后續(xù)實驗，因為此時嗜熱鏈球菌存活率最高，酶解液的抗凍活性最強。

圖 1 各因素對嗜熱鏈球菌低溫存活率和DH的影響Fig.1 Effects of various factors on low temperature survival rate of S. thermophilus and DH

2.2.2 響應面優(yōu)化試驗分析 在單因素基礎上，以嗜熱鏈球菌凍融后存活率為響應值，對底物濃度、酶底比和酶解時間進行響應面優(yōu)化，結果如表3所示。

表 3 響應面試驗設計方案與結果Table 3 Experimental design and results of response surface methodology

通過回歸模擬方差分析結果（表4）可知，底物濃度（A）對響應值嗜熱鏈球菌存活率的影響顯著（P＜0.01），酶底比（B）對響應值嗜熱鏈球菌存活率的影響極顯著（P＜0.001），而酶解時間（C）對響應值嗜熱鏈球菌存活率的影響不顯著（P＞0.05）。嗜熱鏈球菌存活率隨著底物濃度、酶底比和酶解時間變化得到擬合回歸方程：嗜熱鏈球菌存活率=72.57+4.22×A+14.66×B+1.73×C-4.91×AB+5.39×AC-1.73×BC+8.04×A2-11.14×B2-12.08×C2。根據(jù)表4回歸模型的方差分析結果可知，回歸模型極顯著（P＜0.001），失擬項不顯著（P＞0.05），R2為0.9795，說明該模型擬合較好，可用于ScAFPs制備工藝參數(shù)預測。

表 4 回歸模型的方差分析（嗜熱鏈球菌存活率為響應值）Table 4 Variance analysis of the regression mode (survival rate of S. thermophilus as response value)

響應面試驗預測得到理論最佳條件為：底物濃度5.0%，酶底比3.8%，酶解時間3.5 h，在該條件下預測嗜熱鏈球菌存活率87.81%。對響應面試驗結果得到的理論最佳酶解工藝參數(shù)（底物濃度5.0%，酶底比3.8%，酶解時間3.5 h）進行驗證，測得該條件下制得的酶解液對嗜熱鏈球菌冷凍存活率為82.19%±1.03%，與理論預測值87.81%之間無明顯差異，說明響應面優(yōu)化結果可靠。因此，以底物濃度5.0%，酶底比3.8%，酶解時間3.5 h為制備ScAFPs最佳酶解工藝參數(shù)，在此條件下的DH為7.54%±0.43%。

2.3 ScAFPs的基本性質分析

2.3.1 基本成分分析 由表5可知，ScAFPs中多肽含量為93.30%±1.57%，水分和粗灰分含量分別為3.50%±0.00%和2.84%±0.01%，說明ScAFPs的多肽含量超過90%，可用于后續(xù)研究。

表 5 ScAFPs基本成分（%，w/w，干基）Table 5 The basic components of ScAFPs (%, w/w, dry basis)

2.3.2 分子量分布 利用HPLC法測定ScAFPs的相對分子質量分布，其結果如圖2所示。由圖可知ScAFPs的相對分子質量主要集中在180～3000 Da之間，占總量的78.95%，其中180～1000 Da之間占42.54%。說明ScAFPs主要是由2～10個氨基酸組成的小肽組成。以上結果與目前國內外關于水解抗凍肽分子質量分布趨勢一致[7,26]。

圖 2 ScAFPs的分子量分布Fig.2 The molecular weight distribution of ScAFPs

2.3.3 表面疏水性 通過ANS法對ScAFPs的親疏水性進行分析，擬合出來的線性方程的斜率越大表示疏水性越大，而其親水性越弱[27]。圖3結果表明，ScAFPs的疏水性值為41.1199，而BSA標品的疏水值為1513.6502，說明ScAFPs較BSA標準品是一種具有較強親水性的多肽。根據(jù)CHEN等[7]報道，食源性抗凍肽通常具有較強的親水性，抗凍肽富含的親水基團可以維持其與冰晶結合的穩(wěn)定性。此外，魚糜在冷凍貯藏過程中由于冰晶生長導致的魚糜肌原纖維蛋白結合水解離，造成魚糜肌原纖維蛋白外部水化層被破壞，從而影響魚糜的凝膠性，而商業(yè)抗凍劑主要是通過其富含的親水基團以維持魚糜肌原纖維蛋白外部水化層的穩(wěn)定性，從而起到對魚糜的冷凍保護作用[6]。以上結果說明，ScAFPs具有與食源性抗凍肽類似的特點，且其強親水性特點具有作為冷凍保護劑應用于魚糜冷凍貯藏的潛質。

2.3.4 等電點 ScAFPs的等電點測定結果如圖4所示。等電點可以反映體系的穩(wěn)定性，由圖可知，ScAFPs的等電點在4.2左右，而魚糜的pH通常在6.0～8.0之間[28]，說明ScAFPs適用于魚糜體系，可以避免多肽的聚集沉淀而影響其抗凍活性。

圖 3 cAFPs的表面疏水性Fig.3 The surface hydrophobicity of ScAFPs

圖 4 cAFPs的Zeta電位分析Fig.4 Zeta potential analysis of ScAFPs

2.3.5 熱穩(wěn)定性 ScAFPs的熱穩(wěn)定性測定結果如表6所示。經(jīng)過沸水處理30 min后，ScAFPs對嗜熱鏈球菌凍融后的存活率為73.85%±4.22%與未經(jīng)過沸水處理組的76.57%±1.91%無顯著性差異（P＞0.05）。說明ScAFPs具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.3.6 熱滯活性 當AFPs吸附于冰水界面時，造成冰晶生長軌跡發(fā)生改變，導致冰水界面蒸汽壓升高使得溶液冰點與熔點之間形成差值，而THA的高低可以通過這個溫度差值體現(xiàn)[8-10]。通過DSC對ScAFPs的THA及不同保留溫度下凍融過程的冰晶含量進行分析。由圖5可知，與標準蛋白BSA組相比，ScAFPs組在相同保留溫度下降溫過程中的熱流圖出現(xiàn)一定的滯后現(xiàn)象。進一步通過NETZSCH Proteus Analysis軟件對熱流圖進行積分計算，得到表7數(shù)據(jù)。由表可以發(fā)現(xiàn)，在較低的保留溫度下，雖然BSA組與ScAFPs組的THA均較低，但是含有ScAFPs的體系中冰晶含量顯著降低。且當保留溫度為0.3 °C時，ScAFPs組的THA為1.1 °C，顯著高于BSA組的0.3 °C。以上結果表明，雖然ScAFPs在較低的保留溫度下其THA較低，但是能顯著降低體系中的冰晶含量，從而發(fā)揮抗凍效果。

表 6 ScAFPs的熱穩(wěn)定性分析Table 6 Thermal stability analysis of ScAFPs

圖 5 ScAFPs在不同保留溫度下的DSC熱流圖Fig.5 DSC curves of ScAFPs at different retention temperatures

表 7 ScAFPs在不同保留溫度下的熱力學特性Table 7 Thermodynamic characteristics of ScAFPs at different retention temperatures

2.4 ScAFPs對凍融魚糜凝膠特性的影響

2.4.1 白度 白度作為衡量冷凍魚糜色澤的重要依據(jù)，是判定魚糜品質好壞最直觀的指標之一。不同添加量ScAFPs對凍融魚糜凝膠白度的影響如表8所示。由表8可知，空白對照組的魚糜凝膠初始白度值略高于其余各組處理組魚糜，這是由于ScAFPs與商業(yè)抗凍劑自身的白度值略差于新鮮魚糜的白度，其中2%、4% ScAFPs處理組魚糜的凝膠白度值與空白對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），6%、8%ScAFPs處理組魚糜的凝膠白度值與商業(yè)抗凍劑處理組相比無顯著性差異（P＞0.05），這說明2%～8%ScAFPs添加量對魚糜凝膠初始白度值的影響在可接受范圍內。在凍融循環(huán)過程中，魚糜的色澤會逐漸變差，僅經(jīng)歷1次凍融循環(huán)處理，空白對照組的白度值便低于2%、4% ScAFPs處理組魚糜；經(jīng)過5次凍融循環(huán)后，空白對照組的魚糜白度值較初始值下降7.52%，變化幅度最大，商業(yè)抗凍劑組的魚糜白度值較初始值下降4.95%，而2%、4% ScAFPs處理組魚糜僅下降2.84%與2.80%，6%與8% ScAFPs處理組魚糜的白度值與初始值相比均無顯著變化（P＞0.05）。以上結果證明了ScAFPs可以有效保護魚糜的白度，并且與商業(yè)抗凍劑相比，ScAFPs對魚糜初始白度值影響更小，保護效果更佳，說明ScAFPs對魚糜制品的后續(xù)深加工應用前景更廣闊。

2.4.2 TPA 為了評估ScAFPs對凍融魚糜凝膠結構的保護作用，測定了魚糜凝膠的質構特性，選取硬度、咀嚼性、彈性和粘黏性四個指標進行分析（表9）。由表可知，添加ScAFPs或商業(yè)抗凍劑處理組的魚糜凝膠初始硬度、咀嚼性、粘黏性較空白對照組有所下降（P＜0.05），JITTINANDANA等[29]與KORZENIOWSKA等[30]研究均指出添加商業(yè)抗凍劑可以導致魚糜凝膠硬度下降而使其質地變得更柔軟，這說明ScAFPs與商業(yè)抗凍劑一樣具有提高魚糜質地柔軟度與彈性的作用。經(jīng)過1次凍融時，空白對照組的魚糜凝膠咀嚼性與粘黏性突增，彈性值突降，這有可能是魚糜在冷凍過程中冰晶對蛋白質的損傷與蛋白質聚集、變性所導致的[31]，相較于空白對照組，ScAFPs與商業(yè)抗凍劑處理組的添加使魚糜質構在凍融處理條件下表現(xiàn)更穩(wěn)定。而經(jīng)過5次凍融后，空白對照組魚糜所制備的凝膠硬度、咀嚼性、粘黏性均下降最多，與初始值相比，分別下降了36.86%、40.13%與6.45%，添加了2%～8% ScAFPs與商業(yè)抗凍劑處理組魚糜的凝膠硬度及咀嚼性與各自初始值相比，分別下降了27.62%、32.52%、31.16%、28.55%、32.06%和22.69%、31.07%、29.79%、26.02%、26.94%。以上結果說明，ScAFPs與商業(yè)抗凍劑對魚糜凝膠硬度與咀嚼性的下降具有抑制作用。

表 8 凍融循環(huán)中ScAFPs對魚糜凝膠白度的影響Table 8 Effects of ScAFPs on whiteness of surimi gel during freeze-thaw cycles

表 9 凍融循環(huán)中ScAFPs對魚糜凝膠質構特性的影響Table 9 Effects of ScAFPs on gel texture properties of surimi during freeze-thaw cycles

2.4.3 凝膠強度 魚糜凝膠強度可以客觀反應凝膠三維網(wǎng)絡結構的聚集程度，從而評價魚糜制品的品質[32]。ScAFPs添加量對凍融魚糜的凝膠破斷力、斷裂距離以及凝膠強度的影響如圖6所示。從圖中可以看出，與空白對照組相比，ScAFPs或商業(yè)抗凍劑的添加對魚糜凝膠初始破斷力、斷裂距離以及凝膠強度均無顯著影響（P＞0.05），結合表9凝膠質構特性初始值分析，說明ScAFPs與商業(yè)抗凍劑僅改變魚糜凝膠質地的柔軟度而不影響魚糜凝膠的成膠性。隨著凍融處理次數(shù)的增加，各組魚糜樣品組的凝膠破斷力、凝膠強度整體呈現(xiàn)下降趨勢，斷裂距離呈上升趨勢，這意味著凍融使魚糜蛋白發(fā)生冷凍變性，導致魚糜凝膠性能變差。經(jīng)過5次凍融處理后，空白對照組魚糜的凝膠強度從2535.43下降至1525.07 g·mm，降低了39.85%，而2%、4%、6%、8% ScAFPs與商業(yè)抗凍劑處理組魚糜僅分別下降4.05%、5.01%、4.11%、15.64%和14.90%，由此可見，ScAFPs比商業(yè)抗凍劑對凍融魚糜的凝膠性能保護效果更佳，僅添加2%ScAFPs就可以很好的保護魚糜在凍融條件下保持良好的凝膠性，但8% ScAFPs處理組魚糜對魚糜凝膠的低溫保護效果略微有所下降，這可能是因為過量的ScAFPs會阻礙肌原纖維蛋白交聯(lián)，ScAFPs中含有較多小分子游離氨基酸，過高的添加量會導致魚糜體系中存在高濃度的游離氨基酸，這將有所抑制魚糜蛋白形成凝膠網(wǎng)絡結構[33]。

2.5 PCA主成分分析

對不同處理組魚糜的凝膠特性指標進行PCA主成分分析，得到凍融循環(huán)期間各處理組魚糜的魚糜凍藏品質有關指標的線性組合并將其投射到二維平面上（圖7a）。從圖中可以看出，第一主成分（PC1）可以解釋50.0%的總方差，第二主成分（PC2）解釋28.7%的總方差，表明數(shù)據(jù)中78.7%的總方差由前兩個主成分解釋。PC1除了與彈性呈負相關作用，與其余指標均呈正相關作用。PC2與白度、硬度、彈性、凝膠強度呈正相關關系，與咀嚼性、粘黏性呈負相關關系。

圖 6 凍融循環(huán)中ScAFPs對魚糜凝膠強度的影響Fig.6 Effects of ScAFPs on gel strength of surimi during freeze-thaw cycles

圖7b顯示了在二維空間中使用PC1和PC2作為負荷因子的不同處理組的預測得分圖，將圖7b中的樣品位置映射于圖7a中，推斷位于象限1、2、3和4的指標與相應象限中的樣品相關[34]。從圖中可以看出，空白對照組除了新鮮魚糜樣品（0-0）分布在第1象限，一次凍融的樣品（0-1）最接近咀嚼性與粘黏性，說明空白對照組魚糜樣品經(jīng)1次凍融后對凝膠的咀嚼性與粘黏性影響較大，其余樣品主要分布第4象限，隨著凍融次數(shù)的增加，樣品遠離各項指標距離變大，說明凍融處理對空白對照組魚糜凝膠特性影響很大。而ScAFPs與商業(yè)抗凍劑處理組魚糜樣品主要分布于靠近象限中心的第1、2象限中，與凝膠特性各指標的直線距離小于空白對照組?；谝陨辖Y果，說明凍融循環(huán)期間，空白對照組魚糜凝膠特性被嚴重破壞，添加ScAFPs與商業(yè)抗凍劑有效保護魚糜凍藏期間的凝膠特性。此外，商業(yè)抗凍劑與2%ScAFPs的位置最接近，說明就整體而言，2% ScAFPs的抗凍效果就與商業(yè)抗凍劑相似。

圖 7 凍融循環(huán)中ScAFPs對魚糜凝膠特性的PCA分析Fig.7 PCA analysis of gel characteristics of surimi by ScAFPs during freeze-thaw cycles

2.6 聚類分析

將凍融期間的各處理組魚糜樣品進行聚類分析，如圖8所示。從圖中可以看出，魚糜主要被分為5類。第1類將0-0、0-1聚為一類；2-0、2-1、2-2、2-3、2-4、4-0、4-1、4-2、4-4、6-0、6-1、6-2、8-0、8-1、s-0、s-1、s-2聚為第2類；0-2、2-5、4-3、4-5、6-3、6-4、6-5、8-2、8-3、8-4、8-5、s-3、s-4、s-5聚 為 第3類；0-3被單獨聚為第4類；0-4、0-5聚為第5類，該結果表明空白對照組與添加抗凍劑樣品組差異明顯。從第3類中可以看出，空白對照組僅經(jīng)過第二次凍融（0-2）的魚糜凝膠特性與添加2% ScAFPs經(jīng)5次凍融、4%、6%、8% ScAFPs及商業(yè)抗凍劑的魚糜樣品經(jīng)2～5次凍融后的凝膠特性相似，說明添加ScAFPs或商業(yè)抗凍劑的冷凍魚糜可以有效保護凍融魚糜凝膠特性。此外，從第2類分類中可以得知，ScAFPs添加量為2%、4%對凍融魚糜的凝膠特性較高添加量6%、8%及商業(yè)抗凍劑的效果好，說明在魚糜低溫保護應用中，不宜添加含量過高的ScAFPs。

圖 8 不同凍融循環(huán)魚糜樣品組的聚類分析Fig.8 Cluster analysis of surimi samples with different freeze-thaw cycles

3 結論

本研究優(yōu)化得到ScAFPs最佳酶解制備工藝，并探究了ScAFPs對凍融魚糜的凝膠特性的影響。研究結果表明，用胰蛋白酶在最佳酶解制備工藝參數(shù)（底物濃度5.0%、酶底比3.8%、酶解溫度37 °C、酶解時間3.5 h）下制備得到的ScAFPs的多肽含量為93.30%±1.57%，等電點為4.2左右，相對分子量在180～3000 Da之間的含量占總含量的78.95%，且ScAFPs還具有極強的親水性和較好的熱穩(wěn)定性，并且能有效降低體系冰晶含量。而ScAFPs對凍融魚糜的凝膠特性綜合分析，結果表明對照組（未添加低溫保護劑的魚糜）在經(jīng)過5次凍融循環(huán)后，其色澤、硬度、咀嚼性、凝膠強度較初始值各下降7.52%、36.86%、40.13%與40.05%，而添加2% ScAFPs對凍融魚糜凝膠特性具有良好保護作用，較初始值僅下降2.84%、27.62%、22.69%、4.05%，且效果優(yōu)于商業(yè)抗凍劑（4.95%、32.06%、26.94%、14.90%）。通過PCA與聚類分析，進一步闡明ScAFPs對凍融魚糜凝膠具有良好的冷凍保護效果。以上研究結論說明，ScAFPs具有作為新型魚糜低溫保護劑的潛力。