郭元新，郭 宇，朱 鳳，張 瑤，王東旭，葉 華，俞 玥

（江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

麥胚是面粉加工的副產(chǎn)品[1]，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、維生素、谷胱甘肽、黃酮類物質(zhì)、脂多糖及甾醇等多種營養(yǎng)物質(zhì)[2-4]。麥胚中蛋白含量高達30%左右，麥胚蛋白多為完全蛋白，含有人體必需的8種氨基酸，被認為是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源[5-7]。但通常麥胚被當作飼料廉價出售，得不到合理利用。研究人員發(fā)現(xiàn)，麥胚水解產(chǎn)生多種功能肽[8]，可降低膽固醇、調(diào)節(jié)血壓、預(yù)防心血管疾病等[9-12]。麥胚中的肽水溶性較好、熱穩(wěn)定性強、耐酸堿能力強，通常可以作為抗氧化肽、降血糖肽、谷胱甘肽和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽等功能因子被添加到食品中[13]。

國內(nèi)外通常采用微生物發(fā)酵法、外源酶水解法和內(nèi)源酶水解法等生物技術(shù)來富集麥胚蛋白中的肽，以實現(xiàn)麥胚中肽的高值化利用[10]。其中微生物發(fā)酵法制備的肽適口性較好，但可用微生物菌種較少且不適用于所有肽的制備。利用外源蛋白酶水解麥胚蛋白，產(chǎn)物得率較高，但生產(chǎn)成本高，水解產(chǎn)物含有多種疏水性苦味肽[12,14,15]，影響產(chǎn)品的風味和口感。麥胚的主要內(nèi)源蛋白酶有半胱氨酸、絲氨酸、天冬氨酸和金屬蛋白酶等[5,8]。麥胚經(jīng)過孵育，內(nèi)源蛋白酶被激活，麥胚蛋白被降解成可溶性蛋白、氨基酸及具有生物活性的多肽類物質(zhì)，且孵育法不產(chǎn)生毒副作用，用于富集麥胚中的肽安全、高效。崔新明[16]采用孵育法富集麥胚多肽，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過孵育多肽含量顯著提高，所配制的富肽麥胚營養(yǎng)粉感官評價較好。適度改變麥胚的孵育條件有利于提高麥胚蛋白酶活力，使生物活性物質(zhì)被釋放并得以富集。余南靜等[17]發(fā)現(xiàn)孵育時加入ZnSO4、MnSO4和CaCl2等金屬離子，麥胚蛋白酶活力呈顯著促進效應(yīng)，酶活力達到385.44 U/g，多肽含量達到49.35 mg/g。因此，將金屬離子用于富集麥胚中的肽具有可行性。

微波處理能夠改變蛋白酶分子的構(gòu)象，改變酶的催化活性，進而加快蛋白的水解[18-21]。研究表明，在合適的微波條件下，植物種子中的淀粉酶、蛋白酶和轉(zhuǎn)氨酶的酶活更高，微波輻射對極性較強的底物更有優(yōu)勢[22-23]。Cao等[24]采用同步升溫法研究微波加熱對谷氨酰胺酶（TGase）活性的影響，發(fā)現(xiàn)微波處理可改變它的構(gòu)象及二級結(jié)構(gòu)，使其分子更容易和底物結(jié)合，提高了酶的活性。Tian等[25]發(fā)現(xiàn)微波輔助酶解麥胚蛋白比傳統(tǒng)的傳導(dǎo)加熱具有更高的水解度，可產(chǎn)生更多的生物活性物質(zhì)。微波處理仍可保持麥胚的固有顏色，并提高麥胚的產(chǎn)品風味[26]。但微波聯(lián)合金屬離子富集麥胚中的肽的研究尚未報道。

本研究以未經(jīng)脫脂的離體麥胚為原料，選用3種金屬離子（ZnSO4、MnSO4和CaCl2）為孵育液添加物，處理麥胚微波輔助，研究不同濃度的金屬離子及微波條件對麥胚蛋白酶活力和肽含量的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，研究結(jié)果為高效利用麥胚與富集功能性肽提供了新的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥胚 丹陽市蓮湖面粉有限公司；酪蛋白、還原型谷胱甘肽、β-巰基乙醇 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；L-酪氨酸、三氯乙酸、硫酸鋅、硫酸錳、氯化鈣、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、檸檬酸、檸檬酸三鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA） 均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

ZW-bp120變頻實驗微波爐 蕪湖眾維教研儀器研發(fā)有限責任公司；U-T3紫外可見分光光度計上海屹譜儀器制造有限公司；Eppendorf 5804/R大型高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9240A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-25 pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FSH-2B可調(diào)高速勻漿機

方科儀器（常州）有限公司；YP5001N型電子天平

上海舜宇恒平科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥胚孵育 參照余南靜等[17]孵育麥胚的方法。稱取3 g/份麥胚，置于研缽中，按照料液比1:10加入孵育液（0.1 mol/L，pH為3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液），在孵育液中加入適量濃度的ZnSO4、MnSO4、CaCl2。研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，經(jīng)微波處理后，置于49 ℃水浴鍋中孵育富集6 h后得到麥胚孵育液。

1.2.2 單因素實驗 針對微波功率、微波時間、ZnSO4濃度、MnSO4濃度、CaCl2濃度進行單因素實驗，考察各因素對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響。

1.2.2.1 微波功率對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響 在微波時間10 s，ZnSO4濃度0.6 mmol/L，MnSO4濃度2.0 mmol/L，CaCl2濃度1.4 mmol/L條件下，研究微波功率（0、200、400、600、800、1000 W）對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響。

1.2.2.2 微波時間對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響 在微波功率600 W，ZnSO4濃度0.6 mmol/L，MnSO4濃度2.0 mmol/L，CaCl2濃度1.4 mmol/L條件下，研究微波時間（0、2、4、6、8、10、12 s）對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響。

1.2.2.3 ZnSO4濃度對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響 在微波功率600 W，微波時間10 s，MnSO4濃度2.0 mmol/L，CaCl2濃度1.4 mmol/L條件下，研究ZnSO4濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L）對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響。

1.2.2.4 MnSO4濃度對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響 在微波功率600 W，微波時間10 s，ZnSO4濃度0.6 mmol/L，CaCl2濃度1.4 mmol/L條件下，研究MnSO4濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L）對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響。

1.2.2.5 CaCl2濃度對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響 在微波功率600 W，微波時間10 s，ZnSO4濃度0.6 mmol/L，MnSO4濃度2.0 mmol/L條件下，研究MnSO4濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L）對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以微波功率、微波時間、ZnSO4濃度、MnSO4濃度、CaCl2濃度為考察對象，麥胚肽含量及蛋白酶活力為考察指標，進行L16（45）正交試驗，優(yōu)化微波聯(lián)合金屬離子處理麥胚蛋白的工藝參數(shù)。因素與水平如表1所示。

表 1 L16（45）正交試驗因素水平表Table 1 L16 (45) orthogonal test factors and levels

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 肽含量測定 參照魯偉等[27]測定多肽的方法并稍作修改，取2.5 mL麥胚孵育液置于15 mL離心管中，加入2.5 mL 10%（w/v）的三氯乙酸溶液，混勻后靜置10 min，4 ℃ 4000 r/min下離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并用5%的三氯乙酸定容。取該溶液6 mL置于另一離心管中，加入雙縮脲試劑4 mL，混勻后靜置10 min，4 ℃ 2000 r/min離心10 min以沉淀大分子蛋白質(zhì)，540 nm處測定上清液的OD值，對照標準曲線求得樣品溶液多肽濃度C（mg/mL），進而計算出麥胚樣品中的肽含量。以還原型谷胱甘肽為樣品制作標準曲線（y=0.0029x，R2=0.9978）。

1.2.4.2 蛋白酶活力測定 參照Harvey等[28]的測定方法，取2 mL麥胚孵育液于15 mL離心管中，加入6 mL pH為6.0，濃度為0.02 mol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（5 mmol/Lβ-巰基乙醇及2.5 mmol/L EDTA配制而成）。冰浴靜置10 min，擦干水分后在4 ℃ 4000 r/min下離心30 min，所得上清液即為蛋白酶粗提液。以20 g/L的酪蛋白溶液作為底物，1 mL底物與1 mL粗酶液在40 ℃條件下反應(yīng)10 min，置于沸水中滅酶5 min，隨后加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液，室溫下靜置15 min以沉淀剩余的蛋白質(zhì)。4 ℃ 4000 r/min離心15 min后，取上清液于275 nm波長處測定吸光度，對照標準曲線即可求得麥胚樣品中的蛋白酶活力。以酪氨酸為樣品制作標準曲線（y=0.0077x，R2=0.9991）。將1 mL麥胚粗酶液催化酪蛋白每分鐘產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個酶活力單位（U），以反應(yīng)前加入三氯乙酸溶液的體系為對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗設(shè)定3組平行，結(jié)果換算成干基質(zhì)量，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準方差（±SD）表示。采用SPSS16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析，統(tǒng)計分析采用F檢驗，P＜0.05有顯著差異，P＜0.01有極顯著差異。采用Origin軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波功率對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響

如圖1可見，隨著微波功率的增加，肽含量呈先上升后下降趨勢，0～800 W范圍內(nèi)，肽含量顯著上升（P＜0.05），800 W時，麥胚中多肽的富集效應(yīng)最好，肽含量高達172.24 mg/g，是對照的1.46倍，這是因為適當?shù)奈⒉ㄌ幚砜墒果溑叩鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)變得疏松，蛋白質(zhì)易于溶出形成更多的生物活性物質(zhì)[12]。繼續(xù)增大功率，麥胚肽含量下降，這可能是因為麥胚內(nèi)外溫度進一步升高，部分麥胚焦化，蛋白質(zhì)疏水殘基相互作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)溶解度降低，無法形成更多的多肽。0～800 W范圍內(nèi)，微波聯(lián)合金屬離子對麥胚中的肽具有富集作用。與單獨使用金屬離子相比，二者結(jié)合富集麥胚中的肽效果更好。

由圖1可見，麥胚蛋白酶活力隨微波功率的增加，整體呈下降趨勢，微波200 W處理的蛋白酶活力顯著低于對照（P＜0.05），微波功率400～800 W處理時，蛋白酶活力變化不明顯。繼續(xù)增大微波功率，蛋白酶活力顯著降低（P＜0.05）。各處理蛋白酶活力均顯著低于對照（P＜0.05），說明微波處理對蛋白酶活力影響較大。

圖 1 微波功率對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of microwave power on wheat germ peptide content and protease activity

微波處理使樣品內(nèi)外同時受熱，降低了樣品中的水分，迅速升高了溫度，使酶失活。本研究結(jié)果與陳昊等[29]用微波處理脲素酶的研究結(jié)果一致，電磁波產(chǎn)生的熱效應(yīng)改變了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，破壞了蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白酶活力下降明顯。綜合實際生產(chǎn)成本及效益考慮，選取微波功率200、400、600、800 W作為正交試驗分析的因素水平。

2.2 微波時間對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響

由圖2可見，麥胚肽含量隨著微波時間的延長呈先上升后下降趨勢，微波時間0～4 s時，肽含量變化不明顯，4～6 s內(nèi)顯著上升（P＜0.05），8 s時肽含量達到最高值（136.9 mg/g）。繼續(xù)延長微波處理時間至10 s，肽含量有所降低，但仍高于對照。這可能是因為短時的微波處理能顯著提高蛋白質(zhì)的溶解性，產(chǎn)生更多的多肽，而微波時間延長至10 s后麥胚內(nèi)外部溫度升高明顯，致使蛋白質(zhì)變性，影響了水解效果。

圖 2 微波時間對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of microwave time on wheat germ peptide content and protease activity

隨著微波時間的延長，蛋白酶活力整體呈先上升后下降趨勢，6 s時達到最大值（2477.92 U/g），繼續(xù)延長微波處理時間，酶活力顯著下降（P＜0.05）。微波處理0～10 s范圍內(nèi)與對照相比，蛋白酶活力整體呈上升趨勢，說明微波處理能夠激活麥胚內(nèi)源蛋白酶活力。微波處理12 s時相較于對照有所下降，說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，酶失活。綜合實際生產(chǎn)成本及效益考慮，選取微波時間6、8、10、12 s作為正交試驗分析的因素水平。

2.3 ZnSO4濃度對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響

從圖3可見，麥胚肽含量隨著ZnSO4濃度的增加呈先上升后下降趨勢，在濃度為0～0.6 mmol/L時，肽含量顯著上升（P＜0.05），濃度為0.6 mmol/L時，達到最大值（135.14 mg/g），繼續(xù)增大ZnSO4濃度，麥胚肽含量顯著下降（P＜0.05）。在0.4～0.8 mmol/L范圍內(nèi)麥胚肽含量顯著高于對照（P＜0.05），說明不同的ZnSO4添加量對于富集麥胚的作用效果具有明顯差異。ZnSO4濃度對麥胚內(nèi)源蛋白酶活力的影響整體呈先上升后下降趨勢，ZnSO4濃度在0～0.6 mmol/L時顯著上升（P＜0.05），0.6 mmol/L時蛋白酶活力最高（1617.92 U/g），繼續(xù)增大ZnSO4濃度，麥胚蛋白酶活力顯著下降（P＜0.05）。表明適量的添加ZnSO4有利于激活麥胚中的蛋白酶，從而促使其活性提高。有研究表明Zn2+對于部分中性蛋白酶起激活作用，主要是因為該蛋白酶活性部位不含Zn2+，Zn2+能通過疏水鍵結(jié)合、離子相互作用和金屬結(jié)合等方式提高中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性，從而提高中性蛋白酶活性[30-31]。有研究表明，孵育可有效增強酶促反應(yīng)，提高生物活性物質(zhì)的含量。因此，由于麥胚中蛋白酶活性的增強，更多蛋白質(zhì)被水解，表現(xiàn)為肽含量的增加。綜合實際生產(chǎn)成本及效益考慮，選取ZnSO4濃度0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L作為正交試驗分析的因素水平。

圖 3 ZnSO4濃度對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of ZnSO4 concentration on wheat germ peptide content and protease activity

2.4 MnSO4濃度對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響

從圖4可見，隨著MnSO4濃度的增加，麥胚中肽含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在MnSO4濃度為2.0 mmol/L時，多肽的富集效應(yīng)達到最優(yōu)，高達134.60 mg/g，是對照的1.08倍。麥胚蛋白酶活力呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，MnSO4濃度0～1.6 mmol/L時，蛋白酶活力呈顯著下降趨勢（P＜0.05），在1.6 mmol/L時蛋白酶活力最低（只有1359.58 U/g）。繼續(xù)增大MnSO4濃度，酶活力顯著上升（P＜0.05），尤其是濃度為2.2 mmol/L時，酶活力急劇上升。諸多研究表明Mn2+可激活酸性蛋白酶。Lee等[32]在米曲霉LK-101中添加1 mmol/L的Mn2+，發(fā)現(xiàn)其酸性蛋白酶相對酶活可高達197%。而楊潤強等[33]在研究金屬離子對蛋白酶活力的影響時，發(fā)現(xiàn)在pH為5.5和7.5時，Mn2+都表現(xiàn)出抑制作用。圖4可以看出低濃度的MnSO4可抑制麥胚蛋白酶活力，但肽含量持續(xù)增加，高濃度可促進蛋白酶活力，但會影響肽富集效應(yīng)，適量地添加MnSO4有利于生產(chǎn)更多的生物活性物質(zhì)。綜合實際生產(chǎn)成本及效益考慮，選取MnSO4濃度1.6、1.8、2.0、2.2 mmol/L作為正交試驗分析的因素水平。

圖 4 MnSO4濃度對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of MnSO4 concentration on wheat germ peptide content and protease activity

圖 5 CaCl2濃度對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of CaCl2 concentration on wheat germ peptide content and protease activity

2.5 CaCl2濃度對麥胚肽含量和蛋白酶活力的影響

從圖5可見，隨著CaCl2濃度的增大，肽含量呈先上升后下降趨勢，CaCl2濃度在0～1.8 mmol/L時，肽含量急劇上升，1.8 mmol/L時達到最高值（148.39 mg/g），隨后繼續(xù)增大CaCl2濃度至2.0 mmol/L，肽含量顯著下降，但仍顯著高于對照，說明添加CaCl2對麥胚肽富集效應(yīng)有顯著促進作用（P＜0.05）。蛋白酶活力有CaCl2為1.4、2.0 mmol/L兩個顯著促進濃度，這與楊潤強等[34]的研究結(jié)論Ca2+能夠顯著促進麥胚內(nèi)源蛋白酶活力一致。蛋白酶活力在CaCl2為1.4 mmol/L之后顯著下降（P＜0.05），但是肽的生成仍在發(fā)生，其原因有待進一步研究。肽含量隨著CaCl2濃度增加而動態(tài)累積，直到濃度為1.8 mmol/L無明顯變化，達到平衡。麥胚中蛋白酶多為中性，有諸多研究表明Ca2+能有效促進中性蛋白酶活力，主要是因為中性蛋白酶往往不耐高溫，Ca2+能夠維持中性蛋白酶的空間構(gòu)象，提高其熱穩(wěn)定性，從而提高蛋白酶活性[30]。綜合實際生產(chǎn)成本及效益考慮，選取CaCl2濃度1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L作為正交試驗分析的因素水平。

2.6 正交試驗結(jié)果

從表2、表3可見，不同的影響因素對麥胚中肽的富集效應(yīng)影響程度不同，其重要性依次為ZnSO4濃度＞微波時間＞MnSO4濃度＞CaCl2濃度＞微波功率。該5種因素對肽含量的影響均極顯著（P＜0.01）。由極差法得出最佳工藝條件為A1B3C4D1E4，經(jīng)驗證此組合處理時肽含量為220.56 mg/g，低于正交試驗最佳表現(xiàn)7號處理A2B3C4D1E2時的肽含量（228.85 mg/g）。因此，7號處理為最優(yōu)配方，即微波聯(lián)合金屬離子對麥胚中肽的富集效應(yīng)影響最優(yōu)的工藝參數(shù)為微波功率400 W，微波時間10 s，ZnSO4濃度1.0 mmol/L，MnSO4濃度1.6 mmol/L，CaCl2濃度1.4 mmol/L。因此，合理優(yōu)化肽富集過程中這些因素的工藝參數(shù)，能夠顯著提高肽的富集效應(yīng)。

從表2、表4可見，不同的影響因素對麥胚內(nèi)源蛋白酶活力的影響程度不同。其影響重要性為微波時間＞MnSO4濃度＞微波功率＞ZnSO4濃度＞CaCl2濃度。該5種因素對麥胚內(nèi)源蛋白酶活力的影響均極顯著（P＜0.01）。由極差法得出最佳工藝條件為A2B3C4D4E3，經(jīng)驗證此條件下蛋白酶活力為2208.98 U/g，低于正交試驗7號處理A2B3C4D1E2（2268.40 U/g）。因此，7號處理為最佳處理條件，即激活麥胚內(nèi)源蛋白酶活力最優(yōu)工藝參數(shù)為微波功率400 W，微波時間10 s，ZnSO4濃度1.0 mmol/L，MnSO4濃度1.6 mmol/L，CaCl2濃度1.4 mmol/L。

表 2 L16（45）麥胚肽含量及蛋白酶活力正交試驗的設(shè)計結(jié)果Table 2 L16 (45) design results of orthogonal test of wheat germ peptide content and protease activity

表 4 L16（45）蛋白酶活力正交試驗方差分析Table 4 L16 (45) analysis of variance of orthogonal test of protease activity

3 結(jié)論

微波功率、微波時間、ZnSO4濃度、MnSO4濃度、CaCl2濃度五個因素對麥胚內(nèi)源蛋白酶活力及肽含量的影響均顯著。從肽富集效應(yīng)來看，其重要性依次為ZnSO4濃度＞微波時間＞MnSO4濃度＞CaCl2濃度＞微波功率。從蛋白酶活力來看，其影響重要性依次為微波時間＞MnSO4濃度＞微波功率＞ZnSO4濃度＞CaCl2濃度。經(jīng)過正交優(yōu)化試驗得出麥胚多肽富集效應(yīng)最優(yōu)的工藝參數(shù)為微波功率400 W，微波時間10 s，ZnSO4濃度1.0 mmol/L，MnSO4濃度1.6 mmol/L，CaCl2濃度1.4 mmol/L。楊潤強等[34]通過響應(yīng)面優(yōu)化得到最高的麥胚肽含量為88.46 mg/g，本實驗經(jīng)優(yōu)化后肽含量高達228.85 mg/g，是其2.59倍，而此時蛋白酶活力為2268.40 U/g，同樣為最優(yōu)水平。低功率短時間的微波處理聯(lián)合適當濃度的Zn2+、Mn2+、Ca2+富集麥胚中肽為麥胚資源的高值化利用提供了一個可行的方法。實驗中，麥胚內(nèi)源蛋白酶活力的變化趨勢和肽含量的變化趨勢并不完全一致，其具體原因還有待進一步研究。采用生物調(diào)控技術(shù)激活內(nèi)源蛋白酶活力，是一種高效的肽富集方法。