高育青，張豪杰，張丹鳳，潘裕添，張 峰,

（1.閩南師范大學(xué)福建省菌類活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，福建漳州 363000；2.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建漳州 363000）

米曲霉（Aspergillus oryzae）是公認(rèn)的食品安全菌株，主要用于醬油和酒類的釀制，以及發(fā)酵產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和果膠酶等[1-4]。米曲霉3.042和米曲霉RIB40分別是在我國和日本廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的兩種米曲霉菌種。它們的基因組長度都約為38 Mb，兩者的大部分功能基因都比較保守，但在菌株生長、耐鹽、環(huán)境抗性和次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因方面具有一些不同點[5-6]。研究表明，米曲霉3.042菌株含有更多與細(xì)胞生長和環(huán)境抗性相關(guān)的基因而具有更強(qiáng)的生長活力。米曲霉RIB40菌株因含有較多的Na+、K+、甘油代謝相關(guān)基因，而更能耐受鹽脅迫，使其在食品工業(yè)應(yīng)用中更有價值[7]。此外，3.042菌株和RIB40菌株在醇、酸和氨基酸形成相關(guān)的酶的基因上也有差異，這些差異造成兩者在生產(chǎn)醬油時產(chǎn)生不同的風(fēng)味[8]。例如，侯麗華等[9]利用低鹽固態(tài)工藝研究發(fā)現(xiàn)米曲霉RIB40菌株在原料溶出、蛋白質(zhì)的分解以及生產(chǎn)還原糖方面的能力較強(qiáng)。王瑩[10]在對兩株菌株的發(fā)酵性能的比較中發(fā)現(xiàn)米曲霉RIB40發(fā)酵的醬油偏醇香，而米曲霉3.042偏酯香。本研究以米曲霉RIB40為出發(fā)菌株，構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系，能為我國食品工業(yè)提供更為多樣的菌株選擇。

借助遺傳轉(zhuǎn)化手段能在較短時間內(nèi)實現(xiàn)基因的遺傳改造，但首先需要建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。目前雖已有多種方法用于建立米曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但是轉(zhuǎn)化效率并不十分理想。Sun等[11]利用農(nóng)桿菌法以pyrG基因作為篩選標(biāo)記構(gòu)建了尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的米曲霉3.042遺傳轉(zhuǎn)化體系，但是只獲得了0.1%的轉(zhuǎn)化率。近年，畢付提等[12]同樣利用農(nóng)桿菌法以pyrG基因作為篩選標(biāo)記，通過優(yōu)化條件僅將米曲霉3.042的轉(zhuǎn)化效率提高到了8.33%。劉雪[13]利用PEG-CaCl2介導(dǎo)的基因重組技術(shù)以米曲霉3.951為出發(fā)菌株構(gòu)建的米曲霉pyrG單缺失菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其同源重組效率低于5%[14]。由于目前多數(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化體系都是基于外源基因在出發(fā)菌株體內(nèi)發(fā)生的基因重組，因此建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系必須使出發(fā)菌株具有發(fā)生高效的基因重組的潛力。在構(gòu)建的尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步敲除了米曲霉中阻礙基因重組的Aoku70基因，能大大提高基因的重組效率。

本研究通過同源重組技術(shù)和5-氟乳清酸（5-Fluoroorotic Acid，5-FOA）的篩選作用對米曲霉RIB40的AopyrG和Aoku70基因進(jìn)行雙敲除，旨在建立具有高重組效率的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為今后米曲霉RIB40的遺傳改造提供了良好的出發(fā)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉RIB40（Aspergillus oryzaeRIB40） 由華南理工大學(xué)潘力教授贈送；酵母提取物、蛋白胨英國OXOID公司；瓊脂粉 BBI生命科學(xué)有限公司；吐溫20、二甲基亞砜 西隴科學(xué)股份有限公司；Driselase、山梨醇、十二烷基硫酸鈉 北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司；聚乙二醇4000 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris 廣州賽國生物科技有限公司；Lysing Enzymes和β-glucoronidase 美國Sigma公司；PDA培養(yǎng)基 美國BD公司；TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity（HiFi） TransGen Biotech公司；2×Taq PCR Master Mix 北京金百特生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒 上?；萘枭锛夹g(shù)有限公司；5-FOA 上海生物工程有限公司；所用YGT、復(fù)蘇培養(yǎng)基及孢子洗脫液、DNA基因組小量抽提裂解液、原生質(zhì)體裂解液、STC溶液和PEG Buffer的具體配方請參見文獻(xiàn)[15]。

GF88DX全自動高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；T30三槽基因擴(kuò)增儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；Elix Essential5反滲透純水系統(tǒng) Merck Millipore；Synergy超純水系統(tǒng) Millipore；LAS600凝膠成像分析系統(tǒng) 美國GE公司；Nanodrop2000超微量分光光度計 Thermo Scientific；TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī) 湘儀公司；Leica ICC50 E生物顯微鏡和LeicaSP8激光掃描共聚焦顯微鏡 徠卡公司；ZQLY-180F單目雙層全溫?fù)u床 上海知楚儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米曲霉基因組DNA的提取 將菌絲或孢子液接種到Y(jié)GT液體培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)2 d后，室溫12000 r/min離心2 min收集菌絲。向菌絲中加入500 μL DNA基因組小量抽提裂解液，并于65 ℃金屬浴裂解菌絲30 min。向裂解物中加入200 μL 3 mol/L乙酸鉀，混勻后13000 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一個EP管中并加入等體積的異丙醇，混勻后12000 r/min離心10 min，收集沉淀物。向沉淀物中加入700 μL 75%的乙醇溶液洗滌，13000 r/min離心5 min后棄上清，于50 ℃烘箱中烘干沉淀，最后加30 μL無菌水溶解DNA。

1.2.2 基因片段的擴(kuò)增 首先按照TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity試劑盒的說明書對目的基因的上下游同源臂和標(biāo)記基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為100 μL。對PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，用超微量分光光度計測定DNA濃度。接著將上下游同源臂和標(biāo)記基因DNA片段等摩爾比混合，使用TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity試劑盒進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)（Overlap Extension PCR，OEPCR）。OE-PCR反應(yīng)體系按照TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity試劑盒說明書進(jìn)行，OE-PCR反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[16]。對OE-PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，用超微量分光光度計測定DNA濃度。

1.2.3 米曲霉原生質(zhì)體的制備 將孢子液接種至100 mL YGT液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 180 r/min培養(yǎng)16 h。用紗布收集菌絲，并用無菌水洗滌菌絲，再用濾紙吸干水分。向菌絲中加入5 mL原生質(zhì)體裂解液，在30 ℃條件下裂解6 h。裂解后的混合物用擦鏡紙過濾，并用預(yù)冷的1.2 mol/L山梨醇沖洗。將濾液于4 ℃冷凍離心機(jī)中4500 r/min離心15 min后，收集沉淀物。向沉淀物中加入300 μL預(yù)冷的1.2 mol/L STC溶液，再加入7%的二甲基亞砜重懸沉淀，分裝后于-80 ℃保存。

1.2.4 米曲霉的轉(zhuǎn)化及PCR驗證 將瓊脂糖凝膠回收的5 μg OE-PCR產(chǎn)物與預(yù)冷的200 μL STC溶液在無菌的EP管中混勻，再加入200 μL預(yù)冷的PEG Buffer混勻，最后加入100 μL原生質(zhì)體。將混合物混勻后冰水浴30 min，然后再補(bǔ)加1 mL PEG Buffer，混勻后再冰水浴10 min。最后將上述混合液與頂層復(fù)蘇培養(yǎng)基混勻后倒入已凝固的底層復(fù)蘇培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)至長出菌落。挑取轉(zhuǎn)化子接種到Y(jié)GT液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d后，按照1.2.1中的方法提取DNA。轉(zhuǎn)化子DNA的PCR驗證條件按照2×Taq PCR Master Mix說明書進(jìn)行。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.2.5AopyrG基因的敲除 從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到米曲霉的乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶基因（AopyrG）的序列，并設(shè)計AopyrG上下游引物（AopyrG-L1和AopyrG-L2，AopyrG-R1和AopyrGR2，表1）。按照1.2.2中的方法，以AopyrG上下游引物分別擴(kuò)增AopyrG的上下游同源臂（AopyrGL、AopyrGR），然后以AopyrG-P1和AopyrG-P2引物（表1）通過OE-PCR將上下游同源臂融合成一個片段（AopyrGLR）。按照1.2.4中的方法，將AopyrGLR片段轉(zhuǎn)化米曲霉RIB40的原生質(zhì)體。在含有5-FOA培養(yǎng)基上挑取生長出來的菌株進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行PCR驗證。

表 1 PCR擴(kuò)增中所用到的引物Table 1 Primers used in PCR amplification

1.2.6Aoku70基因的敲除 從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到米曲霉的Aoku70序列，并設(shè)計引物。按照1.2.2中的方法，以引物Aoku70-L1和Aoku70-L2，Aoku70-R1和Aoku70-R3，Aoku70-R1和Aoku70-R2（表1）分別擴(kuò)增Aoku70上游（Aoku70L）、部分下游（Aoku 70r）和下游同源臂（Aoku70R），以引物AfpyrGO1和AfpyrG-O2（表1）擴(kuò)增AfpyrG基因。先通過OE-PCR得到Aoku70r-AfpyrG片段，然后再通過OE-PCR得到Aoku70L-Aoku70r-AfpyrG-Aoku70R片段（LrGR）。按照1.2.4中的方法，將LrGR片段轉(zhuǎn)化ΔAopyrG原生質(zhì)體，挑取在不含有尿苷/尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長出來的菌株進(jìn)行培養(yǎng)和驗證。將驗證成功的菌株的孢子涂布到含有5-FOA的培養(yǎng)基上生長，挑取長出的菌株進(jìn)行培養(yǎng)和PCR驗證。

1.2.7AoH2B-mCherry核定位熒光菌株的構(gòu)建從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到米曲霉組蛋白AoH2B的基因序列，并設(shè)計引物。按照1.2.2中的方法，以引物AoH2B-L1和AoH2B-L2，AoH2B-R1和AoH2B-R2（表1）分別擴(kuò)增AoH2B-ORF區(qū)及其上游同源臂（AoH2BL）、下游同源臂（AoH2BR），然后以引物mCherry-AfpyrG-O1和mCherry-AfpyrG-O2（表1）擴(kuò)增mCherry-AfpyrG片段，最后以AoH2B-P1和AoH2B-P2引物（表1）通過OE-PCR將同源臂和mCherry-AfpyrG片段融合成一個片段（AoH2BmCherry-AfpyrG-AoH2BR）。按照1.2.4中的方法，將AoH2B-mCherry-AfpyrG-AoH2BR融合片段轉(zhuǎn)化ΔAoku70ΔAopyrG雙缺失菌株的原生質(zhì)體，在復(fù)蘇培養(yǎng)基上挑取生長出來的菌株進(jìn)行培養(yǎng)及PCR驗證。

1.2.8mCherry熒光的檢測 將10 μL含有mCherry基因的米曲霉孢子液接種于YGT液體培養(yǎng)基中，在30 ℃搖床中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，12000 r/min 離心5 min收集萌發(fā)的孢子。將孢子分散鋪于載玻片上，用10 μL無菌水沖洗孢子，并用擦鏡紙小心地吸走水分，蓋上蓋玻片，在激光共聚焦顯微鏡下用激發(fā)波長587 nm，發(fā)射波長610 nm激發(fā)并觀察紅色熒光的位置。

1.2.9 米曲霉菌株生長狀況的分析 將1 μL米曲霉孢子液接種于PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)6 d后用孢子洗脫液洗脫并收集孢子。用血球計數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行孢子計數(shù)，然后用孢子洗脫液稀釋孢子液至相同濃度。接種1 μL孢子液至PDA平板中央，30 ℃培養(yǎng)并每天測量菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

菌落直徑實驗做3個平行實驗，每個平行實驗重復(fù)3次，以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)結(jié)果。運(yùn)用Excel和SPSS Statistics 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用獨立樣本T檢驗進(jìn)行差異性比較，在95%顯著性水平下分析差異的顯著性，在Excel中進(jìn)行柱狀圖分析。

圖 1 AopyrG基因敲除的驗證Fig.1 Verification of the AopyrG gene knockout

2 結(jié)果與分析

2.1 ΔAopyrG敲除菌株的構(gòu)建

為了利用同源重組法獲得米曲霉的ΔAopyrG敲除菌株（圖1a），首先利用OE-PCR獲得只含有AopyrG上下游序列的AopyrGLR片段（圖1b），然后將其轉(zhuǎn)化為野生型菌株的原生質(zhì)體。轉(zhuǎn)化混合物在含有5-FOA、尿苷和尿嘧啶的復(fù)蘇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對長出的菌落提取DNA進(jìn)行PCR驗證。結(jié)果如圖1c所示，用AopyrG的ORF引物進(jìn)行PCR驗證時發(fā)現(xiàn)，米曲霉野生型菌株可擴(kuò)增出AopyrG的ORF片段，而轉(zhuǎn)化菌株不能擴(kuò)增出相應(yīng)片段。用AopyrG的上下游引物AopyrG-P1和AopyrG-P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增時發(fā)現(xiàn)，米曲霉野生型菌株擴(kuò)增得到的片段比轉(zhuǎn)化菌株擴(kuò)增得到的片段長，以上結(jié)果說明米曲霉ΔAopyrG菌株構(gòu)建成功。

2.2 ΔAoku70ΔAopyrG雙敲除菌株的構(gòu)建與驗證

為了獲得ΔAoku70ΔAopyrG雙敲除菌株，先以Aoku70r-AfpyrG片段替換ΔAopyrG敲除菌中的Aoku70，然后利用5-FOA脅迫使得轉(zhuǎn)化子基因組發(fā)生自身環(huán)化丟失AfpyrG實現(xiàn)Aoku70和AopyrG的雙敲除（圖2a）。用三對引物Aoku70-O1和Aoku70-O2（擴(kuò)增Aoku70的ORF區(qū)）、Aoku70-L1和AfpyrG-O4（擴(kuò)增L-AfpyrG區(qū)）、Aoku70-R2和AfpyrG-O3（擴(kuò)增AfpyrG-R區(qū)）對Aoku70r-AfpyrG替換ΔAopyrG敲除菌中的Aoku70進(jìn)行PCR驗證。結(jié)果如圖2b所示，野生型菌株只能擴(kuò)增出Aoku70的ORF片段，而轉(zhuǎn)化菌株只有Aoku70的ORF不能擴(kuò)增出來。以上結(jié)果表明Aoku70r-AfpyrG成功替換了ΔAopyrG敲除菌的Aoku70基因。將上一步的轉(zhuǎn)化子用5-FOA脅迫使得轉(zhuǎn)化子基因組發(fā)生自身環(huán)化丟失AfpyrG，用AopyrG和Aoku70的ORF引物進(jìn)行PCR驗證。結(jié)果如圖2c所示，野生型菌株可以同時擴(kuò)增出AopyrG和Aoku70的ORF，而轉(zhuǎn)化菌株都不能擴(kuò)增出相應(yīng)片段。但是，用引物Aoku70-P1和Aoku70-P2擴(kuò)增Aoku70上下游跨越區(qū)時發(fā)現(xiàn)，野生型菌株擴(kuò)增得到的片段比轉(zhuǎn)化菌株擴(kuò)增得到的片段長。綜合以上結(jié)果表明ΔAoku70ΔAopyrG雙敲菌株構(gòu)建成功。

圖 2 AopyrGAoku70基因敲除的驗證Fig.2 Verification of the AopyrGAoku70 gene knockout

2.3 米曲霉核定位熒光菌株的構(gòu)建

為了驗證ΔAoku70ΔAopyrG雙敲菌株的可用性，以該菌株為宿主利用同源重組技術(shù)將mCherry-AfpyrG片段插入到組蛋白H2B的ORF后面構(gòu)建一個核定位熒光菌株（圖3a）。用引物mCherry-O1和mCherry-O2對轉(zhuǎn)化子的mCherry-ORF區(qū)進(jìn)行PCR驗證，用AoH2B上下游、mCherry內(nèi)部和AfpyrG內(nèi)部的引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行AoH2B-mCherry區(qū)和mCherry-AfpyrG區(qū)的進(jìn)一步驗證。結(jié)果如圖3b所示，三個片段大小均與預(yù)期相符，這說明AoH2B-mCherry熒光菌株構(gòu)建成功。將驗證成功的菌株孢子，經(jīng)過萌發(fā)后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察其紅色熒光的位置。結(jié)果如圖3c所示，在細(xì)胞核中可以觀察到紅色熒光，進(jìn)一步說明AoH2B-mCherry核定位熒光菌株構(gòu)建成功。以上結(jié)果表明本研究構(gòu)建的ΔAoku70ΔAopyrG雙敲菌株可以用于米曲霉基因的改造研究。

圖 3 米曲霉核定位熒光菌株的構(gòu)建Fig.3 Subcellular localization of AoH2B-mCherry in A. oryzae

2.4 米曲霉核定位熒光菌株的生長分析

為了研究插入mCherry基因?qū)γ浊股L的影響，分別將含有106個AoH2B-mCherry菌株和對照菌株（ΔAopyrGΔAoku70::AfpyrG）的孢子液接種到PDA培養(yǎng)基上，測量兩種米曲霉在5 d內(nèi)的生長直徑。結(jié)果如圖4所示，AoH2B-mCherry菌株的形態(tài)（圖4a）和生長直徑（圖4b）與對照菌株相比沒有明顯差異（P＞0.05），這表明mCherry基因的插入對米曲霉菌株的生長狀況沒有影響。后續(xù)研究可將融合了GFP熒光的目的基因轉(zhuǎn)化至該核定位菌株，通過觀察綠色和紅色熒光的相對位置來確定目的基因的亞細(xì)胞定位，從而用于米曲霉基因的功能研究。

圖 4 mCherry基因?qū)oH2B-mCherry菌株生長的影響Fig.4 The effect of mCherry gene on AoH2B-mCherry strain growth

3 討論與結(jié)論

米曲霉的基因組序列雖已被測定，但是米曲霉的細(xì)胞壁成分特殊使其不能像酵母和大腸桿菌一樣具有高的遺傳轉(zhuǎn)化效率[6,17]，因此米曲霉遺傳改良進(jìn)展緩慢。建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系首先需要考慮選擇合適的遺傳篩選標(biāo)記。本研究通過敲除米曲霉中編碼乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶的pyrG基因，構(gòu)建了以pyrG基因為篩選標(biāo)記的遺傳轉(zhuǎn)化體系。與以往的主要以ble[18]、ptrA[19]、sdh[20-21]和hyg[22-23]等抗性基因作為篩選標(biāo)記的遺傳轉(zhuǎn)化體系相比，以pyrG基因作為篩選標(biāo)記不需要對抗性藥物種類和濃度進(jìn)行摸索，縮短了轉(zhuǎn)化周期[24-26]。此外，pyrG基因的導(dǎo)入也不會使人們對食品安全產(chǎn)生疑慮，因此，基于pyrG基因進(jìn)行遺傳改良的米曲霉在生產(chǎn)應(yīng)用中不會受到限制。

多數(shù)絲狀真菌能利用非同源末端連接（Nonhomologous End Joining，NHEJ）途徑修復(fù)DNA雙鏈斷裂（DNA Double Strand breaks，DSBs），使基因重組受阻[27-28]。NHEJ過程是由Ku70-Ku80異源二聚體、DNA依賴的蛋白激酶催化亞基和DNA連接酶IV-Xrcc4復(fù)合物所介導(dǎo)[29-30]。現(xiàn)有研究表明，在絲狀真菌中敲除ku70基因可顯著提高同源重組效率。Ninomiya等[29]在粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中敲除了ku70基因后發(fā)現(xiàn)，同源重組效率由野生型中的30%提高到了100%。Koh等[31]發(fā)現(xiàn)ku70缺失的圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）突變體中，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)95.8%。Tu等[32]發(fā)現(xiàn)在ku70突變的亮蓋靈芝（Ganoderma lucidum）中，CRISPR/Cas9基因編輯引起的靶基因插入效率能提高到96.3%，替換效率能提高到93.1%。本研究在ΔAopyrG單缺失的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除了Aoku70基因，獲得了具有高效同源重組的營養(yǎng)缺陷型菌株ΔAoku70ΔAopyrG。

本研究以野生型的米曲霉RIB40為出發(fā)菌株，通過PEG-CaCl2介導(dǎo)的同源重組技術(shù)敲除了AopyrG和Aoku70兩個基因，最終獲得了尿苷/尿嘧啶合成和非同源末端連接途徑同時缺陷的ΔAoku70ΔAopyrG突變體，并利用mCherry熒光定位驗證了此遺傳轉(zhuǎn)化體系的可用性，為今后米曲霉RIB40的遺傳改造和功能基因研究奠定了基礎(chǔ)。