李 娜，附俊杰，劉 軍，溫雪瓶，李 麗,2,

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

蛋白質(zhì)是體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)。攝入的蛋白質(zhì)在胃腸道中被蛋白酶和肽酶降解，被吸收為小肽或游離氨基酸[1]。小肽比氨基酸更易被吸收，且具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗菌、降血脂等多種生物學(xué)功能，被廣泛應(yīng)用于食品和飼料生產(chǎn)中[2-4]。含蛋白質(zhì)的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物對生物活性肽的生產(chǎn)越來越具有吸引力，這有助于廢物的利用和價(jià)值的提高，如豆粕，菜粕，棉粕，花生粕等[5]。這些肽序列在含有完整的母蛋白序列時(shí)不顯示任何生物活性，因此首先必須水解，一般是通過與一種或多種蛋白酶酶解、發(fā)酵或兩者結(jié)合而催化水解。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵底物中蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)效應(yīng)以及理化性質(zhì)會發(fā)生變化，產(chǎn)生獨(dú)特的功能肽，如鮮味肽、抗菌肽[6-8]。但發(fā)酵效果易受微生物種類和所用發(fā)酵工藝的影響，乳酸菌、酵母菌在豆粕、菜粕脫毒和提升風(fēng)味中效果顯著，但由于其蛋白酶活低，使得豆粕、菜粕中的蛋白不能有效轉(zhuǎn)化[9]，菌酶協(xié)同是一種好的方式[10]。外源添加蛋白酶提高小肽的含量的同時(shí)，還可有效降低蛋白原料中的過敏原[11]。

中性蛋白酶具有催化速度快、催化過程溫和、無污染等優(yōu)點(diǎn)，常被用于食品、藥品、飼料行業(yè)[12]。中性蛋白酶產(chǎn)生的游離氨基酸類型豐富，制備呈味肽的效果優(yōu)于風(fēng)味蛋白酶，其產(chǎn)生的不益物質(zhì)以及水解度要比風(fēng)味蛋白酶低，因此中性蛋白酶用于發(fā)酵工藝可以降低酶的用量并提高原料的回收率[13-14]。蛋白質(zhì)是微生物產(chǎn)蛋白酶主要的底物來源，植物源蛋白可作為蛋白酶及多肽生產(chǎn)的潛在底物，如中性蛋白酶酶解紅花籽粕制備抗氧化肽，酶解大豆粕蛋白制備小分子肽[15-16]。

植物源蛋白的應(yīng)用逐漸成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，我國非傳統(tǒng)蛋白資源非常豐富，包括農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物、糟粕類、植物及其加工副產(chǎn)物等，這些植物源蛋白的利用有助于減少酶或多肽的生產(chǎn)成本，同時(shí)也會獲得多種活性功能的多肽。因此，適應(yīng)菜粕等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的高性能、高產(chǎn)量的蛋白酶新型菌株和連續(xù)發(fā)酵工藝亟需推進(jìn)。本研究從桑葉中篩選出一株高產(chǎn)中性蛋白酶的菌株，以菜粕作為氮源，通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，使得酶活顯著提高。該研究為植物源蛋白資源高值利用和植物蛋白向生物活性肽的轉(zhuǎn)化提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 -20 ℃下保藏，備用（品種為白桑葉，2021年5月采摘自某桑葉園）；干酪素、三氯乙酸、硫酸銅、無水碳酸鈉、葡萄糖、乳糖、曲拉通-100、吐溫60、吐溫80、尿素、氯化銨、硫酸鎂、可溶性淀粉、氯化鈉、氯化鉀、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鐵、硫酸銅、麥芽糖 分析純，均購于成都科隆化學(xué)品有限公司；福林酚試劑、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉 生化級，均購于成都奧博星生物技術(shù)有限公司；蔗糖 化學(xué)純，購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；司班60

化學(xué)純，購于成都科隆試劑有限公司；菜粕、豆粕、玉米粉 食品級，市售；DNA試劑盒 購自天根生化科技有限公司。

酪素培養(yǎng)基（g/L）：參考文獻(xiàn)[17]并稍加修改，干酪素4 g，并滴入少量20 g/L NaOH溶液和蒸餾水，在沸水浴下溶解后調(diào)pH至7.5，再加入1.07 g Na2HPO4.7 H2O作為A液。0.36 g K2HPO4加入少量蒸餾水溶解作為B液。A液和B液混合加入20 g瓊脂粉、0.5%酪素水解培養(yǎng)物2 mL，溶于1 L蒸餾水中，121 ℃滅菌15 min。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g/L、牛肉浸出粉3 g/L、氯化鈉5 g/L、pH7.2±0.2，溶于1 L蒸餾水中，121 ℃滅菌15 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖2 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、吐溫80 0.4%，溶于1 L蒸餾水中，121 ℃滅菌15 min。

T-114分析天平 奧豪斯儀器有限公司；QYC-2102C恒溫培養(yǎng)搖床 上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋、T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；HWS-260B恒溫恒濕箱、LS-75HD高壓蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；BM1000顯微鏡 南京江南永新光學(xué)有限公司；AT-710 pH計(jì) 日本京都電子制造有限公司；SPX-100B-Z單人單面凈化超凈工作臺 上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；Mini Amp PCR儀 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選基于文獻(xiàn)稍加修改[18-19]。

初篩：取20 g桑葉切碎加入150 mL生理鹽水中，37 ℃、195 r/min搖床培養(yǎng)20 min，用梯度稀釋法分別稀釋10-1～10-5濃度，分別從10-1～10-5稀釋液中取出100 μL涂布在酪素培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng)24 h，將產(chǎn)生透明圈菌株點(diǎn)注在酪素培養(yǎng)基上，觀察菌落與透明圈直徑大小，直徑較大的可以初步認(rèn)為是產(chǎn)蛋白酶能強(qiáng)的菌株，并用接種環(huán)挑取產(chǎn)透明圈菌株進(jìn)行純種劃線。

復(fù)篩：挑取產(chǎn)生透明圈的菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、195 r/min搖床培養(yǎng)35 h，測定中性蛋白酶活，結(jié)合初篩結(jié)果，挑選產(chǎn)中性蛋白酶活較高的菌株。

1.2.2 蛋白酶活力測定 根據(jù)GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》進(jìn)行蛋白酶活測定，堿性蛋白酶pH10.5、中性蛋白酶pH7.5、酸性蛋白酶pH3.0條件下測定。以L-酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程，吸光度值為縱坐標(biāo)，L-酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，回歸方程為y=0.0106x+0.0021，R2=0.9998。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 所篩菌株在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃好氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落，通過革蘭氏染色在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.3.2 生理生化特征分析 根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊（第八版）》對該菌種進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、苯丙氨酸脫羧酶測定、H2S試驗(yàn)、產(chǎn)氣試驗(yàn)。

1.2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 采用DNA試劑盒對篩選到的菌株進(jìn)行全基因組提取，以27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’）、1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）為引物對16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)純化后將樣品送擎科生物公司測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，之后利用MEGA6進(jìn)行基因排序匹配及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，得到基因序列同源性較高的菌株。

1.2.4 菌株產(chǎn)酶曲線 對數(shù)生長期的菌液以3%（v/v）接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、195 r/min搖床發(fā)酵，每隔8 h取樣，測定蛋白酶活，根據(jù)蛋白酶活的變化，確定最佳產(chǎn)酶時(shí)間。

1.2.5 不同培養(yǎng)基成分對菌株產(chǎn)酶的影響

1.2.5.1 不同碳源對菌株產(chǎn)酶的影響 對數(shù)生長期的菌液以3%（v/v）接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，其中葡萄糖替換為2 g/L（蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉），其余成分及含量不變，初始pH5.6、37 ℃、195 r/min搖床發(fā)酵40 h，測定蛋白酶活。最佳碳源以0.5、3.5、6.5、9.5、12.5 g/L添加進(jìn)不同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵40 h后測定蛋白酶活，選取最優(yōu)區(qū)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.5.2 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響 對數(shù)生長期的菌液以3%（v/v）接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，其中蛋白胨替換為10 g/L（牛肉膏、菜粕、豆粕、尿素、硝酸鉀、硫酸銨），其余成分及含量不變，初始pH5.6、37 ℃、195 r/min搖床發(fā)酵40 h，測定蛋白酶活。最佳氮源按1.5、11.5、19.5、27.5、35.5、43.5 g/L添加進(jìn)不同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵40 h后測定蛋白酶活，選取最優(yōu)區(qū)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.5.3 不同金屬離子對菌株產(chǎn)酶的影響 對數(shù)生長期的菌液以3%（v/v）接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，其中NaCl替換為5 g/L（MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、K2SO4、MnSO4），其余成分及含量不變，初始pH5.6、37 ℃、195 r/min搖床發(fā)酵40 h，測定蛋白酶活。最佳金屬離子按0.5、3、5.5、8、10.5 g/L添加進(jìn)不同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵40 h后測定蛋白酶活，選取最優(yōu)區(qū)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.5.4 不同表面活性劑對菌株產(chǎn)酶的影響 對數(shù)生長期的菌液以3%（v/v）接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，其中吐溫80分別替換為0.4%（吐溫60、Triton-100、司班60），其余成分及含量不變，初始pH5.6、37 ℃、195 r/min搖床發(fā)酵40 h，測定蛋白酶活。最佳表面活性劑按0.2、0.6、1、1.4、1.8 g/L添加進(jìn)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵40 h后測定蛋白酶活，選取最優(yōu)區(qū)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.5.5 酵母浸粉和磷元素對菌株產(chǎn)酶的影響 對數(shù)生長期的菌液以3%（v/v）接種至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加0、1、2、3、4 g/L的K2HPO4，0、3、6、9、12 g/L酵母浸粉，初始pH5.6、37 ℃、195 r/min搖床發(fā)酵40 h后測定蛋白酶活，探討酵母浸粉和磷元素對蛋白酶活的影響。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.6.1 Plackett-Burman（P-B）試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果。采用P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)對6個(gè)培養(yǎng)基成分（乳糖、菜粕、MgSO4、酵母浸粉、吐溫80、K2HPO4）進(jìn)行方差分析，將每個(gè)因素分為兩個(gè)水平，即低水平-1，高水平+1表示，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表 1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Plackett-Burman experimental design

1.2.6.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的3個(gè)顯著因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，綜合考慮各因素之間的正負(fù)影響并確定各因素步長和爬坡方向，其余成分按照低水平加入，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2。

表 2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of steepest climbing test

表 3 培養(yǎng)基成分響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)Table 3 Response surface optimization design of medium components

1.2.6.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 在上述試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。以培養(yǎng)基成分中各顯著因素為自變量，蛋白酶活為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，其余成分按照低水平加入。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)M的最佳產(chǎn)酶的培養(yǎng)基成分及相應(yīng)濃度進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3。

1.2.7 發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)酶的影響 除了培養(yǎng)基成分影響菌株產(chǎn)酶，發(fā)酵條件也是影響菌株產(chǎn)酶活力的重要因素。將菌體接入優(yōu)化培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD≈0.5）作為種子液并進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

1.2.7.1 溫度對菌株ppr3產(chǎn)酶的影響 對數(shù)生長期的菌液以3%（v/v）接種至優(yōu)化的培養(yǎng)基中，置于18、26、34、42、50 ℃，初始pH5.6、195 r/min搖床發(fā)酵40 h后測定蛋白酶活。

1.2.7.2 接種量對菌株ppr3產(chǎn)酶的影響 對數(shù)生長期的菌液分別以0.5%、3%、5.5%、8%、10.5%（v/v）接種至優(yōu)化的培養(yǎng)基中，初始pH5.6、37 ℃、195 r/min搖床發(fā)酵40 h后測定蛋白酶活。

1.2.7.3 初始pH對菌株ppr3產(chǎn)酶的影響 對數(shù)生長期的菌液以3%（v/v）接種至優(yōu)化的培養(yǎng)基中，初始pH分別調(diào)節(jié)為1、3、5、7、9，37 ℃、195 r/min搖床發(fā)酵40 h后測定蛋白酶活。

1.2.8 發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用中心組合設(shè)計(jì)獲得二次模型，中心點(diǎn)估計(jì)以蛋白酶活為指標(biāo)，對3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)M最佳產(chǎn)酶的發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表4。

表 4 發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)Table 4 Response surface optimization design of fermentation conditions

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 22進(jìn)行單因素ANOVA分析，采用Desige-Expert12軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立非線性回歸數(shù)學(xué)建模，并對模型進(jìn)行驗(yàn)證，該模型考慮了各因素之間的主次效應(yīng)以及因素之間的二級交互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

從采集的桑葉中篩選得到7株產(chǎn)生透明圈的菌株，挑取7株菌株點(diǎn)注在酪素培養(yǎng)基，見圖1，分別命名為ppr0、ppr2、ppr3、ppr4、ppr5、ppr6、ppr7，根據(jù)透明圈與菌株直徑比例，初步篩選酶活較高的菌株（表5），比值最大為菌株ppr3。通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對中性蛋白酶菌株復(fù)篩，結(jié)果顯示，中性蛋白酶活最高的仍為ppr3菌株，達(dá)到215.4±2.26 U/mL。表6展示了該菌株在不同蛋白酶測定方法下的蛋白酶活，中性蛋白酶活最高，為220.4±3.47 U/mL，因此菌株ppr3產(chǎn)中性蛋白酶，后續(xù)試驗(yàn)以ppr3為試驗(yàn)菌株進(jìn)行中性蛋白酶酶活的優(yōu)化。

圖 1 酪素培養(yǎng)基上篩選菌株的透明圈Fig.1 Transparent circle of strains screened on casein medium

圖 2 菌落形態(tài)圖片（左）與革蘭氏染色結(jié)果（右）Fig.2 Image of colony morphology (left) and observation of bacterial morphology under microscope (right)

表 5 透明圈與菌株直徑的比值及相應(yīng)酶活Table 5 Ratio of transparent circle to strain diameter and corresponding enzyme activities

表 6 不同pH下ppr3蛋白酶活Table 6 ppr3 Protease activity at different pH

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察 由圖2（左）可知，菌株近乳白色，邊緣光滑規(guī)則，呈圓形，表面濕潤。革蘭氏染色結(jié)果陽性，菌體形態(tài)桿狀（圖2（右））。

2.2.2 生理生化特征 生理生化結(jié)果顯示，菌株ppr3可分解葡萄糖、乳糖、蔗糖，不產(chǎn)氣，VP試驗(yàn)、MR試驗(yàn)為陰性，不具有色氨酸酶、苯丙氨酸脫羧酶，不可利用檸檬酸鹽作為碳源，不能分解含硫氨基酸，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，初步確定為芽孢桿菌屬。

2.2.3ppr3菌株的分子生物學(xué)鑒定 對菌株ppr3進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，如圖3所示，ppr3菌株16S rDNA在1000～2000 bp之間，表明已成功擴(kuò)增目的基因。建立系統(tǒng)發(fā)育樹，比較菌株之間的同源性，如圖4所示，ppr3與貝萊斯芽孢桿菌CBMB205同源性極高。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析，初步認(rèn)定ppr3菌株為貝萊斯芽孢桿菌，貝萊斯芽孢桿菌是一種新型益生菌，具有抗菌和改善腸道的能力[20]，本研究篩選的貝萊斯芽孢桿菌可能在食品與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛潛力。

圖 3 菌株ppr3 16S rDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electropherogram of strain ppr3 16S rDNA PCR amplification

2.3 菌株的產(chǎn)酶曲線

測定ppr3不同發(fā)酵時(shí)間段的中性蛋白酶活，繪制產(chǎn)酶曲線。由圖5（a）可知，菌株發(fā)酵過程中，蛋白酶活先升高后下降，40 h達(dá)到277.3±6.21 U/mL，最佳產(chǎn)酶時(shí)間為40 h，因此取40 h為發(fā)酵截止時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖 4 ppr3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Construction of strain ppr3 phylogenetic tree

2.4 不同培養(yǎng)基成分對蛋白酶活的影響

添加不同碳源對菌株ppr3產(chǎn)酶的影響如圖5（b）所示。結(jié)果表明，以乳糖為碳源時(shí)，蛋白酶活最高，酶活達(dá)297±6.66 U/mL，這與之前研究結(jié)果一致[21]，乳糖作為緩速碳源，有助于蛋白酶等代謝產(chǎn)物的合成[22]。當(dāng)乳糖濃度為3.5 g/L時(shí)，蛋白酶活最高達(dá)310±3.33 U/mL，隨著乳糖濃度增加，酶活逐漸下降，這可能是微生物傾向于更多碳源代謝，影響了蛋白酶的產(chǎn)生，其他代謝產(chǎn)物的積累也抑制了菌體的生長。因此選擇4.5和0.5 g/L作為P-B試驗(yàn)碳源的高低水平。

探究不同氮源對蛋白酶活的影響發(fā)現(xiàn)（圖5（c）），以菜粕和豆粕為氮源時(shí)，蛋白酶活最高，分別達(dá)到了382.83±4.45、385.35±6.19 U/mL，二者差異不顯著（P＞0.05），相比于無機(jī)氮源，部分有機(jī)氮源更利于菌株產(chǎn)生蛋白酶。菜粕中含有豐富的蛋白質(zhì)，可供蛋白酶的產(chǎn)生與利用[23-24]，且菜粕價(jià)格優(yōu)惠，故選擇菜粕作為最佳氮源進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)菜粕濃度為11.5 g/L時(shí)，蛋白酶活最高，為403±4.88 U/mL。繼續(xù)增加菜粕濃度，酶活出現(xiàn)先平穩(wěn)后下降的趨勢。菜粕濃度的增加，發(fā)酵液呈粘性狀態(tài)，當(dāng)發(fā)酵液粘性過大時(shí)，可能不利于菌體產(chǎn)酶。因此選擇18和2 g/L作為P-B試驗(yàn)氮源的高低水平。

不同金屬離子對蛋白酶活的影響如圖5（d）所示，添加Mg2+發(fā)酵組蛋白酶活最高，為305±8.67 U/mL，Na+、K+次之，添加Mn2＋、Zn2＋、Fe2＋、Cu2+酶活最低，且低于空白組。Mg2＋是蛋白酶的活性位點(diǎn)和活化劑，催化蛋白酶的產(chǎn)生，細(xì)胞中的某類蛋白系統(tǒng)對Mg2+濃度進(jìn)行了儲存，并運(yùn)輸?shù)竭m當(dāng)位置，組合成酶促系統(tǒng)，從而促進(jìn)了蛋白酶的產(chǎn)生[25-26]，因此選擇Mg2+為最佳金屬離子。Mg2＋濃度為3 g/L時(shí)，蛋白酶活達(dá)到291±5.12 U/mL，與Mg2＋濃度為5.5 g/L時(shí)的蛋白酶活無顯著差異（P＞0.05）。之后隨著Mg2＋濃度增加，酶活出現(xiàn)輕微下降，說明金屬離子濃度過高抑制酶的產(chǎn)生，因此選擇 3.5 和 0.4 g/L 作為 P-B 試驗(yàn)Mg2+的高低水平。

表面活性劑對蛋白酶活的影響見圖5（e），添加曲拉通-100對蛋白酶活有抑制作用，其他3種表面活性劑與對照組相比蛋白酶活無顯著差異（P＞0.05），非離子型表面活性劑可以增大細(xì)胞膜的滲透性，使得酶更容易分泌[27-28]，選取吐溫80進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。吐溫80濃度為0.6 g/L時(shí)，蛋白酶活最高，達(dá)到了294±6.33 U/mL，適量的表面活性劑對蛋白酶活有所提高，因此選擇1.0和0.3 g/L作為P-B試驗(yàn)吐溫80的高低水平。

添加不同濃度的酵母浸粉、K2HPO4發(fā)現(xiàn)（圖5（f）），隨著濃度的增加，蛋白酶活呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當(dāng)酵母浸粉、K2HPO4濃度分別為3 g/L和1 g/L時(shí)蛋白酶活最高，分別為387±5.88 U/mL和301±3.38 U/mL。即適量的酵母浸粉和K2HPO4可提高蛋白酶活。酵母浸粉中含有大量微生物可利用的生長因子[29]，K2HPO4中的P元素是微生物代謝的重要組成部分，可為蛋白酶起到pH緩沖作用[30]。因此選擇3.75和0.25 g/L作為P-B試驗(yàn)酵母浸粉高低水平，1.5和0.4 g/L作為P-B試驗(yàn)磷元素高低水平。

圖 5 菌種的產(chǎn)酶曲線及發(fā)酵培養(yǎng)基成分對酶活的影響Fig.5 Enzyme production curve of strain and effect of medium composition on enzyme activity

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

2.5.1 Plackett-Burman試驗(yàn) P-B用來評估實(shí)驗(yàn)誤差和一段模型的充分性[31]，通過P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)可獲得影響顯著的變量，從而為后續(xù)變量優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定因素與水平后，通過P-B試驗(yàn)（表1）篩選影響顯著的重要因素。如表7所示以蛋白酶活（Y）為響應(yīng)值，對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為Y=24.75A+26.92B-2.92C+16.25D-10.08E+14.58F。模型相關(guān)系數(shù)為R2=0.8854，P=0.0296＜0.05，該模型可用。P-B試驗(yàn)的方差分析如表8所示，從各因素P值可知，乳糖、菜粕對蛋白酶活影響顯著（P＜0.05）。根據(jù)F值將顯著因素由大到小排列為菜粕＞乳糖＞酵母浸粉＞K2HPO4＞吐溫80＞Mg2+，根據(jù)回歸方程各變量系數(shù)可知，乳糖、菜粕、酵母浸粉對蛋白酶活均表現(xiàn)為正效應(yīng)，選擇F值前三的影響因素進(jìn)行后續(xù)爬坡實(shí)驗(yàn)。

表 7 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Plackett-Burman experimental design and results

表 8 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)方差分析Table 8 Plackett-Burman design variance analysis

2.5.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)已確定的因素正負(fù)效應(yīng)，并依據(jù)前期試驗(yàn)確定爬坡方向及步長。由表9可知，第4組試驗(yàn)蛋白酶活最高，為483.79±6.65 U/mL，因此將第4組作為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

表 9 最陡爬坡試驗(yàn)Table 9 Steepest ascent experiment

2.5.3 培養(yǎng)基成分的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 以乳糖（A）、菜粕（B）、酵母浸粉（D）為自變量，蛋白酶活為響應(yīng)值（Y），通過軟件Design-Expert 12對表10進(jìn)行多元回歸擬合，得自變量A、B、D與因變量Y間的編碼回歸方程Y=4.77A+42.14B+18.61D-7.14AB-35.06AD+1.64BD-17.64A2-58.46B2-15.82D2，實(shí)際回歸方程Y=126.41A+55.02B+129.54D-0.45AB-10.02 AD+0.12BD-4.41A2-0.9B2-5.17D2。表11方差分析可知，模型P值=0.0015＜0.05，差異極顯著，失擬值P=0.6681＞0.05，不存在失擬現(xiàn)象，擬合度好。模型R2=0.9422，說明該模型能反映響應(yīng)值的變化。

表 10 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 10 Box-Behnken experimental design and results

表 11 蛋白酶活回歸分析Table 11 Regression analysis of protease activity

蛋白酶活響應(yīng)面曲面圖結(jié)果表明（圖6），乳糖和酵母浸粉有交互影響，乳糖和菜粕無交互作用，菜粕和酵母浸粉無顯著影響。利用軟件預(yù)測響應(yīng)值最大值，模型預(yù)測各因素組合為乳糖5.55 g/L、菜粕31.89 g/L、酵母浸粉7.09 g/L時(shí)，預(yù)測到最大蛋白酶活為501 U/mL，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得蛋白酶活為497±4.56 U/mL，達(dá)到了預(yù)測值的99%。

圖 6 各因素交互作用對貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.6 Responses surface plots showing the interactive effects of rapeseed meal, yeast extract and lactose levels on protease production by Bacillus velezensis

2.6 發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)酶的影響

除了發(fā)酵培養(yǎng)基會顯著影響菌株發(fā)酵過程中的蛋白酶活，溫度、初始pH等發(fā)酵條件也會對菌株的產(chǎn)酶起到關(guān)鍵作用。

如圖7A所示，在發(fā)酵溫度梯度變化下，蛋白酶活出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，34 ℃時(shí)蛋白酶活達(dá)到最高，為482.91±6.65 U/mL，50 ℃時(shí)達(dá)到最低，則此蛋白酶耐熱性低。由于蛋白酶作為活性蛋白，對環(huán)境因素敏感，易失活，會使蛋白酶活降低，適宜的發(fā)酵溫度可使酶變得活躍，從而增加蛋白酶活的產(chǎn)量[32]。

接種量對菌株產(chǎn)酶的影響見圖7B，當(dāng)接種量為3.0%時(shí)蛋白酶活達(dá)到468.68±1.64 U/mL，隨著接種量不斷增加，蛋白酶活和接種量3.0%時(shí)的蛋白酶活無顯著差異（P＞0.05）?？赡苁窃黾咏臃N量導(dǎo)致產(chǎn)酶時(shí)間提前，蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分也被更快消耗，沒有足夠的蛋白誘導(dǎo)，使得蛋白酶活無明顯變化。

不同初始pH對菌株ppr3產(chǎn)酶的影響顯示（圖7C），當(dāng)培養(yǎng)基初始pH5～7時(shí)蛋白酶活幾乎相同，分別為493.83±10.28、494.42±3.18 U/mL，pH9時(shí)蛋白酶活有顯著下降趨勢（P＜0.05），但仍然保持較高酶活，有研究表明貝萊斯芽孢桿菌生長最適pH5[33]。

2.6.1 發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 響應(yīng)面設(shè)計(jì)獲得了自變量發(fā)酵溫度（a）、pH（b）、接種量（c）與因變量Y間的編碼回歸方程（表12）Y=-13.69a+83.79b+12c+0.6475ab+2.56ac-6.13bc-60.67a2-113.49b2-7.98c2，實(shí)際回歸方程Y=62.16a+327.9b+14.23c+0.04ab+0.13ac-1.23bc-0.95a2-28.37b2-1.28c2。通過方差分析（表13），該模型P值＜0.01，表明差異極顯著，失擬值＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明不存在失擬現(xiàn)象，擬合度好，R2=0.9987，因此可以用此模型進(jìn)行驗(yàn)證分析。根據(jù)響應(yīng)面曲線及橢圓形曲線探討溫度、pH、接種量之間的交互作用，圖8顯示了溫度與pH之間無交互作用，接種量和pH之間有交互影響，溫度和接種量之間無交互作用。

圖 8 各因素交互作用對貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.8 Responses surface plots showing the interactive effects of temperature, pH and inoculation amount on protease production by Bacillus velezensis

表 12 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 12 Box-Behnken experimental design and results

表 13 蛋白酶活回歸分析Table 13 Regression analysis of protease activity

圖 7 發(fā)酵條件對蛋白酶活的影響Fig.7 Effect of fermentation conditions on protease activity

該模型預(yù)測發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度33 ℃，接種量為8.5%，初始pH5.7，蛋白酶活達(dá)到最大值502 U/mL,通過3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，蛋白酶活的平均值為500±5.86 U/mL，達(dá)到了預(yù)測值的98%，說明實(shí)際值與預(yù)測值有很好的擬合性。

3 結(jié)論

本研究篩選鑒定了一株高產(chǎn)中性蛋白酶的貝萊斯芽孢桿菌，蛋白酶活（215.4±2.26 U/mL）經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化，提高到500 U/mL，盧超等[34]、許曌昕等[35]篩選到的產(chǎn)中性蛋白酶菌株，蛋白酶活分別為401.83、192.7 U/mL，均低于本研究的酶活。同時(shí)貝萊斯芽孢桿菌具有潛在的益生作用[21]，這使得其在食品和農(nóng)業(yè)的應(yīng)用具有明顯優(yōu)勢。通過方差分析和二階模型回歸方程，表明最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度33 ℃，接種量為8.5%，初始pH5.7，培養(yǎng)基成分為乳糖5.55 g/L、菜粕31.89 g/L、酵母浸粉7.09 g/L、吐溫80 0.03%、MgSO40.04%，K2HPO40.04%。而菜粕作為替代蛋白，其成本相較于宋立立等[36]、郭艷霞等[37]顯著降低。使農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物得到了有效利用，但其工業(yè)生產(chǎn)有待擴(kuò)大研究，其產(chǎn)酶機(jī)理、酶學(xué)性質(zhì)及益生潛力也需要進(jìn)一步探索。