趙潔羽，魏 濤, ，秦 菲，劉 倩,2,

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

康普茶最早起源于我國(guó)，又被稱為紅茶菌、海寶茶，是一種具有獨(dú)特清爽、酸甜口感的發(fā)酵飲料，通常由多種微生物混合發(fā)酵糖茶水制成，所用茶的種類主要包括綠茶和紅茶等，除此以外，還可以向糖茶水中添加果蔬汁、植物浸提液和牛奶，或者直接利用上述物質(zhì)為原材料進(jìn)行發(fā)酵制備[1]。康普茶由發(fā)酵茶湯和菌膜組成，康普茶飲料的制作通常以先前發(fā)酵好的康普茶（包括茶湯和菌膜兩部分）為發(fā)酵劑，向其中添加新的糖茶水或者其他基料，發(fā)酵時(shí)間從5～21 d不等，飲用前利用過(guò)濾或離心的方式去除菌膜?？灯詹柚械奈⑸镏饕ń湍妇图?xì)菌兩大類，其種類和結(jié)構(gòu)組成在一定程度上受發(fā)酵原料、地域等因素影響。目前，從康普茶中已經(jīng)分離的酵母主要有類酵母屬、裂殖酵母屬、酒香酵母屬、假絲酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬和圓酵母屬等，細(xì)菌大部分為醋酸菌，主要包括醋酸桿菌、巴氏醋桿菌、產(chǎn)氮醋桿菌、葡糖醋桿菌、氧化葡萄糖酸桿菌和駒形桿菌等，除此以外有些康普茶中還含有少量的乳酸菌，主要以乳桿菌為主[2-5]。發(fā)酵過(guò)程中上述混合微生物可對(duì)糖茶水等原料中的碳水化合物及其他組分進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味，發(fā)酵后的產(chǎn)品化學(xué)組成復(fù)雜，含有機(jī)酸、維生素、活性酶、多酚和微量營(yíng)養(yǎng)素等多種物質(zhì)[6-9]?？灯詹杈哂卸喾N生物活性，例如能夠抑制念珠菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌等微生物的生長(zhǎng)，降低多發(fā)性硬化癥中IFN-γ和IL-17水平及脊髓組織NO濃度[10]，抑制α-淀粉酶和脂肪酶的活性、降低糖尿病大鼠血糖水平，增強(qiáng)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝、減輕炎癥和組織纖維化緩解非酒精性脂肪肝損傷[11]，以及調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝物等[12]。

20世紀(jì)以來(lái)，康普茶在歐美的許多國(guó)家和地區(qū)流行，市場(chǎng)發(fā)展成熟，康普茶相關(guān)產(chǎn)品種類和品牌較為豐富，除最基礎(chǔ)的以紅茶、綠茶等為基料生產(chǎn)的康普茶外，還有以水果、草藥、香料、蔬菜、藻類等為原料的許多品種，僅北美地區(qū)在康普茶釀造國(guó)際協(xié)會(huì)注冊(cè)的公司品牌就有162家，在基礎(chǔ)研究方面關(guān)于康普茶的體內(nèi)體外活性、組分的純化與結(jié)構(gòu)分析、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、微生物的分離純化鑒定、制作原料的拓展等方面均開(kāi)展了一定研究[13]。相比較而言，我國(guó)目前市場(chǎng)上售賣的康普茶品種較為單一，生產(chǎn)方面仍停留在小作坊階段，產(chǎn)品安全性和穩(wěn)定性較差，且缺乏正規(guī)、有影響力的品牌，而在基礎(chǔ)研究方面，已有一些關(guān)于康普茶中微生物的分離篩選、活性評(píng)價(jià)等相關(guān)工作，但多以研究者所在地的某一種康普茶為研究對(duì)象，對(duì)于我國(guó)不同地區(qū)康普茶的微生物組成、發(fā)酵性能、生理活性等缺乏統(tǒng)一的研究和比較。

針對(duì)上述問(wèn)題，本研究收集了來(lái)自我國(guó)不同地區(qū)的12個(gè)康普茶樣品，利用其發(fā)酵液和菌膜進(jìn)行康普茶飲料發(fā)酵制備，評(píng)價(jià)其感官、發(fā)酵性能及活性，利用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)其微生物多樣性進(jìn)行分析，為研究我國(guó)地域性康普茶性質(zhì)、開(kāi)發(fā)具有我國(guó)特色的康普茶產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶 張一元茶葉有限責(zé)任公司；白砂糖 北京糖業(yè)煙酒集團(tuán)有限公司；磷酸二氫鉀、沒(méi)食子酸、葡萄糖酸、乙酸、乳酸、抗壞血酸、檸檬酸、蘋果酸、丙酸、乙腈 上海麥克林生化科技有限公司；DNA抽提試劑盒 美國(guó)Omega Bio-Tek公司；福林酚試劑（Folin-phenol）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、瓊脂糖 上海生工生物科技有限公司；康普茶樣品具體信息見(jiàn)表1。

表 1 康普茶樣品基本信息Table 1 Basic information of kombucha samples

PHS-25型臺(tái)式pH計(jì) 青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；TGL-16G/B/C臺(tái)式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；Epoch全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器和B.02.01工作站） 美國(guó)安捷倫公司；0～80%Brix(糖)糖度計(jì) 上海力辰科技有限公司；ZSD-1090生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；ABI GeneAmp? 9700型PCR儀 美國(guó)ABI公司；JY600C三恒電泳儀 無(wú)錫久平儀器有限公司；MBE-200A凝膠成像儀 蘇州宇恒生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 康普茶飲料制備 蒸餾水煮沸，分別按照10和100 g/L加入綠茶和白砂糖，攪拌均勻，浸泡10 min，用四層紗布過(guò)濾并分裝至燒杯中，每個(gè)燒杯中加入300 mL的糖茶水，待冷卻至室溫后，接入10%（v/v）的各康普茶樣品的液體部分和5%（w/v）的菌膜部分，置于28 ℃靜置培養(yǎng)，分別于1、3、5、7 d時(shí)取樣備用。

1.2.2 康普茶飲料感官評(píng)價(jià) 根據(jù)譚培科等[14]的方法加以修改并對(duì)發(fā)酵7 d的康普茶飲料進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)小組（包括2名男性，8名女性，來(lái)自北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院）分別從色澤、氣味、滋味、整體喜好度四個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)（表2）。按照色澤20%、氣味20%、滋味20%、整體喜好度40%計(jì)算各樣品的綜合得分，并按照分?jǐn)?shù)80～100、70～79、60～69分為好、中、差三組。

表 2 康普茶飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of kombucha beverages

1.2.3 發(fā)酵性能及理化性質(zhì)測(cè)定

1.2.3.1 pH的測(cè)定 采用pH計(jì)對(duì)康普茶發(fā)酵液進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.2 可溶性固形物含量的測(cè)定 樣品于8000 r/min離心10 min，用糖度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液中可溶性固形物的含量。

1.2.3.3 總酸的測(cè)定 參照KAEWKOD等[6]的方法進(jìn)行總酸的測(cè)定，單位為g/100 mL（以乙酸計(jì)）。

1.2.3.4 有機(jī)酸的測(cè)定 采用高效液相色譜對(duì)康普茶中的有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)。樣品于室溫12000 r/min離心10 min，取上清，用流動(dòng)相進(jìn)行10倍稀釋，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾處理后備用。色譜柱：月旭Ultimate?OAA色譜柱（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：KH2PO4水溶液（0.01 mol/L，pH2.6），流速0.5 mL/min；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.2.3.5 總酚含量的測(cè)定 參照WU等[15]方法對(duì)樣品總酚含量進(jìn)行檢測(cè)，樣品于8000 r/min離心10 min，稀釋至合適濃度備用。取稀釋樣品1 mL于具塞試管中，加入Folin-Phenol試劑（10倍稀釋）0.5 mL，混勻后在室溫靜置5 min，依次加入10%的Na2CO3溶液1.5 mL、去離子水2 mL，混勻，于40 ℃保溫10 min、25 ℃下顯色1 h，測(cè)定760 nm下的吸光度值，記錄。樣品中總酚含量以沒(méi)食子酸計(jì)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=7.0061x-0.0164；R2=0.9981計(jì)算。

1.2.3.6 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參照丁艷如[16]的方法對(duì)樣品DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定，樣品于8000 r/min離心10 min，稀釋10倍備用，在該稀釋倍數(shù)下康普茶本身幾乎無(wú)色。取稀釋樣品2 mL、0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL于具塞試管中，混勻，于黑暗中反應(yīng)30 min，空白對(duì)照為10倍稀釋樣品與溶劑混合，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)517 nm下的吸光度。DPPH自由基清除率如下計(jì)算。

式中：A2為樣品與DPPH反應(yīng)后在517 nm處的吸光度；A1為樣品與溶劑混合后在517 nm處的吸光度；A0為溶劑與DPPH反應(yīng)后在517 nm處的吸光度。

1.2.3.7 微生物多樣性分析 根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；用338F（5’-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3’）引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性1 min，98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。用ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）引物對(duì)真菌ITS2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性1 min、98 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶，10 ng DNA模板。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 康普茶飲料感官評(píng)價(jià)結(jié)果

選擇發(fā)酵7 d的康普茶分別從色澤、氣味、滋味、整體喜好度四個(gè)維度進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和分組（表3）。對(duì)好、中、差三組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，分組為好的樣品liq2滋味評(píng)分較高，色澤和氣味評(píng)分接近，品評(píng)者認(rèn)為liq2樣品酸甜比例相對(duì)適中，氣味酸香且無(wú)雜味；分組為中的樣品在色澤上與分組為好的樣品基本無(wú)差別，但氣味和滋味評(píng)分較低，在氣味上，品評(píng)者認(rèn)為該組的樣品氣味有些偏酸或無(wú)明顯酸味，例如：樣品liq1、liq5、liq9、liq11、liq14、liq15、liq16氣味偏酸有些刺鼻，liq3、liq13酸香氣較弱，而滋味方面，品評(píng)者一致感覺(jué)liq1、liq11、liq15口感偏酸，liq5、liq9、liq14口感極酸，liq3號(hào)口感太甜；分組為差的樣品在色澤、氣味和滋味方面評(píng)分都較低，liq4口感寡淡，并且有一股腐臭的不良?xì)馕?，liq10口感酸苦，發(fā)酵液顏色渾濁（圖1）。

表 3 康普茶飲料感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Sensory evaluation of kombucha beverages

圖 1 康普茶飲料的感官評(píng)價(jià)分析Fig.1 Analysis of sensory evaluation of kombucha beverage

2.2 康普茶飲料發(fā)酵制備過(guò)程中pH變化

康普茶發(fā)酵過(guò)程中會(huì)將糖茶水中的蔗糖水解為葡萄糖和果糖，進(jìn)而代謝產(chǎn)生大量的乙酸、葡萄糖酸等，增加環(huán)境酸度，降低pH[6]。在未接種之前，糖茶水的pH為7.17，接種后liq10的pH降低至4.2，其余糖茶水的pH降低至3.0左右，這可能是因?yàn)榻臃N的康普茶原液酸度較高；隨后liq11、liq15的pH逐漸降低，除liq11、liq15外其他樣品的pH先升高，再逐漸降低，不同的變化趨勢(shì)可能是由于不同康普茶樣品的微生物組成不同。如圖2所示，大部分樣品在發(fā)酵的0～5 d pH逐漸降低，6～7 d pH逐漸趨于穩(wěn)定，最終發(fā)酵液的pH在2.5～3.4之間，而樣品liq4、liq13在發(fā)酵期間pH無(wú)明顯變化，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，liq4始終維持在3.4左右，liq13始終維持在3.0左右。以往的研究報(bào)道中，康普茶發(fā)酵后的pH也一般維持在2～3左右，例如ZOU等[17]分別以紫鵑茶、紅茶和綠茶為原料在 28 ℃ 發(fā)酵 14 d 后，其pH 分別為 2.6、2.8 和 2.6；JAKUBCZYK等[18]以綠茶、黑茶、白茶、紅茶四種不同的茶葉為基底，在28 ℃培養(yǎng)7 d后，發(fā)酵液的pH分別為2.61、2.62、2.53、2.38，在發(fā)酵14 d后，康普茶的pH進(jìn)一步降低至2.49、2.53、2.37、2.32。

圖 2 康普茶飲料發(fā)酵過(guò)程中pH的變化Fig.2 Changes of pH in the fermentation process of kombucha beverage

2.3 康普茶飲料發(fā)酵制備過(guò)程中可溶性固形物變化

可溶性固形物是發(fā)酵液中所有溶解于水的化合物的總稱，包括糖、酸、維生素、礦物質(zhì)等。研究表明，可溶性固形物與蔗糖含量呈正相關(guān)[19]。在發(fā)酵過(guò)程中，可溶性固形物的含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，且微生物活性越高，可溶性固形物含量越低。在康普茶發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌和細(xì)菌利用糖茶水中的可溶性固形物生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生有機(jī)酸、乙醇和CO2等物質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)酵液中可溶性固形物含量不斷下降。如圖3所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，liq2、liq3、liq5、liq9、liq11、liq13、liq14、liq15可溶性固形物含量有所下降，其中，liq15可溶性固形物含量變化最大，下降了25.53%；liq1、liq4、liq10、liq16在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中其可溶性固形物含量變化不大，維持在9.2～10°brx左右。

2.4 康普茶飲料發(fā)酵制備過(guò)程中總酸變化

總酸包含游離酸、結(jié)合酸和有機(jī)酸，是發(fā)酵過(guò)程中主要的代謝產(chǎn)物，可作為食品的防腐劑，延長(zhǎng)食品的保藏時(shí)間。如圖4所示，在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的酸度整體呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在發(fā)酵結(jié)束后，liq2、liq11、liq15、liq16的酸度相對(duì)較高，分別達(dá)到2.680、3.152、2.960和2.100 g/100 mL，liq3、liq4、liq5、liq9、liq10、liq13、liq14樣品酸度變化較小，在發(fā)酵結(jié)束后其酸度處于0.416～0.980 g/100 mL之間。康普茶的酸度受發(fā)酵時(shí)間、所用發(fā)酵劑和發(fā)酵原料影響，一般來(lái)說(shuō)當(dāng)添加水果原料時(shí)總酸高于單一茶基，例如：KAEWKOD等[6]以1%綠茶、烏龍茶、紅茶和10%蔗糖為原料，在室溫下發(fā)酵15 d后，各茶基康普茶的總酸度在1.100～1.700 g/100 mL之間；宋清鵬等[20]以龍眼果肉和糖茶水為發(fā)酵原料，在發(fā)酵6 d后發(fā)酵液的總酸含量達(dá)到2.600 g/100 mL；王柳玲等[21]以荔枝果汁為發(fā)酵原料制備康普茶，32 ℃發(fā)酵6 d后，發(fā)酵液的總酸含量可達(dá)2.480 g/100 mL。上述liq2、liq11、liq15和liq16等樣品在綠茶基中總酸即可達(dá)2.100 g/100 mL以上，說(shuō)明其發(fā)酵微生物具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

圖 3 康普茶飲料發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物的變化Fig.3 Changes of soluble solids in the fermentation process of kombucha beverage

圖 4 康普茶飲料發(fā)酵過(guò)程中總酸的變化Fig.4 Changes of total acid during fermentation process of kombucha beverage

2.5 康普茶飲料有機(jī)酸組成與含量

有機(jī)酸與風(fēng)味關(guān)聯(lián)性較大，感官評(píng)價(jià)采用的是發(fā)酵7 d的樣品，因此為與感官評(píng)價(jià)一致，對(duì)發(fā)酵7 d各樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)和分析。結(jié)果表明，不同發(fā)酵液中有機(jī)酸的含量與種類均有較大差別，從種類上看，各樣品中均含有葡萄糖酸、乙酸、乳酸和抗壞血酸，部分樣品中還含有檸檬酸、蘋果酸和丙酸；從含量上，各樣品中以葡萄糖酸、乙酸和乳酸含量較高，抗壞血酸含量基本一致（表4）。

表 4 發(fā)酵7 d各樣品中的有機(jī)酸含量Table 4 The content of organic acids in each sample after 7 days of fermentation

感官評(píng)價(jià)在好組的樣品liq2有機(jī)酸種類最為豐富，特別是與其他樣品相比，蘋果酸含量較高，蘋果酸的口感接近天然蘋果，酸味柔和，是一種具有天然香味的安全性食品酸味劑，同時(shí)也是人體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的重要有機(jī)酸，能直接參與線粒體能量代謝，具有增強(qiáng)機(jī)體耐力，緩解疲勞等生理功能[22]。感官評(píng)價(jià)在中組的各樣品與liq2相比，有機(jī)酸的種類及總有機(jī)酸含量均有所減少，樣品liq5雖含有一定的蘋果酸，但發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了過(guò)量的丙酸，丙酸具有酸臭味，當(dāng)吸入時(shí)會(huì)使喉嚨產(chǎn)生不適感的刺激性酸[23]，當(dāng)攝入過(guò)量時(shí)還會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐和腹痛等癥狀[24]。分組為差的各樣品在種類上與其他兩組相比只含有葡萄糖酸、乙酸、乳酸和抗壞血酸，并且各組分含量顯著下降，可能因此造成風(fēng)味較為寡淡。

2.6 康普茶飲料發(fā)酵制備過(guò)程中總酚變化

酚類化合物具有清除自由基和活性氧（如單線態(tài)氧、超氧自由基和羥基自由基）的能力，多酚含量越高，抗氧化活性越強(qiáng)，此外酚類化合物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等都有明顯的抑制作用[25]。由圖5可得，各樣品總酚含量呈波動(dòng)狀態(tài)，在發(fā)酵的前3 d，總酚含量呈下降趨勢(shì)，3 d后又逐漸上升，在發(fā)酵第7 d各樣品發(fā)酵液（除liq4樣品外）中總酚含量均高于未接種之前發(fā)酵液的總酚含量，liq13樣品總酚含量最高，為2.03 mg/mL。

圖 5 康普茶飲料發(fā)酵過(guò)程中總酚的變化Fig.5 Changes of total phenols in the fermentation process of kombucha beverage

2.7 康普茶飲料DPPH自由基清除率

對(duì)各樣品不同發(fā)酵時(shí)間的DPPH自由基清除率進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估其抗氧化性能。由圖6可得，發(fā)酵3和7 d時(shí)，各樣品對(duì)DPPH自由基的清除率均在75%以上，遠(yuǎn)高于0.1 g/L維生素C溶液的自由基清除率。發(fā)酵第3 d時(shí)，liq2的DPPH自由基清除率最大，可達(dá)87.9%，在發(fā)酵的第7 d，liq3的DPPH自由基清除率最大，為92.8%。在發(fā)酵時(shí)間的影響方面，樣品liq3、liq4、liq5、liq13、liq14、liq15和liq16在發(fā)酵7 d時(shí)DPPH自由基清除率高于發(fā)酵3 d樣品，而樣品liq1、liq2、liq9、liq10和liq11發(fā)酵7 d時(shí)的清除率與發(fā)酵3 d時(shí)相比有所下降或變化不大，表明在發(fā)酵制備過(guò)程中需控制好發(fā)酵時(shí)間，以便在合適時(shí)間內(nèi)得到具有最佳抗氧化能力的康普茶飲料。

圖 6 康普茶飲料（A）和維生素C（B）的DPPH自由基清除率Fig.6 DPPH free radical scavenging rates of kombucha beverage (A) and vitamin C (B)

圖 7 康普茶飲料中細(xì)菌在門水平（A）和屬水平（B）上的相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of bacteria in kombucha beverage at phylum (A) and genus (B) levels

2.8 康普茶飲料微生物多樣性分析

2.8.1 細(xì)菌多樣性分析 由圖7可得，在門水平上，12個(gè)康普茶飲料中細(xì)菌主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，變形菌門占據(jù)主導(dǎo)地位，相對(duì)豐度在95.79%以上。在屬水平上，各樣品中主要以駒形氏桿菌屬（Komagataeibacter）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖桿菌屬（Gluconobacter）為主。其中l(wèi)iq1、liq2、liq3、liq5、liq9、liq10、liq11、liq13的優(yōu)勢(shì)屬為駒形氏桿菌屬，liq9樣品的相對(duì)豐度最高，占比99.90%；liq4樣品的優(yōu)勢(shì)屬為醋酸桿菌屬，其相對(duì)豐度為70.8%；liq14樣品中則以駒形氏桿菌屬和葡糖桿菌屬為主，其中駒形氏桿菌屬相對(duì)豐度為50.65%，葡糖桿菌屬相對(duì)豐度為49.14%；liq15、liq16樣品中葡糖桿菌占據(jù)主要地位。此外，假黃單胞球菌（Pseudoxanthomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、羅爾斯通式菌屬（Ralstonia）、Georgenia、代爾夫特菌屬（Delftia）、Paraburkholderia、噬冷菌屬（Algoriphagus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、Cohnella、假單胞菌屬（Pseudomonas）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、Chujaibacter等在部分樣品中也有所出現(xiàn)，上述菌屬不在食品可添加微生物范圍，并且像假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬等微生物中許多菌株可使動(dòng)物或人類致病，是常見(jiàn)的條件致病菌[26-27]。

2.8.2 真菌多樣性分析 由圖8可知，在門水平上，不同樣品的優(yōu)勢(shì)菌門均為子囊菌門（Ascomycota），占比都在59%以上，其中l(wèi)iq15樣品子囊菌門相對(duì)豐度最高（99.70%），liq9樣品相對(duì)豐度最低（59.85%）。在屬水平上，主要以德克酵母屬（Dekkera）、Starmerella和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）為主。各樣品中菌屬的相對(duì)豐度差別較大，其中l(wèi)iq1、liq2、liq3、liq13、liq14主要以德克酵母屬為主，liq4、liq10和liq16豐度最高的菌沒(méi)有獲得屬分類；liq5、liq11和liq15的優(yōu)勢(shì)菌屬為Starmerella，其中l(wèi)iq5的相對(duì)豐度最高，為90.91%；liq9的優(yōu)勢(shì)菌屬為接合酵母屬，相對(duì)豐度為51.98%。此外鐮刀菌屬（Fusarium）、枝孢屬（Cladosporium）、木霉屬（Trichoderma）、Sagenomella等菌屬在部分樣品中有所出現(xiàn)。鐮刀菌屬是一種重要的植物病原菌，可引起小麥、玉米、甘蔗、牧草等糧食和經(jīng)濟(jì)作物的多組織的腐爛，被鐮刀菌侵染的谷物或者動(dòng)物源食品和制品還會(huì)產(chǎn)生嘔吐毒素等真菌毒素，該毒素具有細(xì)胞毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性等多種毒性，食用后會(huì)導(dǎo)致人體多種急性或慢性中毒，嚴(yán)重時(shí)會(huì)損害造血系統(tǒng)甚至死亡，增加人體患胃癌、食管癌等惡性腫瘤的幾率，可嚴(yán)重危害人和動(dòng)物健康[28]。

圖 8 康普茶飲料中真菌在門水平（A）和屬水平（B）上的相對(duì)豐度Fig.8 Relative abundance of fungi in kombucha beverage at phylum (A) and genus (B) levels

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)收集的12個(gè)康普茶樣品進(jìn)行發(fā)酵品評(píng)，發(fā)現(xiàn)制備的各飲料感官差別較大，有些樣品酸甜適口無(wú)雜味，有些口感過(guò)酸或過(guò)甜，有些則具有明顯的苦澀甚至腐敗氣味，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中pH、可溶性固形物、總酸等參數(shù)的監(jiān)測(cè)也表明不同樣品中微生物群的代謝、產(chǎn)酸等能力各不相同，部分樣品中微生物群活力較弱，接種后可溶性固形物、總酸等幾乎無(wú)變化，這可能是由于樣品在收集前已進(jìn)行了多次傳代，造成菌株退化，活力下降。對(duì)于利用可溶性固形物、產(chǎn)酸能力相近的樣品，在其有機(jī)酸組成方面也有所不同，例如：liq11和liq15與liq2相比總酸含量接近，但感官評(píng)價(jià)認(rèn)為liq2氣味酸香酸甜適中，liq11和liq15則氣味有些刺鼻口感偏酸，可能與liq11和liq15中乙酸含量較高有關(guān)，liq2與liq11和liq15相比乙酸含量下降，同時(shí)還含有一定量的蘋果酸，蘋果酸酸味柔和綿長(zhǎng)，能夠中和乙酸產(chǎn)生的刺激，改善食品風(fēng)味和品質(zhì)。

微生物的種類和組成對(duì)康普茶的風(fēng)味和活性具有重要影響，微生物多樣性分析可以從整體角度對(duì)各樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行描述。結(jié)果表明，本研究收集的各樣品發(fā)酵制備的飲料中細(xì)菌主要為駒形氏桿菌、葡糖桿菌和醋酸桿菌，真菌則以德克酵母、接合酵母和Starmerella為主。HARRISON等[29]對(duì)北美地區(qū)的103個(gè)康普茶飲品進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)酒香酵母和駒形氏桿菌在這些樣品中最為普遍，豐度最高，ARIKAN等[3]采用宏基因組測(cè)序和擴(kuò)增子測(cè)序相結(jié)合的方法對(duì)從土耳其當(dāng)?shù)丶彝ブ惺占膬蓚€(gè)康普茶飲品進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)真菌和細(xì)菌分別為接合酵母及駒形氏桿菌，與本文中樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬有所不同，說(shuō)明地域?qū)灯詹栉⑸锝M成具有一定影響。除優(yōu)勢(shì)菌屬外，通過(guò)多樣性分析發(fā)現(xiàn)發(fā)酵的飲料中還含有許多在食品中不能使用的、甚至對(duì)人體有毒有害的微生物，這可能是由于收集的康普茶樣品在其以往不規(guī)范的傳代、培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生了污染，表明了建立標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范康普茶生產(chǎn)工藝及菌劑傳代培養(yǎng)的急迫性和重要性。

多酚是以茶葉為原料制備的康普茶中一類重要的活性成分，因此對(duì)各樣品發(fā)酵過(guò)程中的總酚含量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明各樣品中的總酚含量呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，這可能是由于發(fā)酵初期微生物對(duì)茶湯中的多酚類化合物進(jìn)行了水解利用，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物產(chǎn)生的某些酶可對(duì)大分子多酚進(jìn)行水解、修飾及改造，例如：一些細(xì)菌和酵母可產(chǎn)生單寧酶，能夠水解表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子酸酯和表兒茶素，分別釋放出沒(méi)食子酸酯表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子酸和葡萄糖等，其他一些微生物產(chǎn)生的胞外酶，如植酸酶和β-半乳糖苷酶等，也可水解多酚釋放出結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的酚類化合物，ZHOU等[30]在以紅茶和綠茶為原料進(jìn)行發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸的含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，推測(cè)這可能是由于微生物產(chǎn)生的單寧酶所造成，蔣立文等[31]從康普茶中分離獲得了的裂殖酵母和產(chǎn)膜醋酸菌，對(duì)兩株菌進(jìn)行單獨(dú)發(fā)酵，評(píng)價(jià)其對(duì)兒茶素的代謝情況，結(jié)果表明兩株微生物均可提高表沒(méi)食子兒茶素以及沒(méi)食子兒茶素的含量。

綜上，本文從感官、理化性能評(píng)價(jià)以及微生物多樣性的角度，對(duì)我國(guó)地域的康普茶性質(zhì)及其安全性進(jìn)行了一定的研究，為開(kāi)發(fā)具有我國(guó)特色的康普茶產(chǎn)品提供理論依據(jù)，同時(shí)研究結(jié)果也說(shuō)明傳統(tǒng)的康普茶傳代制備方法在產(chǎn)品安全性、保持菌種活力等方面存在一定的問(wèn)題，表明了建立標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范康普茶生產(chǎn)工藝及菌劑開(kāi)發(fā)的急迫性和重要性。