張元元，趙歡歡，李國鋒，郝浩然，張映曈,4，李鵬霞,,,4,5,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)設(shè)施與裝備研究所，江蘇南京 210095；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110065；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點實驗室，江蘇南京 210095；5.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210095）

高壓脈沖電場技術(shù)是一種新型的非熱殺菌技術(shù)，通過在兩個電極板間瞬間產(chǎn)生的高脈沖電場來殺滅病原菌，能最大限度地保留食品的營養(yǎng)成分，目前已成為食品工業(yè)領(lǐng)域的研究熱點[1]。高壓脈沖電場的殺菌效果受多種因素影響，其中設(shè)備參數(shù)和微生物參數(shù)是兩個重要的方面。不同的電場強度、殺菌時間和脈沖占空比處理下，微生物的死亡率不同，設(shè)備參數(shù)的設(shè)置與微生物的殺滅效果緊密相關(guān)[2]。不同微生物對高壓脈沖電場的耐受程度不同，主要取決于其類型、生長時期、細(xì)胞壁的厚度等。一般認(rèn)為革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌更敏感，營養(yǎng)細(xì)胞比孢子更敏感[3]。高壓脈沖電場的殺菌機制是一大研究熱點，目前存在多種假說，電崩解理論和電穿孔理論是最重要的兩種[4]。其原理主要是通過對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞引起細(xì)胞內(nèi)容物外泄，導(dǎo)致微生物死亡[5-6]，因而不會引起基質(zhì)的顯著溫升，這對食品工業(yè)領(lǐng)域至關(guān)重要。

細(xì)菌性軟腐病是一類危害嚴(yán)重的采后病害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。該病害由多種病原細(xì)菌引起，其中最主要的是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的果膠桿菌屬（Pectobacterium）和迪基氏菌屬（Dickeya）[7]。其中果膠桿菌在全世界范圍內(nèi)寄主種類廣泛，通過產(chǎn)生和分泌果膠酶和纖維素酶破壞植物細(xì)胞壁，進而導(dǎo)致其腐爛變質(zhì)[8]。采后果蔬和甘薯等經(jīng)濟作物及其鮮切加工制品中常攜帶果膠桿菌，嚴(yán)重影響其貯運品質(zhì)、大大縮短貨架期，造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失。另外，由此產(chǎn)生的食品安全問題也對消費者的生命健康造成極大威脅。目前，在采后及鮮切加工行業(yè)，主要采用的是臭氧、電解水、紫外線和次氯酸鈉等傳統(tǒng)殺菌方式。但通過以上殺菌方式存在不能廣譜殺菌、殘留水漬造成二次腐敗、僅能殺滅直接照射區(qū)域以及存在化學(xué)殘留等問題。因此亟需尋找一種高效安全的方式實現(xiàn)采后及鮮切加工制品中果膠桿菌以及其他致病菌的非熱殺菌。

本研究擬以實驗室前期在娃娃菜采后軟腐病菜葉中分離鑒定的果膠桿菌C-11為模型，研究高壓脈沖電場不同處理條件對果膠桿菌的殺滅效果，并通過測定處理后果膠桿菌的生長曲線、細(xì)胞膜脂肪酸、滲透率、蛋白質(zhì)和核酸泄漏量等指標(biāo)對高壓脈沖電場殺菌機理進行初步探索，同時建立了高壓脈沖電場-果膠桿菌致死動力學(xué)模型，為進一步實現(xiàn)高壓脈沖電場殺菌保鮮在采后和鮮切行業(yè)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普通肉湯培養(yǎng)基(Lysogeny broth, LB)、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(Plate count agar, PCA) 上海盛思生化科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient agar medium, NA) 青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉（99%） 上海久億化學(xué)試劑有限公司；次氯酸鈉（98%） 西隴化工股份有限公司；無水乙醇 鎮(zhèn)江久億化學(xué)試劑有限公司。

DMC-200高壓脈沖電源 大連鼎通科技發(fā)展有限公司；SW-CJ-1B型凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；MIR234恒溫培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；DW-86L486型超低溫冰箱 Haier公司；PHSJ-3F型pH計 上海雷磁新徑儀器有限公司；HH-S系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州萬達升實驗儀器有限公司；M603Di型電子天平 意大利Bel公司；3K15型高速臺式冷凍離心機 Sigma公司；78-1磁力加熱攪拌器 武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司；FM40雪花制冰機 北京長流科學(xué)儀器公司；SC-329GA透明門立式冷藏柜 Haier公司；Eppendorf Bio Photometer plus紫外分光光度計 德國 Eppendorf公司；島津GC-2010氣相色譜儀 日本島津制作所。

1.2 實驗方法

1.2.1 果膠桿菌的活化 取本實驗室前期保藏的果膠桿菌（Pectobacterium carotovorumC-11，本實驗室保藏）菌液，接種至NA培養(yǎng)基。挑取果膠桿菌單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min搖培6 h左右，離心后用生理鹽水洗滌菌液3次后，調(diào)整懸浮液濃度為107～108CFU/mL。

1.2.2 高壓脈沖電場處理 高壓脈沖處理室的清洗消毒：每次實驗前先用100 mg/L的次氯酸鈉溶液清洗電極板和處理室，再用無菌水沖洗數(shù)次，用無菌紗布擦干積水。

取50 mL 107～108CFU/mL的果膠桿菌懸液，離心后用同等體積稀釋50倍的生理鹽水重懸，置于高壓脈沖電場下處理。處理裝置如圖1所示，處理室寬度10 cm，電極板間距最低可調(diào)節(jié)至2.0 cm。處理條件為：設(shè)定電場強度分別為0、4、8、12、16、20、24、28、32和36 kV/cm，固定處理時間1 min、脈沖占空比49.2%、脈沖頻率1000 Hz，作為考察電場強度影響作用的處理參數(shù)。設(shè)定脈沖占空比分別為0、6.5%、13.5%、20.5%、24.8%、30.9%、36.5%、42.6%和49.2%，固定電場強度28 kV/cm、處理時間1 min、脈沖頻率1000 Hz，作為考察脈沖占空比影響作用的處理參數(shù)。設(shè)定脈沖頻率分別為0、200、400、600、800和1000 Hz，固定電場強度28 kV/cm，處理時間1 min、脈沖占空比36.5%，作為考察脈沖頻率影響作用的處理參數(shù)。設(shè)定處理時間分別為0、1、5、10和15 min，固定電場強度28 kV/cm、脈沖占空比36.5%、脈沖頻率200 Hz，作為考察處理時間影響作用的處理參數(shù)。整個處理過程置于20±2 ℃室內(nèi)進行。

圖 1 高壓脈沖電場處理裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of high voltage pulsed electric field treatment device

1.2.3 不同處理條件對果膠桿菌滅菌效果的影響取50 mL 107～108CFU /mL的果膠桿菌懸液，在不同電場強度、脈沖占空比、脈沖頻率和時間條件下處理，梯度稀釋后，分別吸取10-3、10-4和10-5稀釋度的菌懸液100 μL，平板涂布后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)約20 h，記錄平板上的菌落總數(shù)，以不做任何處理的菌懸液為對照。每個處理設(shè)3個平行，用活菌對數(shù)減少值Q來表示滅菌效果[9]。根據(jù)滅菌效果選擇其中影響較顯著的因素進行后續(xù)研究。

式中：N0表示高壓脈沖電場處理前的活菌數(shù)，CFU/mL；N表示高壓脈沖電場處理后的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.4 電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌生長曲線的影響 采用分光光度法測定不同時間果膠桿菌懸液的OD600值并繪制生長曲線[10]：分別吸取5 μL處理過（不同電場強度和脈沖占空比）和未處理的果膠桿菌懸液，接種至裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中。將所有試管置于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)，每隔2 h測量一次OD600值，測至第24 h，每個處理重復(fù)3次。以時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，作果膠桿菌的生長曲線圖。

1.2.5 電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌細(xì)胞膜脂肪酸含量的影響 根據(jù)Bligh & Dyer的方法[11]改良后進行脂肪酸提?。菏占煌妶鰪姸群兔}沖占空比處理的菌體進行冷凍干燥，稱取凍干菌體（20 mg）于提脂瓶中，加入2 mL 4 mol/L的鹽酸溶液，80 ℃水浴30 min，期間反復(fù)振蕩，置于-80 ℃超低溫冰箱速凍15 min。反復(fù)凍融3次后室溫融化提取脂肪酸。加入100 μL 2.02 mg/mL十五烷酸（C15: 0）為內(nèi)標(biāo)，同時加入1 mL甲醇，1 mL三氯甲烷。置于搖床250 r/min振蕩30 min后3000 g離心5 min，取三氯甲烷層轉(zhuǎn)移至干凈提脂瓶中，重復(fù)三次。氮氣吹干，加入1 mL 10%鹽酸甲醇，60 ℃水浴3 h，加入1 mL飽和NaCl，2 mL正己烷，渦旋振蕩，3000 g離心5 min，吸取正己烷層進行脂肪酸測定。

氣相色譜（島津GC-2010）程序[12]為：120 ℃，3 min，以5 ℃/min的速率升到200 ℃，再以4 ℃的速率升到220 ℃，保持2 min。色譜柱為DB-WAXETR（30 m×0.32 mm），膜厚度0.25 μm。檢測器為氫離子火焰檢測器，進樣體積1 μL，分流比為10:1，載氣為氮氣。以內(nèi)標(biāo)為參照，分析各脂肪酸峰面積，并計算得到總脂肪酸和不飽和脂肪酸所占百分含量。計算公式為：

式中：Asi為單個脂肪酸對應(yīng)的峰面積；A內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo)對應(yīng)的峰面積；c內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo)的濃度（μg/μL）；V內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo)體積（μL）；m稱重為菌體重量（g）。

1.2.6 電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌細(xì)胞膜通透性的影響 處理前的菌懸液（107～108CFU/mL），在25 ℃恒溫水浴鍋中用電導(dǎo)儀先測定溶液初始電導(dǎo)率，記為C0。處理后（不同電場強度和脈沖占空比）收集菌液后立刻放入25 ℃水浴鍋以保持室溫，測定電導(dǎo)率，計為C1。測完后，將所有試管放入沸水中煮10 min，冷卻至25 ℃后再次測定各電導(dǎo)率值，記為C殺。根據(jù)以下公式計算相對電導(dǎo)率值（%），用相對電導(dǎo)率表示菌體細(xì)胞膜的通透性[13-14]，每個處理設(shè)3個平行。

式中：C0表示初始電導(dǎo)率值，%；C1表示處理后的電導(dǎo)率值，%；C殺表示煮沸殺死后的電導(dǎo)率值，%。

1.2.7 電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌核酸和蛋白質(zhì)泄漏量的影響 將配制好的107～108CFU/mL的菌懸液，置于不同電場強度和脈沖占空比條件下處理，取經(jīng)過處理的果膠桿菌懸液于4 ℃、8000 r/min離心10 min，取上清20 mL，真空冷凍干燥（冷阱溫度在-55至-40 ℃，真空度為5～100 mTorr，干燥時間24 h）濃縮后，以2 mL生理鹽水重懸，使用微量分光光度計測定260 nm（核酸）和280 nm（蛋白質(zhì)）OD值，每個處理設(shè)3個平行，對照為未處理的菌懸液，空白為生理鹽水，通過胞外260 nm（核酸）和280 nm（蛋白質(zhì)）OD值大小分析核酸和蛋白質(zhì)泄露情況[9]。

1.2.8 高壓脈沖電場對不同生長期果膠桿菌存活率的影響 設(shè)置電場強度分別為0、4、8、12、16、20、24和28 kV/cm，固定處理時間為1 min、脈沖占空比為36.5%、脈沖頻率為200 Hz，或設(shè)置脈沖占空比分別為0、6.5%、13.5%、20.5%、24.8%、30.9%和36.5%，固定電場強度28 kV/cm、處理時間1 min、脈沖頻率200 Hz，作為高壓脈沖電場處理參數(shù)。收集不同生長期的菌液（培養(yǎng)5 h為延滯期，10 h為對數(shù)期，18 h為平臺期），置于高壓脈沖電場下處理，稀釋后，分別吸取10-3、10-4和10-5稀釋度的菌懸液100 μL，平板涂布后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)約20 h，記錄平板上的菌落總數(shù)，用存活率S來表示滅菌效果。

式中：N0表示高壓脈沖電場處理前的活菌數(shù)，CFU/mL；N表示高壓脈沖電場處理后的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.9 存活率與各處理條件的動力學(xué)模型建立 本實驗以Hülsheger模型[15]來分析處理條件與果膠桿菌存活率之間的關(guān)系。根據(jù)Hülsheger模型，假設(shè)微生物數(shù)量的變化與處理條件的變化程度成正比，即呈一級反應(yīng)關(guān)系，比例系數(shù)為KP。以上假設(shè)可以用式（7）表示：

Hülsheger模型：

結(jié)合式（6）、（7）得：

由式（8）得

式中：S=NP/N0表示存活率，%；N0和NP分別表示高壓脈沖電場處理前后的微生物數(shù)量，CFU/mL；E為實際應(yīng)用的電場強度；Kp、bE為回歸系數(shù)，表示微生物對高壓脈沖電場敏感性的參數(shù)，其值越大，微生物對處理條件越敏感，殺滅效果也越好，這與微生物種類和介質(zhì)有關(guān)；Pc、EC指處理條件的臨界值，表示微生物的存活率剛剛低于100%時所需要的處理條件參數(shù)；P指處理條件（電場強度、占空比等）。

以果膠桿菌對數(shù)減少值lnS為縱坐標(biāo)，電場強度或脈沖占空比為橫坐標(biāo)，作不同電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌的致死動力學(xué)圖。

以果膠桿菌存活率為縱坐標(biāo)，電場強度或脈沖占空比為橫坐標(biāo)，作不同電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌致死作用的擬合曲線圖。

對實驗的結(jié)果和擬合的預(yù)測值進行方差分析，如果兩組數(shù)據(jù)沒有差異性即說明模型準(zhǔn)確性較高。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用Excel、SPSS 20、Origin 8.5分析軟件進行統(tǒng)計處理，利用鄧肯氏多重比較法在P=0.05的水平下進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理條件對果膠桿菌滅菌效果的影響

經(jīng)不同條件脈沖電場處理后，菌懸液中活菌對數(shù)減少值與處理條件之間的關(guān)系如圖2所示。由圖2A可以看出，隨電場強度的增大，果膠桿菌的活菌對數(shù)減少值逐漸增大，當(dāng)電場強度為28 kV/cm時，殺菌效果最佳，可達1.52個數(shù)量級，繼續(xù)增加電場強度，殺菌效果提高不明顯，這可能與果膠桿菌對電場強度的耐受程度有關(guān)。由圖2B所示，果膠桿菌活菌對數(shù)減少值前期與脈沖占空比呈顯著正相關(guān)（r=0.96，P＜0.05），當(dāng)脈沖占空比為36.50%，殺菌效果可達1.60個數(shù)量級。不同脈沖占空比殺菌效果不同可能是因為細(xì)胞在高電平和低電平時的狀態(tài)存在差異[16]，占空比為0%時，脈寬小，脈沖電場沒有高電平部分作用于樣品，殺菌效果差；脈寬過長，細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)高電平狀態(tài)，繼續(xù)提高占空比至42.6%和49.2%不會增加殺菌效果。另外，處理時間和脈沖頻率與果膠桿菌的活菌對數(shù)減少值沒有顯著相關(guān)性（圖2C、2D；P＞0.05），當(dāng)處理時間達到1 min，脈沖頻率達到200 Hz時，菌懸液中活菌對數(shù)減少值分別為1.66和1.57，但繼續(xù)延長處理時間或提高脈沖頻率，則對數(shù)減少值不再有顯著變化（P＞0.05），即延長處理時間或提高脈沖頻率均不會使果膠桿菌的數(shù)量明顯下降。這與李楠楠[17]在使用不同脈沖頻率高壓脈沖電場處理金黃色葡萄球菌、大腸菌群、酵母菌和霉菌中的結(jié)果相似，推斷果膠桿菌C-11對處理時間和脈沖頻率不敏感可能與初始菌落數(shù)量及果膠桿菌自身特性有關(guān)。因此認(rèn)為在本實驗裝置與條件下，電場強度和脈沖占空比是影響果膠桿菌殺滅效果的主要因素，后續(xù)試驗將針對這兩個因素展開研究。

圖 2 不同電場強度（A）、脈沖占空比（B）、處理時間（C）和脈沖頻率（D）對果膠桿菌殺滅效果的影響Fig.2 Effects of different electric field intensities (A), pulse duty factors (B), treatment time (C) and pulse frequencies (D) on the killing effect of Pectobacterium carotovorum

2.2 電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌生長曲線的影響

生長曲線是反映微生物數(shù)量隨時間變化的過程，從曲線中可以看出微生物對培養(yǎng)條件的適應(yīng)情況，并反映其生長、繁殖和衰亡的規(guī)律。圖3表明高壓脈沖電場處理對果膠桿菌的生長有明顯的抑制作用，且隨著電場強度和脈沖占空比的增大，抑制作用逐漸增大。主要表現(xiàn)在延長了果膠桿菌生長的延滯期，與對照組相比，不同電場強度處理組果膠桿菌的延滯期延長了2～6 h（圖3A），不同脈沖占空比處理組延滯期延長了2～4 h（圖3B），生長速率明顯受到抑制。這與王婷玉等[18]在大腸桿菌中的研究結(jié)果相似，即經(jīng)高壓脈沖電場處理后，大腸桿菌延滯期均有不同程度的增加，且其延滯期隨著處理條件的增強而延長。相應(yīng)地，處理組果膠桿菌對數(shù)期生長速率也有不同程度下降，到達穩(wěn)定期的時間也相應(yīng)延遲。因此，推斷高壓脈沖電場可以通過抑制果膠桿菌的生長，起到防腐保鮮的作用。

圖 3 不同電場強度（A）和脈沖占空比（B）對果膠桿菌生長曲線的影響Fig.3 Effects of different electric field intensities (A) and pulse duty factors (B) on the growth curve of Pectobacterium carotovorum

2.3 電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響

通過脂肪酸檢測發(fā)現(xiàn)果膠桿菌C-11細(xì)胞膜的主要脂肪酸成分為月桂酸（C12:0）、豆蔻酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）、棕櫚油酸（C16:1）和油酸（C18:1）。處理之前，總脂肪酸含量相對含量為95.69%，不飽和脂肪酸相對含量為60.42%。在不同電場強度處理后，不飽和脂肪酸含量逐漸下降（圖4B）。當(dāng)電場強度為28 kV/cm時，含量最低，僅為50.88%，與處理前相比下降了9.54%。而總脂肪酸相對含量在28 kV/cm之前也呈下降趨勢，但下降幅度不高，主要是因為部分不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為了飽和脂肪酸。當(dāng)電場強度為28 kV/cm時，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例為1.31，與處理前相比下降了27.22%。同樣，提高脈沖占空比也使得不飽和脂肪酸含量顯著下降（P＜0.05，圖4D）。當(dāng)占空比為36.5%時，不飽和脂肪酸含量最低，為50.21%，此時不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例為1.25，與對照組（1.80）相比下降了30.56%。

圖 4 不同電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌總脂肪酸（A、C）和不飽和脂肪酸（B、D）相對含量的影響Fig.4 Effects of different electric field intensities and pulse duty factors on the relative amount of total (A, C) and unsaturated (B, D) fatty acid of Pectobacterium carotovorum

圖 5 不同電場強度（A）和脈沖占空比（B）對果膠桿菌細(xì)胞膜滲透率的影響Fig.5 Effects of different electric field intensities (A) and pulse duty factors (B) on membrane permeability of Pectobacterium carotovorum

本研究的結(jié)果與高壓脈沖電場處理釀酒酵母BY4742后總脂肪酸相對含量以及不飽和脂肪酸相對含量顯著下降的結(jié)果一致[19]。此外，在脈沖電場處理的葡萄汁和花生油中也發(fā)現(xiàn)，總脂肪酸和不飽和脂肪酸含量有不同程度的下降[20-21]。這種對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響可能與高壓脈沖電場處理引起的氫自由基產(chǎn)生有關(guān)[22]：氫自由基攻擊不飽和脂肪酸與雙鍵相鄰的α-亞甲基氫原子后使不飽和脂肪酸按照自動氧化的鏈反應(yīng)機制發(fā)生氧化反應(yīng)，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其功能的損傷。

2.4 電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌細(xì)胞膜通透性的影響

當(dāng)微生物細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損傷時通透性會增加，造成細(xì)胞內(nèi)離子外滲，因此常把細(xì)胞膜滲透率作為衡量細(xì)胞膜受損程度的重要指標(biāo)[23]。如圖5A所示，在不同電場強度處理下，除4 kV/cm處理組與對照組無顯著性之外（P＞0.05），8、12、16、20、24、28、32和36 kV/cm的細(xì)胞膜滲透性均高于對照組，滲透率分別增加了0.38、0.58、0.73、1.15、1.42、1.85、1.81和1.80倍，與對照組均有顯著性差異（P＜0.05）；由圖5B可知，采用不同脈沖占空比處理時，所有處理組均與對照組有顯著性差異（P＜0.05），6.5%、13.5%、20.5%、24.8%、30.9%、36.5%、42.6%、和49.2%處理組滲透率分別增加了0.80、2.45、3.56、4.86、8.92、11.82、11.88和11.68倍。綜上，高壓脈沖電場處理能增加細(xì)胞膜的滲透率，且隨著電場強度和脈沖占空比的增大，對細(xì)胞膜滲透率的影響越大。當(dāng)電場強度和脈沖占空比為28 kV/cm和36.5%時細(xì)胞膜滲透率達到最大值。這與該處理條件下果膠桿菌細(xì)胞膜不飽和脂肪酸相對含量以及不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比例達到最低值相一致，意味著在此條件下，對果膠桿菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能造成了損傷。

2.5 電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌核酸和蛋白質(zhì)泄漏量的影響

核酸和蛋白質(zhì)是細(xì)胞重要的生命物質(zhì)，其泄漏量可以反映細(xì)胞膜的受損傷程度。由圖6可知，電場強度和脈沖占空比對蛋白質(zhì)和核酸的泄漏量有顯著性影響（P＜0.05）：當(dāng)電場強度在4～16 kV/cm范圍內(nèi)變化時，胞內(nèi)物質(zhì)泄漏量較為緩慢，16 kV/cm以后泄漏量變化愈加明顯（圖6A）。當(dāng)電場強度達到28 kV/cm時，核酸和蛋白質(zhì)的泄漏量分別為對照組的1.50和2.00倍；同樣，不管采用何種脈沖占空比，處理組與對照組相比核酸與蛋白質(zhì)泄露量都顯著增加（P＜0.05）。當(dāng)脈沖占空比為36.5%時，核酸和蛋白質(zhì)的泄漏量分別為對照組的1.60和2.02倍。以上結(jié)果表明，高壓脈沖電場處理會使果膠桿菌細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄露，且隨著電場強度和脈沖占空比的增大，相對泄漏量也逐漸增大。當(dāng)電場強度和脈沖占空比為28 kV/cm和36.5%時核酸和蛋白質(zhì)泄露最嚴(yán)重。因此后續(xù)在研究高壓脈沖電場對不同生長階段果膠桿菌存活率時電場強度和脈沖占空比最高設(shè)置到28 kV/cm和36.5%。

圖 6 不同電場強度（A）和脈沖占空比（B）對果膠桿菌胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏量的影響Fig.6 Effects of different electric field intensities (A) and pulse duty factors (B) on nucleic acid and protein leakage of Pectobacterium carotovorum

“電崩解”和“電穿孔”是目前高壓脈沖電場殺菌機制中討論較多的兩種理論[24]。電崩解理論認(rèn)為微生物的細(xì)胞膜在外加電場的作用下，發(fā)生可逆的細(xì)胞膜破裂，當(dāng)長時間作用時，這種可逆的破裂就轉(zhuǎn)化為了細(xì)胞膜大面積不可逆的崩解。電穿孔主要是由于外加電場導(dǎo)致微生物胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，一些小分子如水進入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞吸水膨脹，微生物最終崩潰死亡[25-26]。因此常把細(xì)胞膜滲透率以及核酸和蛋白質(zhì)泄漏量作為衡量細(xì)胞膜受損程度的重要指標(biāo)[27]。HAMILTON等[15]發(fā)現(xiàn)當(dāng)外加電場導(dǎo)致細(xì)胞的跨膜電位達到1 V左右時，細(xì)胞膜就會被擊穿（這個值被稱為擊穿電位），胞內(nèi)的離子、核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)泄漏到胞外，導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡。電崩解可以看作是導(dǎo)致電穿孔的基礎(chǔ)。在本實驗中，高壓脈沖電場處理增大了果膠桿菌的細(xì)胞膜滲透率，從而使胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏，且隨著電場強度和脈沖占空比的增大，細(xì)胞膜滲透率逐漸增大，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏量逐漸增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該研究結(jié)果與電崩解和電穿孔理論相一致。

2.6 高壓脈沖電場對不同生長期果膠桿菌存活率的影響

從圖3可知果膠桿菌的生長曲線可分為三段，0～5 h為延滯生長期，5～10 h為對數(shù)增長期，18 h以后進入穩(wěn)定期。因此分別收集培養(yǎng)了5、10和18 h的果膠桿菌培養(yǎng)液，研究處于延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期的果膠桿菌對高壓脈沖電場敏感程度的差異。由圖7A可知，隨著電場強度的增大，不同生長期果膠桿菌的存活率均呈下降趨勢，且處于對數(shù)生長期的果膠桿菌存活率最低，其次是穩(wěn)定期，延滯期的存活率最高。當(dāng)電場強度在4～16 kV/cm范圍時，對數(shù)生長期的果膠桿菌存活率顯著低于其他兩個生長階段（P＜0.05）。說明果膠桿菌在對數(shù)生長期時對高壓脈沖電場最敏感，其次是穩(wěn)定期，在延滯期殺菌效果最差。此外，在不同脈沖占空比處理不同生長期果膠桿菌實驗中也發(fā)現(xiàn)，對數(shù)生長期更為敏感（圖7B）。該結(jié)果這與之前的一些研究結(jié)果相似。例如，ORTUNO等[28]用超臨界CO2處理不同生長時期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌時，發(fā)現(xiàn)對數(shù)生長期的微生物更為敏感；洪晨[29]則發(fā)現(xiàn)對數(shù)生長期的大腸桿菌對脈沖強光處理最敏感；而用脈沖磁場處理枯草芽孢桿菌時，對數(shù)生長期比穩(wěn)定生長期和延滯生長期殺菌效果更好[30]。這可能是因為對數(shù)期的細(xì)菌正處于快速分裂期，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)物質(zhì)均不穩(wěn)定，更容易受脈沖電場等外界刺激的影響。但嚴(yán)志明等[31]卻發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在平臺期時的殺菌效果最差，在延滯生長期時的殺菌效果最好，這可能是由于菌種和培養(yǎng)環(huán)境不同，導(dǎo)致不同細(xì)菌的敏感區(qū)段有所差異。

圖 7 果膠桿菌不同生長期對高壓脈沖電場殺滅效果的影響Fig.7 Effects of different growth periods of Pectobacterium carotovorum on the killing effect of high pulsed electric field

2.7 存活率與各處理條件的動力學(xué)模型建立

2.7.1 電場強度及脈沖占空比對果膠桿菌的致死動力學(xué)方程 以Hülsheger提出的高壓脈沖電場強度與微生物存活率關(guān)系一級動力學(xué)方程為參考[32]，假設(shè)微生物存活率S與電場強度或脈沖占空比呈一級動力學(xué)關(guān)系，以lnS為縱坐標(biāo)，電場強度或脈沖占空比為橫坐標(biāo)進行作圖。結(jié)果如圖8所示，果膠桿菌對數(shù)減少值與電場強度和脈沖占空比的動力學(xué)方程分別為y=-0.1067x+0.1166和y=-0.0895x+0.3249，其相關(guān)系數(shù)則分別為0.9712和0.9445，表明不同電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌的致死作用符合一級動力學(xué)模型。

2.7.2 存活率與電場強度及脈沖占空比的擬合曲線以存活率S為縱軸，電場強度或脈沖占空比為橫軸，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)對果膠桿菌的存活曲線進行擬合，得到電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌致死作用的擬合曲線。結(jié)果如圖9所示：S電場強度=e-0.0923(x-0.444)、S脈沖占空比=e-0.0629(x-1.1276)。通過計算可知，殺滅果膠桿菌的臨界電場強度為1.04 kV/cm，臨界占空比為1.07%。對實際測量結(jié)果和擬合的預(yù)測值進行相關(guān)性分析和顯著性分析，得到相關(guān)系數(shù)分別為0.993和0.999，平均相對誤差率分別為19.00%和10.00%，說明了擬合曲線的準(zhǔn)確性較好。電場之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型

圖 8 不同電場強度（A）和脈沖占空比（B）下對果膠桿菌的致死動力學(xué)Fig.8 Lethal dynamics of Pectobacterium carotovorum under different electric field intensities (A) and pulse duty factors (B)

圖 9 不同電場強度（A）和脈沖占空比（B）對果膠桿菌致死作用的擬合曲線Fig.9 Model curve of inactivation effects of different electric field intensities (A) and pulse duty factors (B) on Pectobacterium carotovorum

數(shù)學(xué)模型是評價高壓脈沖電場殺菌效果的重要工具之一，對其實際應(yīng)用具有理論指導(dǎo)意義[33]。HüLSHEGER等[34]第一次提出建立微生物存活率對數(shù)與提出了微生物存活率和電場強度之間關(guān)系的Fermi方程通過大量研究數(shù)據(jù)積累，發(fā)現(xiàn)這些模型與實際數(shù)據(jù)之間有較好的擬合性，可以幫助食品從業(yè)者預(yù)測和控制食品的安全和貨架期[36]。本研究運用Hülsheger模型擬合不同電場強度和脈沖占空比處理后果膠桿菌的存活率，得到的電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌致死作用的擬合曲線方程分別為S電場強度=e-0.0923(x-0.444)、S脈沖占空比=e-0.0629(x-1.1276)，從該曲線可以看出，隨著電場強度和脈沖占空比的增大，果膠桿菌的存活率逐漸下降。但是在整個過程中，微生物存活率的下降速率是不同：在初始階段，果膠桿菌的存活率驟然下降，隨著電場強度和脈沖占空比的增加，該過程變得緩慢，出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象。擬合曲線是殺菌效果隨參數(shù)變化的直接體現(xiàn)，為選擇合適的處理參數(shù)提供了依據(jù)。另外，回歸系數(shù)可以反映微生物對該處理條件的敏感程度，回歸系數(shù)越大代表敏感程度越高。本研究中電場強度和脈沖占空比對果膠桿菌致死作用的擬合曲線回歸系數(shù)分別為0.0923和0.0629，說明電場強度對微生物影響更大。最后，決定系數(shù)代表了模型擬合度的優(yōu)劣。本研究中兩個動力學(xué)方程決定系數(shù)分別為0.9712和0.9445，說明該模型線性擬合較好，符合一級動力學(xué)模型。

3 結(jié)論

本文通過測定高壓脈沖電場不同處理條件下果膠桿菌的存活率，明確了電場強度和脈沖占空比為影響殺菌效果的主要因素，且當(dāng)電場強度為28 kV/cm，脈沖占空比為36.5%時，抑菌作用最強，果膠桿菌活菌對數(shù)減少值達1.60；同時發(fā)現(xiàn)在高壓脈沖電場作用下，果膠桿菌延滯期延長，生長受到抑制，同時細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量下降，結(jié)構(gòu)被破壞，滲透性增大，胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重泄漏。此外，不同生長期的果膠桿菌對高壓脈沖電場敏感度不同，其中對數(shù)生長期最為敏感。最后建立了高壓脈沖電場-果膠桿菌致死動力學(xué)模型，為實現(xiàn)高壓脈沖電場的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。此外，通過比較發(fā)現(xiàn)，本研究中高壓脈沖電場處理對果膠桿菌C-11的殺菌效果與其他部分研究結(jié)果相比存在一定差距，推測可能與微生物種類或機器本身相關(guān)，后續(xù)可通過優(yōu)化機器性能或者與其他殺菌方式協(xié)同處理提升殺菌效力。