高春燕，郭 琦，李媛麗，李 望，盧躍紅,

（1.北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川 750021；2.大理大學公共衛(wèi)生學院，云南大理 671000）

自由基是人體內(nèi)產(chǎn)生的正常代謝的中間產(chǎn)物[1]。外部因素，如環(huán)境污染物、壓力、農(nóng)藥、輻射、水源污染、各種醫(yī)療處理也會促進自由基的形成[2]。自由基具有高反應活性，可以與糖類、蛋白質、脂類、DNA等生物分子發(fā)生氧化反應，啟動自由基鏈式反應，破壞生物機體的結構，從而損害機體[3-5]。其中，自由基攻擊DNA，可引起細胞內(nèi)DNA的氫鏈斷裂、堿基降解和主鏈解旋，可造成細胞生物學活性改變，甚至導致基因突變、腫瘤與細胞死亡。此外，自由基被認為是引起衰老和各種慢性疾病，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、癌癥和糖尿病的重要因素[6-9]。多酚，廣泛存在于植物的花、莖、葉及果實中[10]。大量的研究表明，多酚是良好的抗氧化劑，具有顯著的自由基清除活性[11-14]。

蟲草參（Lycopus lucidusTurcz.），系唇形科地筍屬多年生草本植物的地下根莖[15]。在我國，主要分布在山東、四川、重慶、廣西等地區(qū)。其中，在云南主要分布在麗江、大理、昆明[16]。大理劍川沙溪鎮(zhèn)是云南省境內(nèi)野生蟲草參的原產(chǎn)地，現(xiàn)已建成大規(guī)模的人工引種栽培基地。蟲草參富含酚酸[17]、黃酮[18]、三萜類[19]、多糖等植物化學物[20-21]，具有抗氧化[22]、抗衰老[23]、降血糖[24]、降血脂[25-26]、增強免疫[27]、抗腫瘤等功能活性[28-29]。蟲草參作為云南高原特色食品資源[19]，在民間傳統(tǒng)中以炒制、燉煮、油炸和腌漬食用等為主。

自當年種植的11月份至次年的1月份，可陸續(xù)進行蟲草參的采挖。先前，郭琦等[30]已經(jīng)報道了四聯(lián)村三個采收期蟲草參對ROO·介導的DNA損傷的保護作用，但對·OH介導的DNA損傷的保護作用尚未見報道。為了進一步明確蟲草參對不同自由基介導的DNA損傷保護作用，本文以兩個采收地三個采收期的蟲草參為原料，采用分步提取法，提取了蟲草參中的游離酚和結合酚，測定了提取物的多酚含量，并采用HPLC法檢測了沒食子酸、綠原酸、咖啡酸和迷迭香酸在提取物中的含量。同時采用體外·OH介導的DNA氧化損傷體系，評價了蟲草參多酚提取物對DNA氧化損傷的保護作用，以期為蟲草參功能活性的開發(fā)提供理論依據(jù)，同時為DNA損傷的預防與治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟲草參 采自云南省劍川縣沙溪鎮(zhèn)江尾村（S1）和鰲鳳村（S2）三個采收期（T1：2016/11/28；T2：2016/12/27；T3：2017/01/27）的新鮮樣品，清洗，凍干，粉碎，過60目篩，-20 ℃冷藏備用；pBR322質粒DNA（0.5 μg/μL）、咖啡酸、綠原酸、迷迭香酸、沒食子酸、Folin-酚試劑、Trolox 標品純度≥99%，Sigma-Aldrich公司；色譜甲醇 美國Fisher公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

Scientz-18ND型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；V-T3可見分光光度計 屹譜儀器制造（上海）有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀和Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱 美國Agilent公司；DYY-6C型雙穩(wěn)定時電泳儀和WD-9413C型凝膠成像分析系統(tǒng) 北京六一科技生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚的提取 參考文獻[31]的方法進行游離酚和結合酚的提取。游離酚的提取步驟：5.0 g蟲草參粉，80%甲醇超聲波輔助（37 ℃、500 W）提取3次（10 min/次），合并濾液，旋蒸，剩余水相調pH至1～2，乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，旋蒸，剩余殘留物凍干，得游離酚提取物。

結合酚的提取步驟：提取完游離酚后所得蟲草參殘渣，NaOH（2 mol/L，含乙二胺四乙酸和維生素C），室溫避光震蕩水解4 h，調pH至1～2，抽濾，濾液乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，旋蒸，剩余殘留物凍干，得結合酚提取物。

1.2.2 多酚含量的測定 采用Folin-酚法測定[32]，分別吸取0.00、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mL 100 μg/mL沒食子酸標準溶液于10 mL具塞試管中，加入100 μL Folin-酚試劑，混勻，3 min后，加入2 mL 7.5%（w/v）Na2CO3，蒸餾水定容至5 mL刻度處，混勻，置暗室反應40 min。待反應結束后于760 nm處測定吸光值。以沒食子酸濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得沒食子酸標準曲線方程為y=0.0965x+0.0974（0～6.4 μg/mL），相關系數(shù)R2=0.9917。配制一定濃度的地參游離酚和結合酚提取物待測液，分別吸取0.1 mL，按上述步驟，測定其多酚含量。多酚含量測定結果以沒食子酸等量每毫克提取物干重表示（μg GAE/mg）。

1.2.3 HPLC分析條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：320 nm。流動相A：100%色譜甲醇；流動相B：色譜甲醇:冰乙酸:H2O，10:1:89。

蟲草參游離酚和結合酚梯度洗脫條件見表1。以峰面積（Y）為縱坐標，以濃度（C）為橫坐標，在游離酚洗脫條件下，沒食子酸、綠原酸、迷迭香酸和咖啡酸的回歸方程分別為Y=1.915C-2.19（R2=0.9929，10～50 μg/mL）、Y=31.786C-154.62（R2=0.9936，10～50 μg/mL）、Y=20.75C-335.16（R2=0.9985，40～200 μg/mL）和Y=65.704C-989.22（R2=0.9925，40～200 μg/mL）；在結合酚洗脫條件下，沒食子酸、綠原酸、迷迭香酸和咖啡酸的回歸方程分別為Y=1.975C+1.01（R2=0.9964，10～50 μg/mL）、Y=30.683C-136.23（R2=0.9982，10～50 μg/mL）、Y=14.186C-54.828（R2=0.9914，5～40 μg/mL）和 Y=53.679C-166.8（R2=0.9934，5～40 μg/mL）。樣品中含量的測定結果以微克每毫克提取物表示（μg/mg）。

表 1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of HPLC

1.2.4 多酚提取物DNA氧化損傷保護作用的測定參考Jeong等[33]的方法進行測定。具體操作流程為：1 μL質粒DNA、10 μL 10 mmol/L pH7.4 PBS、分別加入5 μL游離酚溶液（25、50、100、200、300 μg/mL）、結合酚溶液（3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL）（正常組和損傷組為5 μL PBS），充分混勻，加入2 μL 1 mmol/L FeSO4和2 μL 1 mmol/L H2O2（正常組為4 μL PBS），37 ℃水浴30 min，取出4 μL，加入2 μL loading buffer，混勻，吸取4 μL，加入1.0%的瓊脂糖凝膠Tris/Acetate/EDTA緩沖液中電泳50 min，凝膠成像系統(tǒng)測定灰度值。按下式計算雙螺旋百分比：雙螺旋百分比（%）=G1/（G1+G2+G3）×100。式中：G1、G2和G3分別為雙螺旋、開環(huán)和線性DNA的灰度值；以Trolox（25、50、100、200、300 μg/mL）作為陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 蟲草參多酚提取物的多酚含量

兩個采收地三個采收期的蟲草參多酚提取物的多酚含量見表2。蟲草參游離酚和結合酚提取物的多酚含量范圍分別為86.53～181.40和89.70～193.58 μg GAE/mg，且S2采收地的高于S1。不同采收地的蟲草參游離酚和結合酚在采收過程中多酚含量變化趨勢存在差異。就游離酚而言，S1采收地的蟲草參呈現(xiàn)T1＜T2＜T3的趨勢，而S2采收地的呈現(xiàn)T3＜T2＜T1的趨勢；就結合酚而言，S1采收地的蟲草參呈現(xiàn)T1＜T3＜T2的趨勢，而S2采收地的呈現(xiàn)T2＜T3＜T1的趨勢。采用析因分析檢驗了采收地和采收期對多酚提取物多酚含量的影響以及兩因素的交互作用，結果見表3和表4。就游離酚而言，其多酚含量不僅受到采收地和采收期的影響，同時還受到兩因素的共同交互作用；就結合酚而言，其多酚含量受到采收地的影響和兩因素的共同交互作用。與植物多酚的合成與代謝有關的酶有苯丙氨酸解氨酶（PAL）、酪氨酸氨基轉移酶（TAT）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、多酚氧化酶（PPO）等。不同采收地蟲草參在采收過程中酶的合成或者酶的活性發(fā)生的變化不同，從而影響了蟲草參中游離酚和結合酚的合成與代謝，致使其在不同采收期多酚含量存在差異[34]。

表 2 蟲草參多酚提取物的多酚含量（μg GAE/mg）Table 2 Polyphenolic content of extracts from Lycopus lucidus Turcz. (μg GAE/mg)

表 3 采收地和采收期對蟲草參游離酚提取物多酚含量的主體間效應檢驗Table 3 The test of between-subjects effects of collect sites and harvest times on the polyphenolic content of free phenolic extract from Lycopus lucidus Turcz.

表 4 采收地和采收期對蟲草參結合酚提取物多酚含量的主體間效應檢驗Table 4 The test of between-subjects effects of collect sites and harvest times on the phenolic content of bound phenolic extract from Lycopus lucidus Turcz.

2.2 蟲草參多酚提取物中多酚組成的HPLC分析結果

根據(jù)前期研究結果[17,30]，采用HPLC檢測了蟲草參多酚提取物中四種酚酸的含量，代表性的色譜圖見圖1?？梢钥闯?，結合酚中分離出的色譜峰多于游離酚，且沒食子酸和綠原酸在所有樣品中均未檢出?？Х人嵩谟坞x酚中含量較低甚至未檢出，在結合酚中的含量范圍為6.53～44.29 μg/mg，迷迭香酸在游離酚和結合酚中的含量范圍分別為40.43～77.64和1.93～5.32 μg/mg（表5），表明咖啡酸在結合酚中含量較高，而迷迭香酸在游離酚中含量較高。此外，不同采收地同一采收期游離酚和結合酚提取物中咖啡酸和迷迭香酸的含量水平不同，S2采收地蟲草參中的咖啡酸含量高于S1；而迷迭香酸在游離酚中，T1和T3采收期，S2采收地的高于S1，相反在T2采收期，S2采收地的低于S1，在結合酚中，三個采收期均為S2采收地的高于S1。這種含量的差異可歸因于采收地對咖啡酸和迷迭香酸在蟲草參生長過程中合成代謝的影響不同。

圖 1 代表性的 HPLC 色譜圖Fig.1 Representative HPLC chromatograms

表 5 蟲草參多酚提取物中迷迭香酸和咖啡酸的含量（μg/mg）Table 5 The content of rosmarinic acid and caffeic acid in phenolic extracts from Lycopus lucidus Turcz. (μg/mg)

2.3 蟲草參多酚提取物對DNA氧化損傷的保護作用

蟲草參游離酚和結合酚提取物對DNA氧化損傷的保護作用分別見圖2和圖3。正常的pBR322質粒DNA主要為雙螺旋結構（泳道1），被·OH氧化損傷的DNA，主要為開環(huán)和線性結構（泳道2）。與損傷的DNA相比，添加了蟲草參多酚提取物后，DNA雙鏈被損傷的程度明顯減弱（泳道3～7）。保護作用的定量分析結果以雙螺旋百分比（%）進行表征，值越大，表明保護效果越好。

在25～300 μg/mL濃度范圍內(nèi)，蟲草參游離酚提取物對DNA氧化損傷保護作用的雙螺旋百分比范圍為1.81%%～55.04%（圖2），且不同采收地保護作用不同。就S1而言，其雙螺旋百分比范圍為3.99%～49.15%，且不同采收期保護作用存在差異；T1采收期的雙螺旋百分比范圍為8.29%～49.15%，且呈現(xiàn)先升高后降低而后又上升的趨勢，當濃度從25 μg/mL提高至50 μg/mL時，保護作用也提高，當提高至100 μg/mL時反而又降低，進一步從100提高至300 μg/mL時，保護作用也逐漸提高；T2采收期的雙螺旋百分比在3.99%～32.33%范圍內(nèi)，且在50 μg/mL時，保護作用最強；T3采收期的雙螺旋百分比范圍為8.66%～44.78%，當 濃 度 從25 μg/mL提 高 至50 μg/mL時，保護作用逐漸減小，當濃度提高至100～200 μg/mL時，保護作用顯著增強，且達到最大，但當濃度進一步提高至300 μg/mL時，保護作用反而又減弱。就S2而言，其雙螺旋百分比范圍為1.81%～55.04%，且不同采收期保護作用同樣存在差異；T1采收期的雙螺旋百分比范圍為6.84%～50.19%，當濃度從25 μg/mL提高至50 μg/mL時，保護作用無顯著變化，當濃度提高至100 μg/mL時，保護作用顯著升高，而后隨著濃度的增加呈波浪性變化；T2采收期雙螺旋百分比范圍為30.14%～55.04%，保護作用隨著濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高，而后再降低的變化趨勢；T3采收期雙螺旋百分比范圍為1.81%～50.10%，保護作用隨著濃度的提高呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在50 μg/mL時，保護作用最強。

在3.125～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)，蟲草參結合酚提取物對DNA氧化損傷保護作用的雙螺旋百分比范圍為1.67%～70.83%（圖3），與游離酚相似，不同采收地保護作用不同。就S1而言，其雙螺旋百分比范圍為1.67%～45.36%，且不同采收期保護作用存在差異；T1采收期的雙螺旋百分比在4.68%～45.36%范圍內(nèi)，且隨著濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低而后又升高的趨勢，在6.25 μg/mL時，保護作用達到最大；T2采收期的雙螺旋百分比在1.67%～5.94%之間，幾乎無保護作用；T3采收期的雙螺旋百分比在2.56%～39.99%范圍內(nèi)，且呈現(xiàn)先降低后升高而后又降低的趨勢，在25 μg/mL時保護作用達到最大。就S2而言，其雙螺旋百分比范圍為3.03%～70.83%，且不同采收期保護作用同樣存在差異；T1采收期的雙螺旋百分比在3.03%～51.87%范圍內(nèi)，隨著濃度的提高保護作用呈現(xiàn)先降低后升高而后又降低的趨勢，在25 μg/mL時，保護作用最大；T2采收期的雙螺旋百分比在17.71%～55.94%范圍內(nèi)，當濃度由3.125 μg/mL提高至6.25 μg/mL時，保護作用顯著下降，繼續(xù)提高至25 μg/mL時，保護作用無顯著性差異，進一步增加至50 μg/mL時，保護作用顯著提高且達到最大；T3采收期的雙螺旋百分比在15.87%～70.83%范圍內(nèi)，當濃度從3.125 μg/mL提高至25 μg/mL時，保護作用逐漸增加，但當濃度繼續(xù)提高至50 μg/mL時，保護作用反而顯著下降。

圖 2 蟲草參游離酚對 DNA 氧化損傷的保護作用Fig.2 DNA oxidative damage protective effect of free phenolics from Lycopus lucidus Turcz.

圖 3 蟲草參結合酚對 DNA 氧化損傷的保護作用Fig.3 DNA oxidative damage protective effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.

具有清除·OH和螯合Fe2+能力的化合物，對·OH介導的DNA氧化損傷，都會顯示出一定的保護作用。通過浸提法獲得的多酚粗提物中通常含有色素、糖類、蛋白質、氨基酸等非多酚類成分，而這些物質同樣具有清除自由基和螯合Fe2+的能力[35-36]。此外，多酚提取物中的各成分之間對DNA損傷的保護作用可能存在拮抗或協(xié)同的關系。因此，蟲草參多酚提取物對DNA氧化損傷的保護作用未呈現(xiàn)出劑量依賴效應。

陽性對照Trolox對DNA氧化損傷的保護作用見圖4，在濃度25～300 μg/mL范圍內(nèi)，其雙螺旋百分比范圍為53.27%～77.28%，且濃度越大，保護效果越好。與Trolox相比，在25～300 μg/mL濃度范圍內(nèi)，S1和S2采收地的游離酚提取物對DNA氧化損傷保護作用的雙螺旋百分比最高分別為49.15%和55.04%，接近于25 μg/mL Trolox的保護作用；在3.125～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)，S1和S2采收地結合酚提取物雙螺旋百分比最高分別為46.36%和70.83%，分別與25 和100 μg/mL Trolox（圖4中3、5泳道）的保護作用接近。大體上講，相較于游離酚，結合酚對DNA氧化損傷表現(xiàn)出更好的保護作用，這不僅與兩種不同結合態(tài)多酚提取物多酚含量水平的不同有關，還與兩種多酚提取物中多酚類化合物單體的組成存在差異有關。

圖 4 Trolox 對 DNA 氧化損傷的保護作用Fig.4 DNA oxidative damage protective effects of Trolox

3 結論

蟲草參游離酚和結合酚提取物的多酚含量范圍分別為86.53～181.40 μg GAE/mg和89.70～193.58 μg GAE/mg，且S2采收地的高于S1。游離酚提取物的多酚含量不僅受到采收地和采收期的影響，同時還受到兩因素的共同交互作用；結合酚的多酚含量受到采收地的影響和兩因素的共同交互作用。兩個采收地三個采收期的蟲草參多酚提取物中均未檢出沒食子酸和綠原酸?？Х人嵩诮Y合酚中含量較高，而迷迭香酸在游離酚中含量較高，且不同采收地含量存在差異。蟲草參多酚對·OH介導的DNA氧化損傷具有一定的保護作用，相較于游離酚，結合酚表現(xiàn)出更好的保護效果。