曾 橋，唐文潔，溫謹(jǐn)瑞，孫 敏,3，邊文文，張亞鋒，谷文軍，呂生華 ，段 潔,

（1.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021；2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021；3.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西西安 710021；4.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048；5.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西西安 710054；6.陜西樸道茶業(yè)股份有限公司，陜西咸陽 713700）

杜仲為杜仲科杜仲屬植物，別名扯絲皮、思仲、絲棉皮、玉絲皮，是我國特有經(jīng)濟(jì)樹種，多分布在長江中游和南部各省[1-2]，近年來，隨著不斷的引種和馴化，分布范圍更加廣泛。傳統(tǒng)上杜仲主要以皮入藥，《中國藥典》記載其有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎等功效，用于治療肝腎不足，腰膝酸痛，筋骨無力，頭暈?zāi)垦＃焉锫┭?，胎?dòng)不安等[3]。研究表明，杜仲葉含有和杜仲皮類似的活性成分，包括多糖、黃酮、多酚、氨基酸、京尼平苷、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷等[4-9]，具有抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖、抑菌、抗疲勞、抗腫瘤等[8-11]多種保健功能。杜仲葉屬于可再生資源，分布廣泛，產(chǎn)量巨大，不僅有望在臨床上部分替代杜仲皮，還可廣泛應(yīng)用于功能食品的開發(fā)，具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

目前，杜仲葉食品的開發(fā)以杜仲葉茶為主，多以杜仲樹的嫩稍或葉為原料，采用傳統(tǒng)綠茶和紅茶工藝制作而成，產(chǎn)品普遍具有青草的澀味，口感較差，因而未得到市場的廣泛認(rèn)可。茯磚茶為黑茶類后發(fā)酵茶，常以黑毛茶為原料，經(jīng)原料篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發(fā)花干燥和陳化等一系列復(fù)雜工藝加工而成，發(fā)花是茯磚茶加工過程中最為關(guān)鍵的工序，其不僅賦予茯磚茶金花普茂的特征，還有效地改善了其風(fēng)味和口感，大大提升了產(chǎn)品的品質(zhì)[12]，而經(jīng)過陳化，茯磚茶茶湯香氣更加純正，口感愈發(fā)的醇和，因此，茯磚茶還有“越陳越香”的美譽(yù)[13]?；诖?，本研究前期以杜仲葉茶為原料，采用茯磚茶加工工藝制備杜仲葉茯磚茶，進(jìn)一步提升了杜仲葉茶的品質(zhì)。香氣是茶葉的重要品質(zhì)特征，原料和加工工藝是決定茶葉香氣特征的主要因素[14]，頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）具有簡單、快速、靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，其與氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spec trometry, GC-MS）聯(lián)用已被廣泛應(yīng)用于綠茶、紅茶、和黑茶等香氣成分的檢測，從而為茶葉的品質(zhì)化學(xué)研究提供依據(jù)[15]，但目前尚未見應(yīng)用該方法研究杜仲葉茯磚茶香氣成分的報(bào)道。因此，為識別杜仲葉茯磚茶香氣特征以及探究加工過程中香氣成分的變化規(guī)律，本研究應(yīng)用HS-SPMEGC-MS法對杜仲葉茯磚茶加工過程中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，并對杜仲葉茯磚茶不同加工階段樣本揮發(fā)性成分進(jìn)行對比分析，從而為杜仲葉茯磚茶加工過程中香氣成分的調(diào)控和品質(zhì)提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉茶 略陽縣嘉靈特種茶開發(fā)中心。

GCMS-TQ8050 NX三重四極桿型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本SHIMADZU公司；AOC-6000自動(dòng)進(jìn)樣器 日本SHIMADZU公司；ARR11-DVB/CWR120/20-P5萃取頭 瑞士CTC Analytics。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備和采集 以同一批次杜仲葉茶為原料在陜西樸道茶業(yè)股份有限公司經(jīng)篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發(fā)花干燥和陳化等工藝制成，其中，發(fā)花過程持續(xù)時(shí)間為25 d。分別于加工過程中的原料篩選，渥堆，氣蒸與壓制成型（即發(fā)花第0 d），發(fā)花第8、25 d及陳化1年等6個(gè)階段取樣，依次編號為S0，S1……S5，所有樣本取樣后立即破碎，混合均勻，冷凍干燥后儲(chǔ)存于-80 ℃下待進(jìn)行HS-SPME/GC-MS分析。

1.2.2 樣品處理 稱取適量樣品進(jìn)行液氮研磨，取磨碎均勻樣品2 g（精確至0.01 g），置于20 mL SPME萃取瓶中，用密封墊封口，隨后放入AOC-6000自動(dòng)進(jìn)樣器中，進(jìn)行自動(dòng)固相微萃取。

1.2.3 SPME條件 100 ℃恒溫爐先平衡20 min，使茶葉揮發(fā)性組分揮發(fā)，然后將固相微萃取針插入萃取瓶中，邊平衡邊萃取60 min，隨后將萃取頭插入到GC進(jìn)樣口，在250 ℃的條件下解吸2 min。為防止樣品間的污染，萃取頭于進(jìn)樣前在300 ℃老化5 min，萃取結(jié)束后在300 ℃老化20 min。

1.2.4 GC-MS/MS條件 色譜柱為Inter Cap Wax石英毛細(xì)管柱（30 cm×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為He （99.999%），流速1 mL/min；進(jìn)樣模式：不分流；不分流進(jìn)樣時(shí)間：1 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫條件：50 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min，以8 ℃/min升至220 ℃保持5 min，以8 ℃/min升至240 ℃保持5 min；電子轟擊離子源（EI），溫度為230 ℃，接口溫度：250 ℃；電子能量70 eV，采集模式：Q3 Scan；質(zhì)量掃描范圍35～500 m/z[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)所獲取的總離子流色譜圖質(zhì)譜信息，經(jīng)NIST2017標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索定性鑒定出成分，取SI（Similar Index）＞85為有效數(shù)據(jù)。依據(jù)峰面積歸一化法得到各成分在杜仲葉茯磚茶揮發(fā)性組分中的相對含量[17-18]，結(jié)果為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，數(shù)據(jù)用±s表示，利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行主成分分析（principle component analysis，PCA）和聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA），進(jìn)一步應(yīng)用SIMCA 14.1進(jìn)行偏最小二乘法分析（PLS-DA）和變量重要性（variable importance on projection scores，VIP＞1.0）分析，對篩選出的VIP＞1.0的標(biāo)志差異性香氣成分利用MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME-GC-MS檢測結(jié)果及揮發(fā)性成分分析

由表1可以看出，通過HS-SPME-GC-MS在杜仲葉茯磚茶各不同階段樣本中共篩選鑒定出152種揮發(fā)性成分，包括13種酸類，20種酯類，18種酮類，22種醇類，17種醛類，24種烷類，15種芳香族類，7種呋喃類，10種烯烴類和6種其他類，其中相對含量較高的為棕櫚酸、月桂酸、丙三醇、3-呋喃甲醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、棕櫚酸甲酯、3-呋喃甲基乙酸酯、亞麻酸甲酯、β-紫羅蘭酮和2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、植酮等。在原料，渥堆，發(fā)花第0 d，發(fā)花第8、25 d及陳化1年等6個(gè)不同階段樣本中分別檢測出84、84、83、70、79和88種揮發(fā)性成分，上述各不同階段樣本共有的揮發(fā)性成分為37種，占所有鑒定出揮發(fā)性成分的24.34%，說明不同階段樣本揮發(fā)性成分差異較大，各不同加工階段樣本揮發(fā)性成分種類數(shù)和含量見圖1。與李俊杰等[19]以傳統(tǒng)黑毛茶為原料加工的茯磚茶相比，杜仲葉茯磚茶中大多數(shù)揮發(fā)性成分種類不同，說明杜仲葉茯磚茶有其獨(dú)特的香氣特征。

表 1 揮發(fā)性成分定性及相對含量分析Table 1 Qualitative analysis and relative content of volatile components

由圖1a可以看出，在原料、渥堆、氣蒸過程中揮發(fā)性成分種數(shù)變化不大，而發(fā)花過程中揮發(fā)性成分種數(shù)減少較為明顯，其中發(fā)花8 d較發(fā)花0 d揮發(fā)性成分種數(shù)減少15.66%，隨著發(fā)花時(shí)間的延長，杜仲葉茯磚茶中揮發(fā)性成分種數(shù)逐步增加，尤其經(jīng)過1年的陳化，茶樣中揮發(fā)性成分的數(shù)量明顯回升，且在所有樣本中達(dá)到最高。由圖1b可以發(fā)現(xiàn)，酸類（19.06%～30.59%）、酯類（15.58%～21.87%）、酮類（11.84%～14.30%）和醇類（10.52%～20.07%）為各樣本中總體含量較高的揮發(fā)性成分，醛類（4.02%～6.28%）、烷類（5.17%～6.34%）、芳香族類（0.93%～5.76%）和呋喃類（2.85%～5.65%）含量次之，烯烴類（1.51%～2.89%）和其他類（1.65%～3.04%）含量最低。

圖 1 不同加工階段樣本揮發(fā)性成分種類數(shù)（a）及其含量（b）Fig.1 The types (a) and content (b) of volatile components in different stages

酸類化合物是各樣本中相對含量最高的揮發(fā)性成分，在鑒定出的13種酸類化合物中，所有樣本共有的酸類化合物有6種，分別為棕櫚酸、十五烷酸、月桂酸、肉豆蔻酸、乙酸和18-壬酸。棕櫚酸在各茶樣中的相對含量介于9.86%～17.79%，是主要的揮發(fā)性酸，雖然在發(fā)花后期略有下降，但在陳化過程中明顯回升。棕櫚酸本身不具有任何的香氣，但能降解生成壬醛、庚醛等香氣物質(zhì)，對香氣的影響不容忽視[20]。其次含量較高的為具有酸澀味的乙酸[21]（0.98%～7.93%），微有月桂油香味的月桂酸[22]（1.28%～2.77%）和具有微弱的蠟香和奶香味的肉豆蔻酸[22]（1.04%～1.74%），其余成分在所有樣本中含量均較低。和S0相比，肉豆蔻酸、棕櫚酸和月桂酸在S5中相對含量分別增加了67.31%、75.96%和63.91%。同時(shí)，通過1年的陳化，新產(chǎn)生了具有類似蜂蜜甜香的苯乙酸[23]，而乙酸以及略帶辛辣的刺激油味的丙酸[24]在加工過程中含量下降明顯。上述揮發(fā)性成分相對含量的變化對于提升杜仲葉茯磚茶蠟香、乳香和甜香等有益，同時(shí)有助于減弱茶湯的刺激性，從而改善杜仲葉茯磚茶的風(fēng)味。在發(fā)花階段，呈淡脂肪和椰子香氣的壬酸[25]，具有蠟、奶酪、脂肪香的辛酸[22]和十一酸相對含量下降幅度均較大，但壬酸和辛酸在陳化階段上升明顯。此外，在陳化階段，棕櫚酸、苯乙酸、肉豆蔻酸和無或微有似安息香或苯甲醛氣味的苯甲酸[26]相對含量上升幅度均較大，說明陳化對于調(diào)整酸類化合物的含量和組成，進(jìn)而促進(jìn)杜仲葉茯磚茶良好的風(fēng)味的形成具有較為重要的作用。

續(xù)表 1

續(xù)表 1

酯類揮發(fā)性成分主要具有花果香、木香、蠟香和乳香等風(fēng)味[20]，對杜仲葉茯磚茶香氣有著較為重要的貢獻(xiàn)。杜仲葉茯磚茶加工過程中鑒定出的酯類化合物共有20種，各不同階段樣本共有的揮發(fā)性成分包括具有脂肪、蠟質(zhì)氣味的棕櫚酸甲酯[25]、呈香豆素及麝香樣氣息二氫獼猴桃內(nèi)酯[25]、無氣味的亞麻酸甲酯[17]、反式-9-十八碳烯酸甲酯、3-呋喃甲基乙酸酯、（Z）-18-十八碳-烯內(nèi)酯等6種，占總數(shù)的30.00%，說明各不同階段樣本酯類化合物差異較為明顯。酯類揮發(fā)性成分相對含量在S0～S4階段呈下降趨勢，進(jìn)入陳化階段則明顯上升，而傳統(tǒng)以黑毛茶為原料加工茯磚茶過程中，酯類揮發(fā)性成分含量呈上升趨勢[19]，說明酯類代謝變化規(guī)律與原料有較大關(guān)系。二氫獼猴桃內(nèi)酯（3.54%～8.82%）為杜仲葉茯磚茶中含量最高的酯類揮發(fā)性成分，有研究表明，二氫獼猴桃內(nèi)酯是普洱茶木香的主要成分[27]，其次為3-呋喃甲基乙酸酯（2.14%～5.62%）、棕櫚酸甲酯（1.80%～4.19%）、亞麻酸甲酯（1.39%～2.61%）和（Z）-18-十八碳-烯內(nèi)酯（0.76%～1.30%）。此外，具有果香和奶油香氣的棕櫚酸乙酯[28]的相對含量雖然在S0～S4各階段樣本中含量較低，但經(jīng)過長期陳化后，其在陳化樣本S5中的含量較原料S0增加1300%，上述揮發(fā)性成分對于賦予茶葉木香、花果香和乳香有重要貢獻(xiàn)。S5樣本中酯類的豐富度均較其他階段樣本高，其中包含的相對含量較高的成分為棕櫚酸甲酯（4.19%）、二氫獼猴桃內(nèi)酯（3.54%）、亞麻酸甲酯（2.61%）、3-呋喃甲基乙酸酯（2.14%）、反式-9-十八碳烯酸甲酯（1.29%）、（Z）-18-十八烷烯內(nèi)酯（1.07%）、棕櫚酸乙酯（0.98%）以及呈蠟香和甜香的亞麻酸乙酯[29]（0.84%）等?？傮w來看，酯類化合物種類在S0～S4階段變化不大，但是在陳化階段上升明顯，和S0相比，S5中酯類化合物種數(shù)較原料增加了45.45%。此外，陳化新產(chǎn)生了乙酸異丙烯酯、γ-戊內(nèi)酯、亞麻酸乙酯、亞油酸乙酯等多種揮發(fā)性成分，不僅大幅增加了茶樣中酯類化合物的豐富度，而且提高了酯類化合物總相對含量，對于杜仲葉茯磚茶特有花果香和乳香的形成具有重要作用。

酮類化合物主要賦予杜仲葉茯磚茶木香、花香、烤香和果香等，由于具有較低的閾值[30]，因此對杜仲葉茯磚茶風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。由表1可以看出，整個(gè)加工過程中共鑒定出酮類化合物18種，各不同階段茶樣中共有的酮類化合物為3種，分別為具有紫羅蘭香、水果香和木香的β-紫羅蘭酮[19]，呈草藥味和木質(zhì)香氣的植酮[25]和2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮，僅占酮類化合物總數(shù)量的16.67 %，說明加工過程中各不同階段樣本酮類化合物種類差異較為明顯。由圖1b可以看出，酮類揮發(fā)性成分總相對含量在整個(gè)加工過程中變化不大，其在發(fā)花25 d（S4）樣本中總的相對含量最高，陳化（S5）樣本中含量最低，二者相差2.46%。S5樣本中主要的酮類揮發(fā)性成分為β-紫羅蘭酮（2.02%）、呈濃郁的焦糖香氣，同時(shí)具有烤面包、焦糖麥芽香味的菊苣酮[31]（1.62%）、植酮（2.23%）以及2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮（3.22%）等，其余酮類化合物成分相對含量均低于0.94%。在傳統(tǒng)茯磚茶發(fā)花過程中，β-紫羅蘭酮僅在發(fā)花后期被檢測到，因而部分學(xué)者推測其為“菌花香”的關(guān)鍵組分[19]，而β-紫羅蘭酮在杜仲葉茯磚茶原料中就具有較高的含量，且在加工過程中呈逐步下降趨勢，至陳化階段基本保持穩(wěn)定，說明原料不同，“菌花香”物質(zhì)的代謝規(guī)律和組成可能有一定的差異。

醇類化合物具有特殊的花香、果香和木香[20]，在鑒定出的22種醇類化合物中，共有的香氣成分有4種，其中以3-呋喃甲醇和具有愉悅的果香、花香、脂香、芳香的植物醇[25]含量較高，3-呋喃甲醇在加工過程中呈逐步下降趨勢，而植物醇先上升后下降。研究表明，傳統(tǒng)以黑毛茶加工茯磚茶的過程中，醇類物質(zhì)呈下降趨勢[25]，而在杜仲葉茯磚茶加工過程中，其種數(shù)和相對含量總體上均呈先下降后上升的趨勢，且在發(fā)花后期和陳化階段相對含量明顯高于其他階段樣本，分別達(dá)20.07%和17.15%，這主要是由于在發(fā)花中、后期及陳化階段，新產(chǎn)生了相對含量較高（4.76%～11.50%）的丙三醇。雖然丙三醇為杜仲葉茯磚茶發(fā)花和陳化階段相對含量最高的醇類化合物，但由于其無氣味，因而對杜仲葉茯磚茶香氣無貢獻(xiàn)。芳樟醇在原料、渥堆和氣蒸樣本中均未檢測到，但在發(fā)花中、后期及陳化階段相對含量較高，這與傳統(tǒng)以黑毛茶為原料加工的茯磚茶的結(jié)果類似，其在加工過程中的含量變化與冠突散囊菌有密切關(guān)系。有研究表明，芳樟醇為普洱茶及六堡茶中醇類物質(zhì)的主體[32]，同時(shí)，芳樟醇及其氧化物還被認(rèn)為是茯磚茶“菌花香”的關(guān)鍵組分，是茶葉中主要的賦香成分，由于其具有較好的柑橘、鈴蘭香、花香、青香及木香[25]，因而在發(fā)花后期以及陳化階段含量的上升有助于提高杜仲葉茯磚茶的品質(zhì)。此外，雪松醇是普洱茶或陳茶中木香和陳香的主要成分[33]，其在杜仲葉茯磚茶加工過程中呈下降趨勢，尤其在陳化階段下降明顯，最終在S5樣本中未被檢測到，其相對含量的下降對茶葉風(fēng)味的影響還有待于進(jìn)一步研究。異植物醇為原料經(jīng)渥堆后新產(chǎn)生的揮發(fā)性成分，呈細(xì)膩的干葉、茶香樣氣息，并略帶焦糖的甜氣[17]，在后續(xù)加工過程中較為穩(wěn)定。苯甲醇有令人愉快的水果香氣和強(qiáng)烈的熏烤味[25]，其在S0～S4階段呈下降趨勢，然而經(jīng)過1年的陳化，其相對含量明顯上升，最終在S5中的含量為0.91%，它與芳樟醇、植物醇、異植物醇等為構(gòu)成杜仲葉茯磚茶菌香、花香、果香和木香的主要來源之一。

醛類物質(zhì)多呈果香、花香、橘香、清香和草藥香等[25]，香氣特征良好。由圖1b可以看出，醛類物質(zhì)在杜仲葉茯磚茶中相對含量不高，但由于其閾值較低[30]，因而對茶葉的風(fēng)味有較為重要的影響。在S0～S5樣本中共鑒定出17種醛類物質(zhì)，丙醛、3-糠醛、5-羥甲基糠醛和乙醛為所有樣本中共有的揮發(fā)性醛類。3-糠醛為相對含量最高的醛類物質(zhì)，且隨著加工過程的進(jìn)行，其相對含量呈逐步上升趨勢，具有咖啡香、烤甜香的5-羥甲基糠醛[34]含量僅次于3-糠醛，隨著加工過程的進(jìn)行逐漸降低，但其在S5樣本中含量仍較高，達(dá)0.77%，較低濃度具有令人愉快的水果香味的乙醛[35]相對含量在加工過程中先下降，發(fā)花過程中逐漸上升，后在陳化階段略有下降，上述三種成分合計(jì)占S5樣本中總?cè)┖康?3.40%，為影響杜仲葉茯磚茶產(chǎn)品香氣的重要醛類物質(zhì)。此外，S5樣本中還包含有橙子及玫瑰香氣的壬醛[25]以及具有紫羅蘭和黃瓜香等清香味的反-2-順-6-壬二烯醛[36]，這些香氣成分和其他成分有助于賦予陳化后的杜仲葉茯磚茶特有的果香、花香和甜香等。2-己烯醛和青葉醛呈青草味[25,37]，其中2-己烯醛在加工過程中下降較為明顯，青葉醛主要在發(fā)花階段產(chǎn)生，但經(jīng)陳化處理后在S5樣本中未被檢測到，上述揮發(fā)性成分的下降對于改善杜仲葉茯磚茶的青辛味，促進(jìn)純正香氣的形成有一定作用。

烷類閾值較高，幾乎不呈現(xiàn)香氣，但卻對茶的香氣構(gòu)造起著間接的重要作用[20]。S0～S5樣本中共鑒定出24種烷類揮發(fā)性成分，其中各茶樣中共有的烷類化合物僅4種，包括正二十烷、3-甲基-5-丙基壬烷、六甲基環(huán)三硅氧烷和十八甲基環(huán)九硅氧烷。S4樣本中烷類化合物種類最少，同時(shí)各不同階段茶樣中烷類揮發(fā)性成分總的相對含量隨著加工過程的進(jìn)行總體呈逐步下降趨勢，發(fā)花中后期和陳化階段較為穩(wěn)定。S0～S5樣本中共鑒定出15種芳香族類揮發(fā)性成分，總相對含量在加工過程中呈先下降，發(fā)花后期上升，陳化過程中又明顯下降的趨勢，9-亞甲基-9H-芴和（Z）-正丁烯基苯酞為所有茶樣中共有的芳香族類化合物。部分成分在加工前期和中期含量較高，而在發(fā)花后期和陳化階段未檢測到，包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，以及具有焦糖香味、蜜餞的水果香氣，其稀溶液具有輕微的草莓芬芳的甲基麥芽酚[38]以及2,4-二叔丁基苯酚等。檢測到的部分呋喃類化合物如具有堅(jiān)果和肉香型香料味的2-乙酰基呋喃[39]等具有較好的香氣特征，但除2,3-二氫苯并呋喃相對含量較高外，其他均較低，對茶葉品質(zhì)影響較小。杜仲葉茯磚茶加工過程中鑒定出的烯烴類化合物共有10種，其中各不同階段茶樣中共有僅2種，分別為苊烯和呈清香且具有刺激性氣味的新植二烯[40]，二者在杜仲葉茯磚茶加工過程中的相對含量均呈下降趨勢?？傮w來看，烯烴類化合物在杜仲葉茯磚茶樣本中相對含量較低，在S5樣本中，烯烴類化合物總的相對含量為2.52%，其中含量較高的為3,4,4-三甲基-2-己烯（1.05%）、新植二烯（0.70%）等。除前述各類揮發(fā)性成分外，杜仲葉茯磚茶各樣本中還鑒定到吡咯、吡啶和胺等化合物，除2-乙?；量┖枯^高外，其他成分在S5中的相對含量均較低，對杜仲葉茯磚茶香氣的貢獻(xiàn)較小。

總體來看，杜仲葉茯磚茶揮發(fā)性成分在加工過程中的組成和含量發(fā)生了明顯的變化，從相對含量來看，酸類、酯類、酮類和醇類為主要的揮發(fā)性成分，可能是杜仲葉茯磚茶特有香味物質(zhì)的主要來源，這與傳統(tǒng)以黑毛茶為原料加工的茯磚茶以醇類、酯類、醛類物質(zhì)為主要香味物質(zhì)來源有一定的不同[19]。此外，醛類化合物雖然相對含量較低，但由于氣味閾值普遍較低，因而對杜仲葉茯磚茶總體香氣有較為重要的潛在作用。原料、渥堆、氣蒸三個(gè)階段的樣本差異相對較小，在鑒定出的152種揮發(fā)性成分中，有45種在S0、S1和S2中均未檢測到，三個(gè)階段共有的有65種，占總數(shù)的72.37%，說明在S0～S2階段，揮發(fā)性成分結(jié)構(gòu)組成變化相對較小。而發(fā)花是杜仲葉茯磚茶加工過程中揮發(fā)性成分種類數(shù)和相對含量變化最大的階段，這可能是由于發(fā)花過程中劇烈的微生物活動(dòng)造成的。由于在發(fā)花階段以冠突散囊菌為主的曲霉屬為絕對優(yōu)勢菌群，微生物多樣性較低[41-42]，這可能是導(dǎo)致此階段樣本中揮發(fā)性成分種類最少的重要原因，但尚需進(jìn)一步證實(shí)。通過發(fā)花降低了乙酸、丙酸、異丁醛、苯酚等具有不良?xì)馕稉]發(fā)性成分的含量，新產(chǎn)生了芳樟醇等具有“菌花香”的成分，從而有助于提升茶葉香氣品質(zhì)。陳化有助于茯磚茶內(nèi)部化學(xué)成分的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，從而使得茶湯香氣更加宜人[43]，經(jīng)過1年陳化處理，杜仲葉茯磚茶揮發(fā)性成分種類較發(fā)花結(jié)束增加11.39%，大大提高了揮發(fā)性成分的豐富度。其中，與發(fā)花結(jié)束相比，酯類成分增加最為明顯，其種類數(shù)和相對含量分別增加77.78%和31.51%，這可能是賦予杜仲葉茯磚茶良好的花果香、木香、蠟香和乳香等風(fēng)味的關(guān)鍵。

2.2 主成分分析

對杜仲葉茯磚茶各不同階段樣本揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析，可直觀地反映各樣本揮發(fā)性成分的差異。從圖2a可以看出，杜仲葉茯磚茶不同加工階段揮發(fā)性成分PCA圖中PC1為72.05%，PC2為16.43%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.48%，表明PC1、PC2的總貢獻(xiàn)率包含了杜仲葉茯磚茶樣本的大部分信息，較好的反映了不同茶樣之間揮發(fā)性成分差異的影響因素。S1和S2樣本在PCA圖中呈現(xiàn)一定的分離狀態(tài)，說明氣蒸過程中的高溫對杜仲葉茯磚茶中的揮發(fā)性成分有較大影響，但二者間的距離較其他樣本近，說明渥堆和氣蒸壓制成型樣本之間差異性相對其他樣本較小，二者與S0樣本間距離較大，則說明渥堆對杜仲葉茯磚茶揮發(fā)性成分變化影響較大。此外，發(fā)花和陳化階段各樣本在PCA圖上和其他樣本呈現(xiàn)明顯的分離，說明茶樣揮發(fā)性成分在此過程中發(fā)生了很大的變化，風(fēng)味物質(zhì)能夠得到良好的分離，進(jìn)而說明發(fā)花和陳化是改善杜仲葉茯磚茶香氣的主要過程，這與傳統(tǒng)以黑毛茶為原料加工茯磚茶的結(jié)論類似[12]。在PCA分析基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行HCA分析，結(jié)果如圖2b，其中S1和S2聚到第Ⅰ類群，S0聚到第Ⅱ類群，S3聚到第Ⅲ類群，S4和S5聚到第Ⅳ類群，說明在該工藝下杜仲葉茯磚茶不同階段樣本的香氣特征差別較大，這與PCA分析結(jié)果一致。

圖 2 不同加工階段杜仲葉茯磚茶揮發(fā)性成分主成分分析（a）和聚類分析（b）Fig.2 Principal component analysis (a) and cluster analysis (b) of volatile components from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fuzhuan tea

2.3 差異代謝物篩選分析

基于不同加工階段杜仲葉茯磚茶揮發(fā)性成分的相對含量建立的PLS-DA模型如圖3所示，可以看出，該模型將不同茶樣進(jìn)行了有效分離，其擬合參數(shù)為R2X=0.942，R2Y=0.995，Q2=0.986，說明該模型具有較強(qiáng)的累積解釋度和預(yù)測能力，且穩(wěn)定性良好，可用于不同加工階段杜仲葉茯磚茶樣的判別分析。

PLS-DA變量重要性因子（VIP）能夠量化各個(gè)變量對分類的貢獻(xiàn)度，從而篩選出重要的特征物質(zhì)，一般認(rèn)為VIP＞1表示該變量具有重要作用，且VIP值越大，說明該變量在不同加工階段杜仲葉茯磚茶樣本間的差異越顯著[44]。由圖4可以看出，VIP值大于1的揮發(fā)性成分共有64種，涵蓋了酮類、醇類、酯類、醛類、烷類等，包括5-乙基香茅烯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、1-己烯-3-醇、苯甲酸、十四烷、順-3,4-二甲基-2-戊烯、3,5-二羥基-2-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、3-氨基苯酚、5-羥基-3-甲基-1-茚酮、2-烯丙基呋喃、α-法呢烯、反式-3-己烯-1-醇、2-甲基二十六（碳）烷、2-吡咯甲醛、環(huán)十五內(nèi)酯等，而在VIP值大于1的揮發(fā)性成分中相對含量較高的為月桂酸、18-壬酸、植酮、植物醇、（Z）-18-十八烷烯內(nèi)酯、鄰苯二甲酸二丁酯、法尼基丙酮、2-烯丙基呋喃等，上述64種VIP大于1.0的標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分可作為區(qū)分不同加工階段杜仲葉茯磚茶的標(biāo)志物。

為直觀展示64個(gè)標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分在不同加工階段杜仲葉茯磚茶樣本間的分布情況，進(jìn)一步對其進(jìn)行聚類熱圖（HCA）分析，如圖5所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，陳化1年后的杜仲葉茯磚茶樣本S5中特有的標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分較少，而S0和S4最多。其中，3,7,11,15-四甲基-2-十六烯、乙醇、5-甲基吲哚、正三十二烷、1-二十三（碳）烯、（E,E）-2,4-己二烯醛、對甲苯異氰酸酯、2-辛基-1-癸醇、2-十一烯醛、鄰苯二甲酸二甲酯和十二醇等標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分在S0中的含量最高。其中，3,7,11,15-四甲基-2-十六烯僅在S0和S5中被檢測出，且二者差異極顯著（P＜0.01），5-甲基吲哚僅在S0和S4中被檢測出，且二者差異極顯著（P＜0.01），其余成分除乙醇外，均僅在S0中被檢測出，上述成分可以作為區(qū)分原料與其他階段樣本的候選標(biāo)記物進(jìn)行深入研究。3-氨基苯酚、3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮、順-3,4-二甲基-2-戊烯、環(huán)十五內(nèi)酯、5-羥基-3-甲基-1-茚酮等標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分僅在S1中被檢測到，可以作為區(qū)分渥堆過程與其他加工階段的候選標(biāo)記物。渥堆是茯磚茶加工中較為重要的環(huán)節(jié)，通過渥堆調(diào)節(jié)茶葉水分，為冠突散囊菌的萌發(fā)提供適宜條件，同時(shí)，在渥堆過程中還發(fā)生了一系列生理生化反應(yīng)，從而促進(jìn)茶葉品質(zhì)的提升[45]，因此，進(jìn)一步探討3-氨基苯酚等揮發(fā)性成分與渥堆過程中杜仲葉茶品質(zhì)的內(nèi)在關(guān)系，為精準(zhǔn)調(diào)控渥堆工藝有一定的現(xiàn)實(shí)意義。苯甲酸、5-乙基香茅烯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、1-己烯-3-醇等標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分在S2中含量最高，苯甲酸僅在S2和S5中被檢測出，且二者差異顯著（P＜0.05），其余成分僅在S2中被檢測到，可以作為區(qū)分氣蒸與其他加工階段的候選標(biāo)記物。植酮、2-吡咯甲醛和2-羥基環(huán)十五酮等標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分在S3中含量最高，其中，除植酮在所有樣本中均被檢測到，其余成分僅在S3中被檢測到。發(fā)花是形成茯磚茶金花普茂以及獨(dú)特菌香風(fēng)味和醇和口感的關(guān)鍵步驟[25]，而S3是在杜仲葉茯磚茶金花大量產(chǎn)生的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)所取樣本，因此，對發(fā)花過程中植酮、2-吡咯甲醛和2-羥基環(huán)十五酮的含量與冠突散囊菌數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性研究，有助于對發(fā)花質(zhì)量進(jìn)行判斷分析。7,11-二甲基-3-亞甲基1,6,10-十二碳三烯、2-（十四氧基）乙醇、4-羥基-5-甲基-3-丙基-2-己酮、羥基丙酮、5,6-環(huán)氧-3-羥基-β-紫羅蘭酮、丁位己內(nèi)酯、乙琥胺、對丙基茴香醚、β-石竹烯、苯酞、4,4-二甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、甲基環(huán)戊烷等僅在S4中被檢測出，因此，上述成分可以作為表征發(fā)花結(jié)束的候選標(biāo)記物進(jìn)行進(jìn)一步研究。尤其，5,6-環(huán)氧-3-羥基-β-紫羅蘭酮、乙琥胺、對丙基茴香醚相對含量均在0.9%以上，作為表征發(fā)花結(jié)束的候選標(biāo)記物具有更高的可靠性。

圖 3 不同加工階段杜仲葉茯磚茶揮發(fā)性成分PLS-DA分析得分圖Fig.3 Score plot of PLS-DA based on volatile components from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fuzhuan tea

圖 4 不同加工階段杜仲葉茯磚茶揮發(fā)性成分的VIP值圖Fig.4 VIP plot of volatile components from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fuzhuan tea

3 結(jié)論

茯磚茶是我國獨(dú)有且真正意義上有微生物參與的后發(fā)酵茶，由于其特殊的加工工藝，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性化合物的組分和種類發(fā)生了深刻的變化，從而可在一定程度上提升杜仲葉茶的香氣品質(zhì)。本文應(yīng)用 HSSPME-GC-MS技術(shù)對杜仲葉茯磚茶加工過程中揮發(fā)性成分進(jìn)行測定，共篩選鑒定出152種揮發(fā)性化合物，包括酸類、酯類、酮類、醇類、醛類、烷類、烯烴類、芳香族類、呋喃類和其他，其中，酸類、酯類、酮類和醇類為相對含量較高的揮發(fā)性成分，可能是杜仲葉茯磚茶特有香氣物質(zhì)的主要來源。杜仲葉茯磚茶各不同加工階段樣本在PCA圖上呈明顯分離狀態(tài)，說明加工過程中揮發(fā)性成分發(fā)生了較大的變化。經(jīng)過渥堆、氣蒸、發(fā)花和陳化處理，酸類、醇類、酮類和酯類等揮發(fā)性成分組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，丙酸、乙酸、2-己烯醛等部分具有刺激性、青辛氣不良?xì)馕稉]發(fā)性成分的含量下降明顯，而芳樟醇、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸乙酯、菊苣酮、乙醛等部分具有菌花香、木香、花果香、乳香等的揮發(fā)性成分新產(chǎn)生或相對含量上升。在最終產(chǎn)品S5茶樣中，棕櫚酸甲酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯、月桂酸、植酮、β-紫羅蘭酮等為相對含量較高的呈香揮發(fā)性成分，可能為構(gòu)成杜仲葉茯磚茶風(fēng)味特征的主體物質(zhì)?；赩IP值篩選出64種標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分，部分成分在特定的加工階段的相對含量與其他階段存在明顯差異，可以作為區(qū)分杜仲葉茯磚茶不同加工階段的候選標(biāo)記物，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步對此進(jìn)行深入研究，這為杜仲葉茯磚茶香氣特征的形成、識別和加工過程中香氣成分的調(diào)控提供了依據(jù)和參考。

圖 5 不同加工階段杜仲葉茯磚茶差異揮發(fā)性成分聚類熱圖Fig.5 Cluster heat map of difference volatile components from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fuzhuan tea