王海瑾， 曾慶飛， 韋興迪， 王佳楚函， 韋 鑫， 陳 超*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所， 貴州 貴陽 550006)

自20世紀(jì)中葉以來，隨著世界工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展、重金屬礦產(chǎn)資源和化石燃料的大規(guī)模開發(fā)、化肥與農(nóng)藥的持續(xù)使用，大量的重金屬化合物進(jìn)入農(nóng)用土壤。進(jìn)入土壤的重金屬難以被土壤微生物降解，致使土壤重金屬污染具有隱蔽性、長(zhǎng)期性、累積性以及不可逆轉(zhuǎn)等特點(diǎn)，自然凈化過程十分緩慢，土壤重金屬污染已經(jīng)變成了一個(gè)普遍而持久的環(huán)境問題[1]。重金屬污染土壤的修復(fù)方法包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)三類技術(shù)，實(shí)踐證明，其中的生物修復(fù)是行之有效的綠色而經(jīng)濟(jì)的修復(fù)方法[2]。生物修復(fù)主要分為植物修復(fù)、微生物修復(fù)、“植物-微生物”聯(lián)合修復(fù)三種類型，其中植物-微生物聯(lián)合修復(fù)能夠彌補(bǔ)單純植物修復(fù)與微生物修復(fù)的不足，能夠顯著提高生物修復(fù)重金屬的能力，已成為土壤重金屬污染生物修復(fù)研究的熱點(diǎn)之一[3]。

豆科植物與根瘤菌形成的共生固氮系統(tǒng)也屬于植物與微生物之間的特定聯(lián)合體系。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，具有固氮能力的部分根瘤菌同時(shí)也具有重金屬的吸附固定與轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，尤其當(dāng)根瘤菌與豆科植物形成共生根瘤后，所建立的“豆科植物-根瘤菌”共生系統(tǒng)對(duì)重金屬污染環(huán)境的修復(fù)效果更為顯著，被認(rèn)為是比傳統(tǒng)的“植物-植物”根際促生菌(PGPR)聯(lián)合修復(fù)系統(tǒng)更具潛力的共生修復(fù)體系[4]，早在1983年，Rothen在研究洗礦地帶土壤中Cd，Pb，Zn對(duì)豆科植物根瘤菌固氮能力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，白三葉(Trifoliumrepens)根瘤菌的固氮能力幾乎不受重金屬的影響，即使在Cd濃度為216 mg·kg-1、Zn濃度為200 mg·kg-1、Pb濃度為300 mg·kg-1的污染土壤中，白三葉根瘤菌的固氮能力也只是略有下降[5]。大量研究已經(jīng)證實(shí)，在豆科植物對(duì)土壤重金屬的修復(fù)過程中，根瘤菌起著非常重要的協(xié)同作用。根瘤菌不僅能讓豆科植物在重金屬污染土壤中正常生長(zhǎng)，緩解高濃度重金屬與類金屬元素對(duì)植物所造成的環(huán)境壓力[6]，而且還能通過將根際土壤中的重金屬吸附到根表或轉(zhuǎn)化成難溶形態(tài)，或者直接吸收進(jìn)入根內(nèi)，強(qiáng)化植物對(duì)重金屬的固定效果[7]；甚至將土壤重金屬通過根系富集到地上部的植物組織中，增加豆科植物對(duì)土壤重金屬的提取效率[8]。

貴州屬于礦產(chǎn)資源大省，已經(jīng)開采過的鉛鋅礦以及正在開采的錳礦、磷礦等不可避免的會(huì)對(duì)周邊環(huán)境造成不同程度的土壤重金屬污染，利用“豆科植物-根瘤菌”共生體系修復(fù)被污染的尾礦區(qū)及耕地土壤具有重要的生態(tài)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。然而，共生修復(fù)體系的利用首先必須依賴于共生固氮根瘤的有效形成，共生根瘤的形成同時(shí)受到細(xì)菌、植物及生態(tài)地理環(huán)境三個(gè)因素的共同影響，作為宿主的豆科植物自身要適應(yīng)環(huán)境的壓力，而與其結(jié)瘤的根瘤菌則面臨共生宿主和環(huán)境的雙重選擇，結(jié)果只能是既能與宿主植物識(shí)別又能適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的菌株才能與匹配植物形成根瘤固氮共生系統(tǒng)[9]。鑒于此，本研究從生長(zhǎng)在貴州地區(qū)重金屬尾礦地的天然豆科牧草中分離保存根瘤菌株，對(duì)尾礦污染地的共生根瘤菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和區(qū)系分析，在認(rèn)識(shí)貴州尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤菌種類分布特征和遺傳多樣性的基礎(chǔ)上，根據(jù)尾礦地存在的主要重金屬種類，從中篩選對(duì)主要幾種重金屬具有較強(qiáng)耐受能力的抗性菌株，目的在于挖掘利用本地尾礦區(qū)的共生根瘤菌資源，使篩選出來的抗性根瘤菌既能定殖共生于本地宿主豆科牧草根系，又能適應(yīng)貴州巖溶山區(qū)的喀斯特環(huán)境，為下一步篩選對(duì)復(fù)合重金屬污染土壤具有較強(qiáng)修復(fù)能力的“豆科牧草-根瘤菌”優(yōu)勢(shì)組合類型奠定共生微生物基礎(chǔ)，為采用適合在本地區(qū)推廣使用的“豆科植物-根瘤菌”共生體系治理修復(fù)重金屬污染環(huán)境提供可用的物質(zhì)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 根瘤樣品

1.1.1根瘤采集地點(diǎn) 野生豆科牧草根瘤樣品于2021年分別采自貴州省銅仁市松桃苗族自治縣的錳礦區(qū)、畢節(jié)市赫章縣的廢棄鉛鋅礦區(qū)和六盤水市鐘山區(qū)的鉛鋅礦區(qū)。18個(gè)尾礦采樣地的詳細(xì)信息見表1。

表1 貴州尾礦區(qū)天然豆科牧草根瘤樣品采集地信息表Table 1 Information of collecting sites of natural legume herbage nodule samples in Guizhou tailings area

1.1.2根瘤樣品采集及保存方法 選取各尾礦區(qū)已被污染且土壤已經(jīng)變色的地塊作為采樣點(diǎn)，挑選在尾礦地生長(zhǎng)正常的野生豆科牧草植株，以使選擇的采樣地和野生豆科牧草在各自的尾礦區(qū)具有代表意義。挖取植物根部，采集新鮮健壯、顏色鮮艷的成年根瘤，剪時(shí)稍帶一段根，編號(hào)并記錄采集時(shí)間、地點(diǎn)、生境、根瘤形狀、顏色、大小、著生位置、寄主豆科牧草種類等內(nèi)容，將采集樣品保藏于裝有變色硅膠的離心管中密封，4℃冰柜中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 根瘤菌株的分離純化

選取個(gè)體相對(duì)較大、顏色新鮮的根瘤，干燥的根瘤在無菌水中浸泡至吸脹，新鮮的根瘤用無菌水沖洗干凈后，立即挑取10～20顆健康飽滿的單個(gè)根瘤，先用95%乙醇浸泡5 min后再用0.1%HgCl2浸泡5 min，其間輕輕搖晃3～5次，無菌水沖洗5～10次后放入無菌研缽中，加入1 mL無菌水，磨棒研磨1 min，研磨液用無菌槍頭轉(zhuǎn)至加有剛果紅的酵母甘露醇瓊脂(Yeast mannitol agar,YMA)培養(yǎng)平板上，涂布均勻后放入培養(yǎng)箱內(nèi)，28℃恒溫倒置培養(yǎng)3～7 d，3 d后作每天1次的連續(xù)觀察。挑取菌落圓形、透明或半透明、邊緣整齊不吸色、濕潤黏稠、表面光滑隆起的典型單菌落，平板劃線接種至另一新的YMA平板上，28℃恒溫倒置培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，若不純，進(jìn)一步純化，確保獲得純化菌株。將純化菌株接種至YMA液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)7 d后用30%甘油保種，-80℃超低溫冰箱中凍存。

1.3 根瘤菌株的鑒定與區(qū)系分析

1.3.1根瘤菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 參照《微生物分類學(xué)》中原核細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定方法[10]，對(duì)純化后革蘭氏染色為紅色的陰性(G-)菌株進(jìn)行菌體形狀、莢膜和鞭毛有無等形態(tài)特征的觀察。菌體形狀在菌株革蘭氏染色鑒定時(shí)一并觀察記錄；采用石碳酸復(fù)紅染色液初染、黑色素復(fù)染方法油鏡觀察菌體莢膜的存在，如有莢膜，在灰色或黑色背景中，菌體呈紅色，莢膜無色；采用硝酸銀鞭毛染液染色法，油鏡觀察菌體鞭毛的存在及著生位置，菌體呈深褐色，體表鞭毛呈淺褐色。

1.3.2根瘤菌株的16S rRNA基因序列比對(duì) 采用杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取各菌株的總DNA，選用7f-1540r細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物對(duì)擴(kuò)增各菌株的16S rDNA片段；選用質(zhì)粒PMD18-T載體與純化回收的PCR產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；利用生工生物工程(上海)股份有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，酶切驗(yàn)證后送上海生工成都測(cè)序?qū)嶒?yàn)室測(cè)序。在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站中將測(cè)得的各菌株序列分別進(jìn)行Blast在線比對(duì)，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與各菌株序列相近的模式菌株的16S rDNA序列，將待分析菌株序列與模式菌株序列選用DNAMAN軟件進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)合各菌株的形態(tài)特征，確定其種屬分類地位。

1.3.3根瘤菌株的區(qū)系分析 根據(jù)分離菌株的分類鑒定結(jié)果，對(duì)分離到的貴州尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤菌的種類組成、分布頻率以及優(yōu)勢(shì)種類進(jìn)行系統(tǒng)分析。分布頻率采用微生物區(qū)系分析普遍使用的相對(duì)頻率計(jì)算公式分別計(jì)算[11]：相對(duì)頻率(%)=(有某菌種發(fā)生的各樣品數(shù)/有菌種發(fā)生的總樣品數(shù))×100。

1.4 根瘤菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

使用Clustal X(1.8)軟件包進(jìn)行各菌株種類16S rRNA基因的多序列匹配排列，進(jìn)化距離運(yùn)用MEGA4軟件包中的Kimura2-Parameter Distance模型計(jì)算；采用貝葉斯軟件進(jìn)行聚類分析，PAUP和TreePuzzle軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 重金屬抗性根瘤菌株的篩選

1.5.1供試菌株 由于菌株的抗性檢測(cè)需要設(shè)立5種重金屬離子、各3個(gè)濃度梯度的試驗(yàn)處理，工作量較大，因此本研究從分離純化并經(jīng)鑒定確為根瘤菌的保存菌株中，優(yōu)先選擇種類不同、宿主牧草地域不同且在YMA平板上菌落生長(zhǎng)良好的根瘤菌作為抗重金屬試驗(yàn)的供試菌株。

1.5.2重金屬平板篩選 根據(jù)貴州尾礦地重金屬的分布特點(diǎn)，選擇其中含量較高、分布較廣的鉛、鋅、鉻、錳、鎘五種重金屬用于配制篩選平板。參照抗性根瘤菌篩選最常使用的重金屬離子的濃度范圍[12]，分別配制Pb2+，Zn2+，Cr6+，Mn2+，Cd2+五種重金屬離子各1 mmol·L-1，2 mmol·L-1，3 mmol·L-1的YMA平板，接種挑選出的供試菌株，每個(gè)菌株、每種重金屬及每個(gè)梯度濃度接種3個(gè)平板作為3個(gè)重復(fù)，接種無重金屬鹽的YMA平板作對(duì)照，28℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，分別在第2 d、第5 d、第7 d、第10 d、第14 d連續(xù)5次觀察菌落的生長(zhǎng)情況，記錄各菌落的直徑大小，計(jì)算各菌株菌落直徑的平均值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)；使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離獲得的根瘤菌菌株及其形態(tài)特征

從55份尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤樣品中，經(jīng)分離純化和染色鑒定，共培養(yǎng)出83個(gè)革蘭氏陰性(G-)純化菌株。分別觀察各G-菌株的菌體形態(tài)特征，顯示菌體形態(tài)均為桿狀，長(zhǎng)短各不相同，菌體表面有莢膜或無莢膜，但均有鞭毛著生，著生位置端生、側(cè)生或周生，符合根瘤菌的基本形態(tài)特征。

2.2 根瘤菌株的種類鑒定與區(qū)系分析結(jié)果

83個(gè)G-保存菌株的總DNA采用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取，瓊脂糖凝膠電泳均檢測(cè)到23 kb左右的條帶。選用16S rDNA序列擴(kuò)增通用引物對(duì)P1—P6，全部菌株都擴(kuò)增出約1.5 kb的序列片段。根據(jù)菌株的形態(tài)鑒定和16S rDNA的分子鑒定，分離培養(yǎng)的尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤菌的種屬鑒定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在83個(gè)G-菌株中共鑒定出根瘤菌71株，其余12個(gè)菌株屬于在根瘤內(nèi)與根瘤菌一起共生的根瘤內(nèi)生細(xì)菌。

表2 基于16S rDNA序列比對(duì)的分離根瘤菌株分子鑒定結(jié)果Table 2 Taxonomic identification results of rhizobial strains based on 16S rDNA sequence alignment

將鑒定出的根瘤菌種類進(jìn)行區(qū)系分析(表3)，結(jié)果顯示，分離獲得的貴州尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤菌分屬于7個(gè)屬28個(gè)種。7個(gè)屬分別為：根瘤菌屬(Rhizobium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、劍菌屬(Ensifer)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。其中根瘤菌屬的分布頻率最高，達(dá)54.93%，為優(yōu)勢(shì)屬；假單胞菌屬和中慢生根瘤菌屬次之，分別為18.31%和16.90%；28個(gè)種中的木蘭根瘤菌(R.indigoferae)分布頻率最高，達(dá)到15.49%，為優(yōu)勢(shì)種；菜豆根瘤菌(R.phaseoli)和豌豆根瘤菌(R.leguminosarum)次之，同為12.68%。

表3 貴州尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤菌區(qū)系分析結(jié)果Table 3 Results of rhizobia flora analysis of wild legume forages in Guizhou area near tailing dam

續(xù)表3

2.3 根瘤菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)鑒定出的28種根瘤菌的16S rDNA序列，構(gòu)建的貴州尾礦區(qū)天然豆科牧草根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1。28種根瘤菌分為5大類群18個(gè)分支，而其中有3個(gè)分支是由不同屬的種類聚成的，分別是α-變形菌綱中的綠豆根瘤菌(Rhizobium.vignae)和多源中慢生根瘤菌(Mesorhizobium.plurifarium)、內(nèi)坡烏姆根瘤菌(R.nepotum)和根癌土壤桿菌(Agrobacterium.tumefaciens)、中華根瘤菌(Sinorhizobium.arboris)和補(bǔ)骨脂劍菌(Ensifer.psoraleae)；另外，γ-變形菌綱內(nèi)假單胞菌屬中的3個(gè)種類：油菜假單胞菌(Pseudomonasbrassicacearum)、皺紋假單胞菌(P.corrugata)和食樹脂假單胞菌(P.resinovorans)獨(dú)立形成一個(gè)分支；α-變形菌綱內(nèi)慢生根瘤菌屬中的大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)獨(dú)立形成一個(gè)分支；劍菌屬中的粘著劍菌(Ensiferadhaerens)獨(dú)立形成一個(gè)分支。這說明貴州尾礦區(qū)天然豆科牧草根瘤菌具有復(fù)雜的遺傳背景和明顯的豐富多樣性。

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建的28種根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 28 species of rhizobia based on 16S rDNA sequence

2.4 重金屬抗性根瘤菌株的篩選結(jié)果

根據(jù)貴州尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤菌的分離鑒定結(jié)果，按照不同地域、不同種類且菌落生長(zhǎng)良好的挑選原則，共選出17個(gè)菌株作為重金屬抗性檢測(cè)篩選對(duì)象，菌株名分別為：HMZT039-2，HMZT039-6，HMZM040-1，HMZM040-3，HSST042-1，HSST042-6，HSST044-1，HSST044-2，HSST046-1，HSSA047-1，HXYT048-1，HXYT049-1，HXTT050-1，WEMT051-2，ZHQT052-1，ZHQT054-1，ZHQT055-1。

將17個(gè)供試菌株分別接種5種重金屬離子3個(gè)濃度梯度的YMA平板后，分5次觀察記錄各平板上菌落的生長(zhǎng)情況，記錄各菌落的直徑大小，計(jì)算各菌株菌落直徑的平均值。研究證明，根瘤菌在含重金屬鹽的平板上生長(zhǎng)相對(duì)較慢，而且在3 mmol·L-1鹽濃度的平板上能正常生長(zhǎng)的根瘤菌屬于高抗菌株[12]，因此在該濃度平板上第14 d的菌落生長(zhǎng)直徑是較為有效的篩選指標(biāo)。本篩選實(shí)驗(yàn)中最終第5次(第14 d)的觀察記錄結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，17個(gè)供試菌株在不含重金屬鹽的YMA平板上都能正常生長(zhǎng)，但在某些重金屬鹽平板上無菌落形成。根據(jù)3個(gè)重復(fù)平板均有菌落生長(zhǎng)為判斷標(biāo)準(zhǔn)，得出的具體測(cè)定結(jié)果為：菌株HMZM040-1和ZHQT055-1可耐受3 mmol·L-1的Mn2+和Cr6+，2 mmol·L-1的Zn2+；ZHQT054-1可耐受3 mmol·L-1的Mn2+和Cr6+，2 mmol·L-1的Zn2+，1 mmol·L-1的Pb2+；HXYT048-1和HXYT049-1可耐受3 mmol·L-1的Mn2+，Cr6+和Zn2+，1 mmol·L-1的Pb2+；HSST044-1，HSST046-1和WEMT051-2可耐受3 mmol·L-1的Mn2+和Cr6+，2 mmol·L-1的Pb2+和Zn2+；HMZT039-2，HSST044-2和HSSA047-1可耐受3 mmol·L-1的Mn2+，Cr6+和Zn2+，2 mmol·L-1的Pb2+；HMZM040-3可耐受3 mmol·L-1的Mn2+，Cr6+，Pb2+和Zn2+；HXTT050-1可耐受3 mmol·L-1的Mn2+，Cr6+和Zn2+，2 mmol·L-1的Cd2+，1 mmol·L-1的Pb2+；HSST042-1可耐受3 mmol·L-1的Mn2+，Cr6+，Zn2+和Cd2+，1 mmol·L-1的Pb2+；ZHQT052-1可耐受3 mmol·L-1的Mn2+，Cr6+，Pb2+和Zn2+，1 mmol·L-1的Cd2+；HSST042-6可耐受3 mmol·L-1的Mn2+，Cr6+，Pb2+和Zn2+，2 mmol·L-1的Cd2+；菌株HMZT039-6能耐受3 mmol·L-1的全部5種重金屬離子。

表4 接種后第14 d供試菌株在重金屬平板上菌落生長(zhǎng)直徑測(cè)定結(jié)果Table 4 Measurement results of colony growth diameter of tested strains on heavy metal plates when inoculated for 14 days 單位：mm

續(xù)表4

歸納起來，測(cè)定結(jié)果顯示出下列4個(gè)特征：①部分菌株對(duì)某種重金屬?zèng)]有抗性的，就算在低濃度(1 mmol·L-1)的平板上也一直沒有菌落生長(zhǎng)；②部分菌株對(duì)某種重金屬只能在1 mmol·L-1低濃度的平板上生長(zhǎng)，有的菌株對(duì)某種重金屬可以在2 mmol·L-1中濃度的平板上生長(zhǎng)，但不能耐受3 mmol·L-1的高濃度；③全部供試菌株都能耐受3 mmol·L-1的Mn2+和Cr6+，2～3 mmol·L-1的Zn2+，17個(gè)菌株中的15株都能耐受1～3 mmol·L-1的Pb2+，能耐受Cd2+的菌株相對(duì)較少，17個(gè)供試菌株中只有5株；④所有菌株都能耐受至少3種不同種類、不同濃度的重金屬離子。

根據(jù)耐受重金屬的種類數(shù)量及耐受濃度來劃分，篩選出的優(yōu)良菌株抗復(fù)合重金屬的能力大小依次排序?yàn)椋篐MZT039-6>HSST042-6>HSST042-1，ZHQT052-1>HXTT050-1>HMZM040-3>HMZT039-2，HSST044-2，HSSA047-1>HSST044-1，HSST046-1，WEMT051-2>HSST042-1>HXYT048-1，HXYT049-1>ZHQT054-1>HMZM040-1，ZHQT055-1。其中，分離自赫章縣媽姑鎮(zhèn)榨子廠七星礦區(qū)白三葉根瘤的HMZT039-6，分離自赫章縣水塘堡鄉(xiāng)海子田村廢礦區(qū)白三葉根瘤的HSST042-6和HSST042-1，分離自六盤水鐘山區(qū)紅橋村青山礦業(yè)區(qū)白三葉根瘤的ZHQT052-1，以及分離自赫章縣興發(fā)鄉(xiāng)銅爐上村鉛鋅廢礦區(qū)白三葉根瘤的HXTT050-1等5個(gè)菌株，能耐受供試的全部5種重金屬離子，為篩選出的最優(yōu)抗性菌株。

3 討論

重金屬尾礦區(qū)在經(jīng)過一定時(shí)間的自然選擇后都會(huì)出現(xiàn)不同數(shù)量和種類的耐受本土植物，特別是野生豆科植物，并形成能適應(yīng)礦區(qū)重金屬環(huán)境的“豆科植物-根瘤菌”共生體系，進(jìn)而形成不同尾礦區(qū)豆科植物根瘤菌特定的區(qū)域分布特征[13]。2006年，朱毓華等[14]對(duì)分離自陜西太白金礦廢棄地8種豆科植物的108株根瘤菌進(jìn)行唯一碳源、氮源利用等151項(xiàng)表型性狀分析，發(fā)現(xiàn)供試菌株在85%的相似水平上聚成5個(gè)類群，顯示分離自廢棄地同一生境下不同寄主植物的根瘤菌存在著明顯的表型多樣性；2007年，余建福等[15]又對(duì)分離自陜西太白金礦尾礦區(qū)豆科植物的55株根瘤菌進(jìn)行種群分析，發(fā)現(xiàn)它們分為Rhizobium，Sinorhizobium，Mesorhizobium，Agrobacterium4個(gè)群和1個(gè)未知群，暗示尾礦區(qū)生態(tài)環(huán)境的差異也會(huì)導(dǎo)致根瘤菌不同的多樣性特征。2008年，位秀麗[16]通過多相分類方法和系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)西北尾礦區(qū)天藍(lán)苜蓿根瘤菌的多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)69株供試天藍(lán)苜蓿根瘤菌被分別劃分在中華根瘤菌屬、根瘤菌屬和土壤桿菌屬，其中64株屬于中華根瘤菌屬，表明同一尾礦地與同種豆科植物結(jié)瘤共生的根瘤菌具有相對(duì)的專一性。2012年，李彪[17]對(duì)分離自云南會(huì)澤鉛鋅尾礦3種鄉(xiāng)土豆科植物(白三葉、苕子和紫花苜蓿)的49株根瘤菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诎l(fā)育樹樹上屬于Rhizobiumsp.，Sinorhizobiumsp.和Bradyrhizobiumsp. 3個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支，而且按鉛鋅含量采集地的不同，分別聚集為OTU1，OTU2和OTU3三個(gè)群，說明尾礦區(qū)豆科植物根瘤菌的遺傳多樣性還與土壤中重金屬的種類與含量存在著相關(guān)關(guān)系。

本研究在貴州尾礦地采集根瘤樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同污染區(qū)域內(nèi)能夠自然生長(zhǎng)的豆科牧草種類存在著較大差別，而且數(shù)量都很有限，這應(yīng)該是不同地理?xiàng)l件、不同小生態(tài)環(huán)境以及土壤中不同重金屬種類及不同濃度脅迫所形成的結(jié)果，因此在取樣時(shí)不能做到每個(gè)礦區(qū)每種植物的種類和數(shù)量都具有一致性。但是，所選擇的采樣地一定是明顯被污染的地塊，污染地塊上所有的豆科牧草種類都會(huì)被選取，而且每一種牧草都會(huì)在5個(gè)以上不同的位置挖取根瘤，因而能夠代表每一尾礦地域內(nèi)天然豆科牧草根瘤菌資源的基本情況。在18個(gè)尾礦區(qū)共采集到15種野生豆科牧草，分離出的根瘤菌分屬于7個(gè)屬28個(gè)種，包括已報(bào)道的Rhizobium，Sinorhizobium，Mesorhizobium，Bradyrhizobium，Agrobacterium等5個(gè)屬[18]以及未見報(bào)道的Ensife和Pseudomonas2個(gè)屬的根瘤菌種類，顯示貴州尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤菌具有明顯的豐富多樣性。另外，在篩選出的5個(gè)優(yōu)良抗性根瘤菌株中，有4個(gè)菌株(HMZT039-6，ZHQT052-1，HSST042-1和HXTT050-1)屬于根瘤菌屬，只有1個(gè)菌株(HSST042-6)屬于劍菌屬，而其中又有3個(gè)菌株(ZHQT052-1，HSST042-1和HXTT050-1)都屬于木蘭根瘤菌(Rhizobiumindigoferae)。這一分布結(jié)果與貴州尾礦區(qū)根瘤菌區(qū)系分布中根瘤菌屬為優(yōu)勢(shì)屬、木蘭根瘤菌為優(yōu)勢(shì)種的研究結(jié)果具有一致性。

由于長(zhǎng)期適應(yīng)與代謝調(diào)節(jié)的原因，共生根瘤菌的耐受能力必定與土壤中重金屬種類與濃度背景值存在著一定關(guān)系。但是在實(shí)驗(yàn)條件下篩選抗性菌株時(shí)，由于菌體處于非共生的自由生長(zhǎng)狀態(tài)，重金屬濃度的設(shè)置無需與土壤背景值保持一致。本研究選用的是經(jīng)檢驗(yàn)證實(shí)確為有效可行的1～3 mmol·L-1的重金屬濃度[12]，并選擇貴州尾礦土含量相對(duì)較多的具有代表性的鉛、鋅、錳、鉻、鎘5種重金屬進(jìn)行篩選試驗(yàn)。在優(yōu)先選擇的17個(gè)供試菌株中，所有參試菌株都能對(duì)較高濃度的Mn2+，Cr6+和Zn2+產(chǎn)生抗性，15個(gè)菌株都能耐受一定濃度的Pb2+，5個(gè)菌株能單獨(dú)耐受包括Cd2+在內(nèi)的5種重金屬，這與采樣地中大部分尾礦土都含有Mn，Cr，Zn，Pb，少部分含有Cd元素這一背景值具有一定的相關(guān)性。這說明，在含重金屬的尾礦土壤中，能夠與豆科植物共生結(jié)瘤的根瘤菌，在一定程度上都已經(jīng)適應(yīng)并形成了對(duì)本土重金屬的耐受能力，這種耐受能力應(yīng)該與土壤中重金屬的種類和含量存在著一定的關(guān)系；同時(shí)不同菌株之間對(duì)不同重金屬以及復(fù)合重金屬的耐受能力客觀上還是存在著明顯的差異。研究已經(jīng)證實(shí)，在實(shí)驗(yàn)條件下，同時(shí)存在的2種或2種以上的復(fù)合重金屬會(huì)不同程度的抑制菌株對(duì)單種重金屬的耐受能力[19]。但是在自然條件下，尾礦土壤中存在的重金屬都會(huì)是2個(gè)以上的不同種類[20]，從尾礦區(qū)豆科植物根瘤中分離篩選出的根瘤菌勢(shì)必具有耐受復(fù)合重金屬的能力，它們更容易在地方環(huán)境的豆科植物根系內(nèi)定殖共生，更有利于在本地區(qū)發(fā)揮重金屬污染土壤的共生修復(fù)效應(yīng)，是一筆可貴的共生微生物資源[21]。

由于根瘤菌必須與宿主豆科植物共生結(jié)瘤后才能有效發(fā)揮土壤重金屬污染的修復(fù)作用[22]，所以本研究的下一步計(jì)劃是接著將篩選出的最優(yōu)抗性菌株回接貴州巖溶山區(qū)不同種類的天然適生豆科牧草，進(jìn)一步篩選對(duì)復(fù)合重金屬污染土壤具有較強(qiáng)修復(fù)能力的“豆科牧草-根瘤菌”優(yōu)勢(shì)組合類型，為采用適合在本地區(qū)推廣使用的“豆科植物-根瘤菌”共生體系治理修復(fù)重金屬污染環(huán)境提供可用的物質(zhì)和技術(shù)保證。

4 結(jié)論

貴州尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤菌主要包括根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、中慢生根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、劍菌屬、土壤桿菌屬和假單胞菌屬7個(gè)屬的28個(gè)種，其中根瘤菌屬是優(yōu)勢(shì)屬，木蘭根瘤菌是優(yōu)勢(shì)種，本地尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤菌具有特定的豐富多樣性。

從分離鑒定的尾礦區(qū)野生豆科牧草根瘤菌中，優(yōu)先選擇17個(gè)來自不同地域和不同種類且菌落生長(zhǎng)良好的菌株作為篩選對(duì)象，其中分離自4個(gè)不同尾礦區(qū)而且都是白三葉根瘤樣品的5個(gè)菌株(HMZT039-6，ZHQT052-1，HSST042-6，HSST042-1和HXTT050-1)對(duì)5種供試重金屬離子均有較強(qiáng)的耐受能力，在本地重金屬尾礦區(qū)的土壤和植被恢復(fù)中具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。