費星宇， 趙 泓， 杜 洋， 段夢琪， 王晨晨， 張 彬， 劉 雪， 李大勇， 許立新*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 北京 100083； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所， 北京 100083； 3.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山東 濟南 250014)

菊苣(CichoriumintybusL.)，又稱歐洲菊苣，是菊科(Asteraceae)菊苣屬(Cichorium)多年生草本植物。菊苣起源于歐洲地中海地區(qū)，從古羅馬和古希臘時期開始人工培育[1]，廣泛分布在全球的溫帶和熱帶地區(qū)[2]，多見于陽光充足的環(huán)境。菊苣在我國 20 世紀(jì) 70 年代末引入種植，其適應(yīng)能力極強，耐寒抗旱，較抗病，極少發(fā)生病害與蟲害[3]。菊苣是世界優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟作物和高產(chǎn)青鮮飼用牧草之一，具有廣闊的發(fā)展前景。菊苣可以作為食用葉菜類蔬菜[4]，也可以作為藥用植物[5]。一方面，菊苣根部可作為咖啡的替代品[6];另一方面，菊苣可以防治高血糖、高血脂[7]，具有藥用價值。此外菊苣還可作為動物飼養(yǎng)用料使用[8-9]，具有礦物質(zhì)含量高、營養(yǎng)價值高、飼口性好、易消化、生產(chǎn)率高和刈割后再生能力強等優(yōu)良特性[10-11]。菊苣品質(zhì)優(yōu)良，可以提高飼喂牲畜的肉質(zhì)品質(zhì)，從而可以有效節(jié)省飼料成本，使得飼養(yǎng)戶的經(jīng)濟效益得到進一步提高。牛鋒等[12]研究表明，在肉牛的日糧中加入菊苣，肉牛的平均日增重相比對照組增加了 26.32%，育肥效果得到了明顯的改善；王玉麒等[13]研究表明，在肉羊的日糧中加入菊苣，肉羊的肉產(chǎn)質(zhì)量也會得到明顯的改善。因此,菊苣作為我國極具推廣發(fā)展的節(jié)糧型飼料牧草之一，其生理和分子生物學(xué)研究也將成為牧草領(lǐng)域研究熱點。然而，作為非模式植物，菊苣沒有其他模式植物已經(jīng)完備的基因組數(shù)據(jù)，阻礙了菊苣分子機理探索和基因資源進一步開發(fā)[14-15]，菊苣基因組測序和基因功能研究亟需開展。

在基因組測序前對物種的基因組大小進行測定能夠為基因組測序深度提供數(shù)據(jù)支持?；蚪M大小，又稱C值，是生物體單倍體基因組的DNA總量。大小一般用質(zhì)量進行衡量，一般以皮克(pg)為常用單位,隨著測序技術(shù)的發(fā)展，目前也常用核苷酸堿基對(Base pair，bp)的數(shù)量表示，1 pg DNA約等于 978 Mb(million base pair)。近年來已有近 1萬多種植物的C值收錄于植物基因組大小數(shù)據(jù)庫(https://cvalues.science.kew.org/)。流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)和基因組調(diào)查(genome survey)作為測定基因組大小的主流方法在植物中被廣泛使用。流式細胞術(shù)通過發(fā)揮熒光染料定性定量與DNA雙鏈碳架結(jié)構(gòu)相結(jié)合的特性進行測定，它具有快速分析、多個檢測參數(shù)、客觀的結(jié)果等優(yōu)勢[16]。同時，隨著測序技術(shù)的發(fā)展成熟，進行基因組測序費用已經(jīng)大大降低，一般的實驗室都能承受，基于二代測序技術(shù)的基因組調(diào)查為獲得可靠的基因組大小提供有力的技術(shù)支持[17]。

本研究對菊苣的牧草品種‘將軍’(General，K042)進行染色體計數(shù)和基因組大小估算研究，并利用二代測序進行全基因組調(diào)查測序和重新組裝研究，初步分析K042 基因組大小和雜合率等特性，以期為進一步揭示K042 ‘將軍’菊苣的高精度全基因組序列，推動其分子生物學(xué)研究和分子標(biāo)記研究[18-19]奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長條件

菊苣(CichoriumintybusL.)優(yōu)質(zhì)牧草品種‘將軍’(General，本實驗室編號為K042)，購自黃家百綠公司。流式細胞術(shù)對照樣品生菜(LactucasativaL.) 品系選用‘L85’，‘L85’由國家蔬菜工程技術(shù)研究中心提供。所有植物材料均在國家蔬菜工程技術(shù)研究中心溫室栽培。首先選取大小均勻、顆粒飽滿的種子擺放于蒸餾水潤濕的雙層濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng) 4 d，后續(xù)將生長良好的幼苗移栽于口徑為 30 cm的盆中(珍珠巖∶草炭灰∶蛭石=1∶4∶1)培養(yǎng)30 d進行取樣。培養(yǎng)條件：光周期為 16 h/8 h (日/夜)，晝夜溫度分別為 25℃和 20℃，濕度為 60%。

1.2 DNA提取和PCR擴增

取K042 的幼嫩葉片組織 1 g，CTAB法粗提DNA[20]。利用特異性擴增引物進行ITS的PCR擴增：P1-F(5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′)和P4-R(5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系 50 μL：2×Phanta Mix 25 μL(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，DNA模板 2 μL，上下游引物各 2.5 μL，DMSO 2 μL，ddH2O 16 μL。PCR擴增程序如下：預(yù)變性 95℃/5 min，變性 95℃/30 s，退火 57℃/30 s，72℃/1 min 30 s，35個循環(huán)，72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物采用DNA凝膠回收試劑盒FastPure?Gel DNA Extaction Mini Kit (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)回收純化。回收產(chǎn)物與1 μL pEASY-Blunt Zero Cloning載體(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)進行連接。然后加入 50 μL大腸桿菌 E. coli DH5α 感受態(tài)細胞(北京華越洋生物科技有限公司)中進行轉(zhuǎn)化，以上具體操作參考說明書。培養(yǎng)皿中共獲得 200 余個單克隆，隨機選取 6個單菌落，經(jīng)菌液培養(yǎng)和PCR檢測后測序(北京睿博興科生物技術(shù)有限公司)。

1.3 系統(tǒng)進化分析

以測序獲得的K042 的ITS序列為檢索對象，利用NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中的GenBank數(shù)據(jù)庫，查詢下載已發(fā)表的其他 4種菊科植物的ITS序列：生菜(Lactucasativa，AJ633337)、向日葵(Helianthusannuus，AF047927)、蒲公英(Taraxacummongolicum，EU057986)和蒼耳(Xanthiumsibiricum，AF210915)，其中蒲公英和蒼耳為外類群。將收集到的序列信息導(dǎo)入ClustalW軟件，得到以上 5種菊科植物的序列比對信息。利用MEGA 6軟件[21]自帶Neighbor Joining算法，程序循環(huán)重復(fù) 1 000 次，完成系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建。

1.4 染色體計數(shù)

K042 的種子在約 25℃的培養(yǎng)皿中萌發(fā)3～5 d，剪取幼苗根尖約 0.5 cm。根尖用預(yù)處理液(0.05% 秋水仙素)處理2小時，在 4℃下用新鮮的卡諾固定液固定24 個小時后至 75% 乙醇溶液中。制備載玻片時，根尖在蒸餾水中浸泡約 20 min后放入 2% 的混合酶(纖維素酶∶果膠酶=4∶1)中，溫度設(shè)定為37℃，反應(yīng)消化約 60～90 min。根尖經(jīng)過混合酶消化后，轉(zhuǎn)移到蒸餾水中浸泡約 20 min，為壓片做準(zhǔn)備。壓片前，根尖放在載玻片上，加 1滴固定液后用鑷子敲碎根尖，然后加 1滴蘇木精染液及DAPI，最后滴 1滴固定液，載玻片使用液氮進行凍結(jié)，完成固定后取下蓋玻片。載玻片用 96% 乙醇溶液脫水，室溫條件下進行風(fēng)干，使用鏡檢法計數(shù)染色體數(shù)目。觀察統(tǒng)計 40 個細胞數(shù)目，要求 85% 以上的細胞保持穩(wěn)定一致的染色體數(shù)，即為K042 的染色體數(shù)目。所有圖像均使用Zeiss Imager M2進行觀察，Zen2軟件100倍物鏡下拍照[22]。

1.5 流式細胞術(shù)分析

所有試樣(每份樣品鮮重 20 mg)置于 0.8 ml LB01分離緩沖液中，迅速切碎葉片,冰上放置 10 min，用孔徑為 30 μm的金屬過濾網(wǎng)過濾，獲得細胞核懸浮液。然后在過濾后的懸液中加入RNase I(40 μg·mL-1)，最后用預(yù)冷的染色液-碘化丙啶(PI)(40 μg·mL-1)熒光標(biāo)記懸浮液中葉片細胞的核DNA，冰上閉光染色 30 min。實驗中以已知確定基因組大小的生菜(Lactucasativa)品系‘L85’作為內(nèi)標(biāo)。使用流式細胞檢測儀(BD FACSCalibur system，BD Biosciences)進行檢測，測定混合懸液中PI的熒光發(fā)射強度。采用ModFit3.0 軟件(Verity software House)分析數(shù)據(jù)，通過公式(1)計算基因組大小。

(1)

1.6 Illumina測序文庫構(gòu)建與基因組測序

Illumina(San Diego，CA)測序時，采用Covaris超聲波破碎儀，將樣本中的DNA打碎成 350 bp的小片段，然后將片段化的DNA兩端加上接頭，建立DNA測序文庫，后續(xù)測序在北京諾禾致源科技公司二代測序平臺Illumina HiSeq PE150 平臺上完成。

1.7 根據(jù)K-mer分析的K042 基因組結(jié)構(gòu)、雜合率和重復(fù)率估計

采用軟件jellyfish(V2.2.7，http://www.cbcb.umd.edu/software/jellyfish)來估算K042 的基因組大小、基因組中的重復(fù)序列等。使用程序jellyfish_query_ hash[23]對獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，并通過圖像進行數(shù)據(jù)分析。在K-mer分析中設(shè)置k=17。使用Microsoft Excel 2017繪制K-mer分布圖像，初步估計K042的基因組特性。通過計算純合峰深度為 1.8 倍后面的K-mer個數(shù)所占的百分比，獲得雜合率這一特性參數(shù)。利用標(biāo)準(zhǔn)泊松計算結(jié)果，計算實際數(shù)據(jù)和泊松分布結(jié)果的面積差值，獲得重復(fù)率這一特征參數(shù)。通過公式(2)、(3)估算基因組大小，(4)計算雜合率。

Cbase=Ck-mer×L/(L-K+1)

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(4)

1.8 初步的基因組組裝

利用Soapdenovo 2[24]在Illumina平臺進行K042 基因組的組裝，根據(jù)重疊信息把測序得到的短讀段(reads)組裝成重疊群(contigs)，然后對得到的contigs進行排序與定向，將contigs組裝成scaffolds。基因組在裝配后，可以通過contig N50 長度來檢測組裝的連續(xù)性，該值越大說明組裝效果越好。

1.9 GC含量分析

在過濾后的高質(zhì)量序列上以 2Kb為窗口大小，每個窗口中x表示GC含量，y表示測序深度，根據(jù)其GC分布以及覆蓋深度信息繪制散點圖。利用Bowtie2[25]檢測GC含量分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 將軍菊苣(K042) 的物種鑒定

為確定本研究供試材料‘將軍’(編號為K042)是否為菊苣的真實樣品，首先對材料開展了形態(tài)學(xué)研究和分子生物學(xué)鑒別。經(jīng)過溫室和大田的種植觀察證實，K042 是多年生草本，其莖枝全部為綠色，有條棱，株高約 40～100 cm。通過系統(tǒng)觀察K042 的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)特性與《中國植物志》(第 80(1)卷)的有關(guān)記述相同[2]。

圖1 菊苣品種‘將軍’(K042)的形態(tài)Fig.1 Morphology of a chicory (Cichorium intybus ‘General’ (K042))注:比例尺= 5 cm；Note:Bar=5 cm

對K042 的ITS序列分析表明，6個ITS序列并不完全一致。K042 完整的ITS區(qū)域，全長 640～641 bp，分為非編碼間隔區(qū)ITS1(163 bp)、ITS2(223～224 bp)和 5.8S rDNA(163 bp)，K042 的ITS序列與已報道相同的菊苣(編號：AJ746388.1)ITS序列顯示出較高的一致性，表明該材料K042 是菊苣。此外，使用MEGA7.0 軟件對K042 及另外 4種菊科植物的ITS序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。菊苣及其近緣物種分子進化樹分析顯示，K042 和其他物種之間均存在一定程度的差異，跟生菜的親緣關(guān)系較近。

圖2 菊苣及其近緣物種的ITS序列的分子進化樹Fig.2 The molecular evolutionary tree inferred from ITS sequences of Cichorium intybus ‘K042’ and its related species注:使用鄰-接方法進行分類;分支上面的數(shù)字是代表bootstrap值Note:Neighbour-Joining method is used for analysis;The number above the branch is the bootstrap value

2.2 K042染色體計數(shù)

通過觀察K042染色體中期分裂期，實驗結(jié)果顯示，K042的體細胞染色體數(shù)目穩(wěn)定，是18條(2n=18)(圖3)，即K042的基因組由9對染色體構(gòu)成。

圖3 K042的根尖細胞染色體中期分裂圖(2n=18)Fig.3 The chromosome metaphase diagram of somatic cell of K042 (2n=18)注:此處為具有代表性的分裂相；比例尺= 100 μmNote:The representative image is shown here;Bar=100 μm

2.3 流式細胞術(shù)估計基因組大小

本研究選取生菜(Lactucasativa)(2.80 pg·C-1，2 738.00 Mb)(http://cvalues.science.kew.org/)作為內(nèi)參，進行流式細胞實驗用以估算K042的基因組大小。根據(jù)流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示，P1和P2分別為將軍菊苣DNA的G1期和G2期，P3為生菜DNA的G1期。初步估算K042的基因組大小約為 1 170.00 Mb(圖4)。

圖4 用流式細胞術(shù)測定K042 菊苣的基因組大小Fig.4 Estimation of the genome size of Cichorium intybus ‘K042’ using flow cytometry注:以生菜品系‘L85’為內(nèi)標(biāo)Note:Lettuce (Lactuca sativa)line ‘L85’ was used as internal standards

2.4 Illumina測序及數(shù)據(jù)過濾

Illumina HiSeq PE150 平臺測序獲得的 51.14 GB原始數(shù)據(jù)經(jīng)過pk_qc.v2及redup.v2軟件的過濾篩選，過濾掉低質(zhì)量的讀段、切除低質(zhì)量的堿基(Q-score低于 20)及人工序列污染(接頭和PCR引物)，得到約 51.05 Gb的干凈片段(Clean reads)，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.5 K-mer分析估計基因組大小

前期通過流式細胞儀實驗測定之后，本研究后續(xù)對基因組大小進行更詳細的K-mer分析。估算K-mer值不僅可以估計基因組大小，還可以檢測基因組的雜合度，雜合度越高的物種基因組組裝難度越大。本研究K-mer取 17 進行數(shù)據(jù)分析。估算結(jié)果表明，K042 基因組大小約為 1 424.00 Mb，同時得到K042 基因組的平均有效測序深度約為 25×(表1)。利用Genomescope[26]估算基因組雜合率為 1.12%，重復(fù)序列約為 73.56%(圖5)。由此推斷，菊苣基因組雜合度高，且重復(fù)序列豐度也為較高水平，屬于高復(fù)雜基因組。

圖5 菊苣K042基因組大小的17K-mer分析Fig.5 17 K-mer analysis of the genome size of Cichorium intybus ‘K042’注:x軸為K-mer深度/×,y軸為對應(yīng)深度的K-mer個數(shù)Note:The x-axis represents the sequencing depth/× and the y-axis is the proportion that represents the frequency of a specific depth

表1 菊苣基因組序列中的K-mer數(shù)據(jù)Table 1 K-mer data of Cichorium intybus genomic sequences

2.6 初步的基因組組裝和GC含量分析

在本研究中，測序數(shù)據(jù)用SOAPDENOVO2軟件[24]組裝了一個大小為 823.36 Mb的菊苣基因組，其中包括 1.03 kb的重疊群(Contigs)。進一步對菊苣基因組序列進行污染檢測(圖6)，結(jié)果表明，GC分布圖發(fā)生了明顯的分離現(xiàn)象，圖中黑色部分為點密度較大的區(qū)域，為該圖最大密度區(qū)，圖中沒有明顯的橫向區(qū)塊分布，重心在 25 的位置，對應(yīng)右邊的contig覆蓋分布。圖中上方顯示的是GC含量分布，36%的位置為主峰的位置，且黑色的散點也分布在GC含量 36% 附近，圖中的GC含量和計算得出的基因組GC含量基本一致。GC含量分析表明，新裝配的菊苣基因組受到較小的外源污染。

圖6 K042的GC深度分布Fig.6 GC depth distribution of Cichorium intybus ‘K042’注:x表示GC含量，y表示測序深度；黑色的部分代表該散點圖中點的密度比較大的部分Note:The x-axis shows the GC-content of each fragment and the y-axis is the sequencing depth of each fragment;Darker blue means region with higher density

表2 K042基因組序列組裝統(tǒng)計Table 2 Statistics of assembled Cichorium intybus ‘K042’ draft genome sequences

3 討論

利用分子生物學(xué)數(shù)據(jù)特別是DNA核苷酸序列，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，為物種的鑒定提供有力證據(jù)。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔子(Internal transcribed spacer，ITS)是植物屬內(nèi)種間分類鑒定的首選[27-28]。ITS序列用于種間分類鑒定的優(yōu)勢為大小合適，用來擴展ITS的引物通用性強，擴增成功率高，便于高通量測序與分析，而且是在GenBank等數(shù)據(jù)庫中存在較多的DNA片段序列。本研究通過PCR擴增K042 的ITS序列，比對序列確認(rèn)了K042 為真實的菊苣材料。

染色體是一個物種的遺傳物質(zhì)的載體[29]，在植物生長發(fā)育過程中具有較高的穩(wěn)定性。因此，染色體數(shù)目是確定一個生物基因組完整性的依據(jù)之一，并且對接下來的基因組重新組裝至關(guān)重要。通過染色體計數(shù)結(jié)果分析表明此次測定的K042 的染色體數(shù)目為 18 條(2n=18)，為二倍體，未發(fā)現(xiàn)染色體倍性水平的變化，且染色體大小不一。葛榮朝等[30-31]通過對普那菊苣的染色體進行核型分析研究表明，普那菊苣的染色體核型組成為：2n=2x=18=18 m。本實驗結(jié)果與葛榮朝等[30]的研究結(jié)果一致。

確定K042 的基本信息后，估計K042 基因組大小，我們采取了流式細胞術(shù)和二代測序技術(shù)這兩種方式，通過兩種方法的結(jié)合，分析和研究菊苣基因組大小和特征，從而提高了實驗的準(zhǔn)確度和可靠性。K042 基因組大小的估計結(jié)果可以作為基因組測序等相關(guān)實驗的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。流式細胞技術(shù)實際研究中不同的樣品、熒光染料試劑、裂解液、樣品內(nèi)標(biāo)和處理流程等[32]因素，以及流式細胞儀自身[33]，均會對最終基因組大小的測算結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究實驗中采取了經(jīng)驗法和統(tǒng)計檢驗法模型,并對結(jié)果加以校正，盡可能消除實驗中各種因素的影響，提高了實驗效率和準(zhǔn)確性，對流式細胞技術(shù)進行了改進，使測量結(jié)果更接近于實際情況，運用兩種方法估計K042 基因組大小，得到K042 基因組初步估算大小為1 170.00 Mb，大小修正為1 424.00 Mb。已知公布的菊科植物中，最小的基因組為紫菀族(Asteraceae)為 335.00 Mb[34],最大的基因組為春黃菊族(Anthemideae)為 138.88 Gb[35]，菊苣的基因組大小符合菊科植物的基因組特征。在K042 基因組分析中，流式細胞技術(shù)的實驗結(jié)果略小于K-mer分析結(jié)果。兩種方法估算的結(jié)果不同在前人報道中均有體現(xiàn)，如甘薯屬的馬鞍藤[36]，車前屬的車前和大車前[37]等。

根據(jù)K-mer分布情況，估算K042 雜合率為1.12%，這一實驗結(jié)果表明菊苣雜合率較高。植物基因組雜合率受繁殖方式的影響，異花授粉植物雜合率高于自花授粉植物[38]，菊苣是異花授粉以及高度不親和的植物[39],因而實驗結(jié)果與特點一致。依據(jù)基因組的基本結(jié)構(gòu)和初步組裝結(jié)果，菊苣基因組比較復(fù)雜，該物種屬于高度重復(fù)、高雜合的復(fù)雜基因組，初步組裝結(jié)果與預(yù)估結(jié)果之間存在差異，且組裝結(jié)果為一堆碎片，組裝結(jié)果不理想，這也反應(yīng)了二代高通量測序技術(shù)的限制。因此，推薦三代長讀測序技術(shù)(如Pac Bio Sequel)和染色質(zhì)區(qū)域捕獲(Chromosome conformation capture，Hi-C)技術(shù)相結(jié)合用來提升第三代高通量測序基因組組裝結(jié)果，完成菊苣基因組的精細組裝[40]。本研究為今后繪制菊苣基因組精細圖譜提供了依據(jù)，也為后續(xù)開展研究菊苣蛋白組、轉(zhuǎn)錄組以及代謝組等研究[41-42]奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過研究K042的基因組大小以及基因組調(diào)查測序發(fā)現(xiàn)，K042跟生菜的親緣關(guān)系較近，細胞內(nèi)染色體數(shù)目為 18 條(2n = 18)。流式細胞技術(shù)結(jié)果顯示，K042 基因組大小預(yù)估為 1 170.00 Mb。通過二代測序和K-mer分析結(jié)果顯示，K042 基因組大小修正為 1 424.00 Mb，同時還得出菊苣的雜合率大約為1.12%，重復(fù)序列約占73.56%，有效測序深度約為25×。本實驗從頭組裝了823.36 Mb的菊苣基因組草圖，序列重疊群N50 長約 1.03 kb。