周學(xué)麗， 馬 坤， 王英成， 趙陽(yáng)安， 祁星民， 土旦加， 史德軍， 蘆光新*， 董世魁

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2.青海省草原改良試驗(yàn)站， 青海 共和 813000； 3.北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，北京 100083)

土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，參與和調(diào)節(jié)一系列關(guān)鍵的養(yǎng)分和物質(zhì)循環(huán)過(guò)程[1-2]，土壤微生物群落組成與多樣性作為表征土壤質(zhì)量和健康的早期指標(biāo)[3]，同時(shí)土壤微生物也有助于植物獲取營(yíng)養(yǎng)，對(duì)維持植物生產(chǎn)至關(guān)重要[4]。微生物作為土壤環(huán)境變化的指示生物，在植物-土壤-微生物相互作用的生態(tài)學(xué)過(guò)程的研究中越來(lái)越受學(xué)者們關(guān)注[5]。

青海湖地區(qū)草地不僅是當(dāng)?shù)啬撩褓?lài)以生存的生產(chǎn)基礎(chǔ)，而且具有多種生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能和重要的生態(tài)安全屏障功能作用。20世紀(jì)50年代以來(lái)，由于草地畜牧業(yè)發(fā)展迅速，區(qū)域人口和家畜數(shù)量快速增長(zhǎng)[6]，長(zhǎng)期超載放牧導(dǎo)致高寒草地生態(tài)系統(tǒng)退化嚴(yán)重[7]，嚴(yán)重制約草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展[8]，典型脆弱的草地生態(tài)系統(tǒng)面臨生態(tài)環(huán)境保護(hù)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的雙重壓力。草地退化引起我國(guó)各級(jí)政府及科學(xué)界的高度重視[9]，針對(duì)青藏高原高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)退化問(wèn)題，國(guó)家出臺(tái)一系列方針政策和開(kāi)展生態(tài)保護(hù)工程[10]，實(shí)施了多項(xiàng)強(qiáng)有力的恢復(fù)措施，包括圍欄封育、草地施肥、鼠害防治以及建植人工草地等，以上措施在青藏高原退化高寒草甸恢復(fù)治理中都取得了一定成效[11]。其中，施肥是草地改良和恢復(fù)的有效的措施之一，研究表明，施用有機(jī)肥對(duì)土壤有機(jī)碳活性組分提高有顯著的促進(jìn)作用[12]。施肥后土壤的氮礦化率提高，植物生長(zhǎng)加快，土壤有機(jī)質(zhì)增加，從而導(dǎo)致生物群落發(fā)生變化[13-14]。近年來(lái)，草地和牧草施肥方面的研究及推廣應(yīng)用發(fā)展較為迅速，有關(guān)施肥對(duì)牧草產(chǎn)量的影響報(bào)道很多，主要集中在化學(xué)肥料的種類(lèi)的選擇、營(yíng)養(yǎng)成分的配比等對(duì)草地群落結(jié)構(gòu)及牧草產(chǎn)量的影響方面[15-20]，但在生產(chǎn)實(shí)踐中，施用化學(xué)肥料勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致成本增加，并且會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染問(wèn)題，不利于高寒草地的生態(tài)環(huán)境保護(hù)[21-22]。鑒于青海省高寒草地生態(tài)保護(hù)價(jià)值，探索施用有機(jī)肥對(duì)退化草地改良以及保護(hù)好青海這片凈土的生態(tài)環(huán)境、實(shí)現(xiàn)農(nóng)牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有十分重要的意義[23]。

迄今為止，通過(guò)植被特征或土壤理化性質(zhì)來(lái)反映施肥對(duì)草地改良的作用的報(bào)道較多[24-26]，也有通過(guò)植被-土壤系統(tǒng)的綜合效應(yīng)來(lái)表征施肥效應(yīng)的研究[27-30]，課題組前期在高寒草地開(kāi)展進(jìn)行了有機(jī)肥對(duì)草地植物和土壤影響的相關(guān)研究[31-33]，但有機(jī)肥對(duì)退化草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響知之甚少。本文采用高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)分析16S rRNA和ITS-rDNA基因序列信息，研究環(huán)青海湖地區(qū)草地土壤微生物群落及多樣性對(duì)有機(jī)肥的響應(yīng)特征，明確有機(jī)肥對(duì)土壤微生物區(qū)系的影響，旨在從土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性角度評(píng)價(jià)施用有機(jī)肥對(duì)退化草地的改良效果，為該區(qū)或同類(lèi)地區(qū)草地改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于青海省草原改良試驗(yàn)站的天然草地試驗(yàn)區(qū)(37°03′43.0″N，99°34′00.6″E，海拔3 270 m)，年平均氣溫-0.7℃，絕對(duì)無(wú)霜期為20 d。年平均降水量為368.11 mm，相對(duì)濕度58%，年蒸發(fā)量1 495.3 mm，土壤為暗栗鈣土，是以紫花針茅為主的高寒草原。樣地于2015年封育，主要植物種類(lèi)有：紫花針茅(StipapurpureaGriseb)、冷地早熟禾(P.crymophilaKeng)、線(xiàn)葉嵩草(Kobresiacapillifolia)、豬毛蒿(Artemisiascoparia)、肉果草(Lanceatibetica)、冷蒿(Artemisiafrigida)、青藏苔草(Carexmoorcroftii)、賴(lài)草(Leymussecalinus)、溚草(Koeleriacristata)、異葉青蘭(DracocephalumheterophyllumBenth)、阿爾泰狗哇花(Heteropappusaltaicus)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、多枝黃芪(Astragaluspolycladus)、濕生扁蕾(Gentianopsispaludosa(Mun.)Ma.)、狼毒(Stellerachamaejasme)。2020年8月份進(jìn)行草地植物群落結(jié)構(gòu)調(diào)查，樣地植物群落基本特征見(jiàn)表1。依據(jù)馬玉壽等[34]草地退化等級(jí)劃分，樣地的退化程度介于輕度和中度之間。

表1 樣地植物群落基本特征Table 1 Basic characteristics of plant communities in the sample sites

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2020年6月，選擇地勢(shì)平坦，試驗(yàn)條件一致的區(qū)域，分為2塊50 m × 50 m樣區(qū)，試驗(yàn)分施有機(jī)肥與不施有機(jī)肥2個(gè)處理，施有機(jī)肥用F表示，不施有機(jī)肥用CK表示，每處理5個(gè)重復(fù)，分別標(biāo)記為F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5和CK1，CK2，CK3，CK4，CK5。施肥量為800 kg·hm-2(有機(jī)質(zhì)含量>45%，N+P2O5+K2O>5%)(有機(jī)肥購(gòu)自四川省成都市蒲江縣綠地秸稈科技有限公司)，人工均勻撒施。兩個(gè)樣區(qū)間有1.5 m的緩沖帶，緩沖帶上不做任何處理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)布置圖見(jiàn)圖1。在試驗(yàn)處理之前采集土壤樣品，測(cè)定土壤理化性質(zhì)(見(jiàn)表2)。

圖1 試驗(yàn)布置圖Fig.1 Layout of test plots

表2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定Table2 Determination of soil physical and chemical properties

1.3 研究方法

1.3.1土壤樣品采集 2021年8月，分別在2樣區(qū)內(nèi)按對(duì)角線(xiàn)取樣法設(shè)置5個(gè)1 m × 1 m樣方，2個(gè)樣區(qū)共有樣方10個(gè)。在每個(gè)樣方內(nèi)進(jìn)行植物群落結(jié)構(gòu)調(diào)查及土壤樣品采集。在取過(guò)地上生物量的樣方內(nèi)將土壤表層的殘留物和雜質(zhì)清理干凈，然后用7.5 cm直徑土鉆隨機(jī)按0～20 cm鉆取5鉆混合后裝入已滅菌的自封袋中，獲得10個(gè)土壤樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室，過(guò)40目土篩并剔除所有雜質(zhì)。一份風(fēng)干后用于測(cè)定理化性質(zhì)，另一份保存在-80℃，用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

1.3.2土壤理化性質(zhì)測(cè)定 測(cè)定的土壤指標(biāo)有：總氮、有機(jī)質(zhì)、硝氮、氨氮含量。具體測(cè)定方法參照鮑士旦的《土壤農(nóng)化分析》中的相關(guān)測(cè)定方法[35]。

1.3.3土壤微生物DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序 參照Wang等[36]的方法，采用土壤DNA提取試劑盒(MOBIO Laboratories，Carlsbad，CA,美國(guó))提取土壤微生物總DNA。采用NanoDrop-ND1000 測(cè)定DNA濃度，并經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA樣品質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，合格后用于構(gòu)建文庫(kù)；以土壤樣品微生物總DNA為模板，分別用16SrDNA V4區(qū)(515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R:5′ ical propertieserties)；ITS2區(qū)5.8F，5′-AACTTTYRRCAAYGG-ATCWCT-3′和4R，5′-AGCCTCCGCTTATTGATATGCTTAART-3′且?guī)в?0 bp長(zhǎng)的barcode序列的特異引物為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用KAPA HyperPrep Kit DNA文庫(kù)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。在Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(深圳，美格基因)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

將所有原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式以及樣本對(duì)應(yīng)的Barcode信息上傳到中科院環(huán)境所鄧曄老師課題組的Galaxy分析平臺(tái)上(http://mem.rcees.ac.cn:8080)進(jìn)行分析。測(cè)序數(shù)據(jù)采用Btrim和FLASH進(jìn)行過(guò)濾優(yōu)化和雙端序列連接，優(yōu)質(zhì)序列利用UPARSE基于97%的相似水平進(jìn)行OTU(Operational taxonomic units)聚類(lèi)，并且通過(guò)RDP分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU表進(jìn)行注釋[37]。基于OTU豐度信息，利用R語(yǔ)言工具制作Venn圖和群落柱形圖，利用Mothur軟件計(jì)算微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性用物種豐富度(Richness)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、以及Pielou均勻度指數(shù)表示，采用PCA法對(duì)不同施肥處理和對(duì)照中土壤微生物群落的差異進(jìn)行研究分析；通過(guò)Anosim，MRPP以及PERMANOVA三種方法進(jìn)行相異性檢驗(yàn)(Dissimilarity test)。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用有機(jī)肥后土壤微生物類(lèi)群及群落分布特征

2.1.1土壤微生物類(lèi)群分析 施肥處理和CK的共10個(gè)土壤樣本測(cè)序后經(jīng)初步質(zhì)控檢測(cè)得到土壤細(xì)菌8 714 371條序列，真菌檢測(cè)到5 933 081條序列，在97%的相似性水平下，所有10個(gè)樣本得到細(xì)菌群落共28 376個(gè)OTU(Operational taxonomic unit)，8 493種真菌OTU。施肥處理下土壤中的細(xì)菌的OTUs有14 509個(gè)，真菌的OTUs有4 183個(gè)，與CK相比，施用有機(jī)肥增加了細(xì)菌群落的OTU，降低了真菌群落的OTU。

2.1.2土壤微生物群落組成及相對(duì)豐度的變化 對(duì)施肥和CK中土壤細(xì)菌和真菌的群落組成及相對(duì)豐度進(jìn)行了分析(圖3)，結(jié)果表明：施肥處理和CK土壤中，相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌門(mén)分別為：放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、未分類(lèi)菌、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、candidate division WPS-1疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)等；主要的真菌門(mén)分別為子囊菌門(mén)(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、還有一些未分類(lèi)菌。由此可見(jiàn)，在門(mén)水平上，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要為放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)，三者相對(duì)豐度之和達(dá)87.3%～87.7%；優(yōu)勢(shì)真菌為子囊菌門(mén)(Ascomycota)，相對(duì)豐度達(dá)92.1%～95.3%。與CK相比，有機(jī)肥處理后變形菌門(mén)(Proteobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、未分類(lèi)菌、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes) 的相對(duì)豐度較CK均有所增加，但放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes) 的相對(duì)豐度有所下降；子囊菌門(mén)(Ascomycota)和壺菌門(mén)(Chytridiomycota)的相對(duì)豐度降低，但擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和未分類(lèi)菌的相對(duì)豐度增加。由圖3可知，在屬水平上細(xì)菌群落的組成占比較大的種類(lèi)除未分類(lèi)(Unclassified)的種類(lèi)外，還有Gaiella，Gp6、粘紅桿菌屬(Solirubrobacter)、Gp16，Gp4、亞硝化球菌屬(Nitrososphaera)。其中，Gaiella在施肥處理時(shí)豐度最高，達(dá)到了10.39%；Gp6、粘紅桿菌屬(Solirubrobacter)以及Gp16在其中的豐度相對(duì)穩(wěn)定，平均豐度分別是4.23%，5.10%和3.93%。并且Gp6在施肥處理中豐度達(dá)到5.7%，粘紅桿菌屬(Solirubrobacter)在CK處理中含量占6.99%。Gp16在施肥處理中豐度占5.36%。

圖3 土壤中細(xì)菌群落(A)和真菌群落(B)門(mén)水平組成分析,細(xì)菌群落(C)和真菌群落(D)屬水平組成分析Fig.3 Analysis of the composition of bacterial community (A) and fungal community (B) phylum level,bacterial community (C) and fungal community (D) genus level in soil

真菌群落組成中，排在前五位的屬有未分類(lèi)(Unclassified)、Preussia、赤霉菌屬(Gibberella)、擬桿菌屬(Pseudeurotium)、炭疽病菌(Atradidymella)、粉孢菌屬(Podospora)。Preussia在施肥處理后含量反而有所下降，施肥處理后Preussia菌屬下降了21.54%，而赤霉菌屬(Gibberella)在施肥處理后明顯增加。擬桿菌屬(Pseudeurotium)影響變化不大，平均豐度在5.69%。

2.1.3土壤微生物群落分布特征的影響 采用Bray距離對(duì)草地土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分(PCA)分析，如圖4所示，施肥處理草地土壤的樣品和對(duì)照樣品在主坐標(biāo)分析圖上相對(duì)分離，說(shuō)明施肥改變了土壤細(xì)菌群落和真菌群落的結(jié)構(gòu)。對(duì)于細(xì)菌群落來(lái)說(shuō)PCA1對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的解釋率為20.36%，PCA2的解釋率為14.84%，兩軸解釋率總和為35.2%(圖4A)。在施有機(jī)肥和對(duì)照土壤中，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，表明施有機(jī)肥顯著改變了草地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。對(duì)于真菌群落PCA1對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異的解釋率為20.83%，PCA2的解釋率為16.49%，兩軸解釋率總和為37.32%(圖4B)。在施有機(jī)肥和對(duì)照土壤中，真菌群落結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，表明施肥改變了草地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。不相似性檢驗(yàn)分析進(jìn)一步表明施用有機(jī)肥顯著改變了細(xì)菌群落和真菌群落結(jié)構(gòu)(表3)。

圖4 土壤細(xì)菌群落A和真菌群落B的PCA分析Fig.4 Principal coordinate analysis of bacterial community (A) and fungal community (B) in natural grassland soil

表3 天然草地不同處理間微生物的不相似性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of dissimilarity test of microorganisms among different treatments of natural grassland

2.2 施用有機(jī)肥后土壤微生物多樣性分析

細(xì)菌群落的樣品文庫(kù)覆蓋率為96.3%～96.6%，真菌群落的樣品文庫(kù)覆蓋率為97.7%～99.9%，表明制備文庫(kù)覆蓋了施肥處理土壤樣品中96.3%以上的細(xì)菌和真菌類(lèi)群，庫(kù)存容量足夠反映樣品中微生物的真實(shí)組成。

如圖5所示，對(duì)施肥處理與對(duì)照中土壤細(xì)菌和真菌的Richness指數(shù)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，施有機(jī)肥增加了土壤細(xì)菌群落的Richness指數(shù)，但降低了真菌群落的Richness指數(shù)；對(duì)施肥處理與對(duì)照中土壤細(xì)菌和真菌的Chao1指數(shù)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，施肥處理降低了細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)，但增加了真菌群落的Chao1指數(shù)。有機(jī)肥處理下細(xì)菌和真菌群落的Simpson，invsimpson指數(shù)均出現(xiàn)下降趨勢(shì),細(xì)菌和真菌的ACE指數(shù)均出現(xiàn)上升趨勢(shì)。對(duì)施肥和對(duì)照中微生物Shannon和Pielou指數(shù)分析結(jié)果顯示，有機(jī)肥降低了細(xì)菌和真菌群落的Shannon和Pielou指數(shù)，表明施用有機(jī)肥對(duì)細(xì)菌和真菌兩大類(lèi)群的影響不同。施有機(jī)肥能夠增加細(xì)菌的豐富度，但減少了多樣性和均勻度。而對(duì)真菌而言，施肥處理后豐富度、多樣性和均勻度都有所降低。

圖5 土壤微生物α多樣性Fig.5 Diversity of soil microorganism

2.3 施用有機(jī)肥后指示微生物類(lèi)群分析

為了進(jìn)一步研究施肥對(duì)土壤細(xì)菌與真菌群落的影響，采用LEfse(LDA effect size)分析了施肥處理與對(duì)照中土壤的指示微生物。如(圖6A)所示，施肥土壤的細(xì)菌指示物種為Gammaproteobacteria，對(duì)照土壤的細(xì)菌指示物種是Actinomarinicota。施肥土壤的真菌指示物種是Dothideomycetes，對(duì)照土壤的真菌指示物種是Helotiaceae(圖6B)。

圖6 施肥草地土壤微生物群落的線(xiàn)性判別分析Fig.6 Linear discriminant analysis of microbial community fertilization in natural grassland soil.

3 討論

草地生態(tài)系統(tǒng)是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，高寒地區(qū)的草地退化主要表現(xiàn)為草地沙化、出現(xiàn)黑土灘或草地鹽堿化[38]。草地退化和改良過(guò)程中土壤養(yǎng)分的富集和虧缺，將對(duì)植物生產(chǎn)力和微生物群落產(chǎn)生實(shí)質(zhì)影響。為進(jìn)一步明確有機(jī)肥對(duì)高寒地區(qū)草地土壤微生物群落和多樣性的影響，本文對(duì)比分析了施有機(jī)肥處理與對(duì)照之間土壤微生物類(lèi)群、群落組成、多樣性以及關(guān)鍵物種進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)肥后的第二年土壤微生物多樣性和群落組成發(fā)生了變化，細(xì)菌和真菌兩大類(lèi)群對(duì)施用有機(jī)肥的響應(yīng)表現(xiàn)出了差異，這與其微生物類(lèi)群的生物學(xué)特性有關(guān)。即：施用有機(jī)肥增加了土壤有機(jī)質(zhì)含量，更利于細(xì)菌的生存。而在草地土壤中，大部分真菌可以將大分子有機(jī)物分解成小分子的化合物，供菌體吸收和利用，推動(dòng)土壤養(yǎng)分的循環(huán)，維持和完成正常的生命活動(dòng)[39]。另外，微生物的功能和特征隨其棲息的草地土壤環(huán)境的溫度、濕度、土壤養(yǎng)分以及分布的植物種類(lèi)也發(fā)生變化[40-41]。

通過(guò)有機(jī)肥對(duì)微生物群落多樣性的影響分析發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥處理增加土壤細(xì)菌群落的豐富度，而降低了土壤真菌群落的豐富度，相關(guān)細(xì)菌群落變化規(guī)律與多數(shù)研究結(jié)果一致[42-43]。對(duì)微生物群落組成而言，施有機(jī)肥改變了土壤細(xì)菌群落和真菌群落的結(jié)構(gòu)，指示物種也發(fā)生了變化，施肥對(duì)土壤細(xì)菌與真菌群落結(jié)構(gòu)變化有顯著的影響，這說(shuō)明施用有機(jī)肥后草地土壤環(huán)境發(fā)生了變化，并且對(duì)地上植物部分從物種、功能群以及群落水平上都發(fā)生了結(jié)構(gòu)性變化[44]，土壤微生物群落的這些變化可能與植被特征和土壤理化性質(zhì)的改變有關(guān)[45]。

4 結(jié)論

青藏高原環(huán)青海湖地區(qū)施用有機(jī)肥第二年，土壤細(xì)菌的OTUs增加，真菌的OTUs降低；并且改變了土壤細(xì)菌與真菌群落組成及相對(duì)豐度；有機(jī)肥添加能增加土壤細(xì)菌群落的Richness指數(shù)，降低了真菌群落的Richness指數(shù)，同時(shí)降低細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)，增加真菌群落的Chao1指數(shù)，細(xì)菌和真菌群落的Shannon和Pielou指數(shù)均明顯降低；施肥處理后土壤細(xì)菌和真菌的指示物種也發(fā)生了變化。