蔡 馨，劉澤毅，黃建安

215006 江蘇 蘇州，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，蘇州大學(xué)呼吸疾病研究所

肺癌在全世界范圍內(nèi)是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的最主要病因，2020年全世界約有180萬人死于肺癌[1]。根據(jù)臨床組織病理分型，肺癌患者中約85%被診斷為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)[2]。近年來，肺癌的診療工作獲得了長足的進(jìn)步，靶向治療和免疫治療的應(yīng)用顯著提高了晚期NSCLC的治療效果，但NSCLC患者總體的生存及預(yù)后仍未見明顯改善，最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示肺癌患者的預(yù)計5年生存率僅21%[3-4]。因此，進(jìn)一步尋找影響NSCLC增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子并探究其分子機(jī)制對于尋找新的藥物靶點、提高療效和改善患者預(yù)后都有十分重要的作用。

CPNE3是鈣依賴性的膜結(jié)合蛋白家族——Copines中的一員，在各種組織和器官中普遍表達(dá)。結(jié)構(gòu)上，CPNE3在其N-端包含兩個串聯(lián)C2結(jié)構(gòu)域，作為鈣依賴性磷脂結(jié)合基序，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)或膜泡運輸；在其C-端包含的A結(jié)構(gòu)域發(fā)揮蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的作用[5]。從作用機(jī)制來講，CPNE3表現(xiàn)出激酶活性，可以磷酸化H1組蛋白和堿性磷脂蛋白，激活下游信號通路，從而發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。CPNE3在多種癌癥中發(fā)揮的作用已被證實，但CPNE3在NSCLC中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。因此，本研究旨在通過體外細(xì)胞實驗和體內(nèi)動物實驗兩個方面探索CPNE3在NSCLC中發(fā)揮的作用及其具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientific公司)；CPNE3干擾序列(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；CCK-8試劑(碧云天公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hy-clone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；結(jié)晶紫染液(上海生工公司)；CPNE3、β-actin抗體(Proteintech公司)、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、p-EGFR、EGFR抗體(CST公司)；山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；空白對照和過表達(dá)CPNE3慢病毒(上海吉凱公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌細(xì)胞株(A549、H1299、H460、H520)和正常支氣管上皮細(xì)胞株(BEAS-2B)均從上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買。細(xì)胞均在含有10%FBS和1%雙抗(100 U/mL青-鏈霉素)的RPMI-1640的完全培養(yǎng)基中、37 ℃、5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)。

1.3 瞬時轉(zhuǎn)染

將A549細(xì)胞接種在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到40%～60%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48～72 h后，收集細(xì)胞用于進(jìn)一步實驗。CPNE3的干擾序列如下：si-CPNE3-1 siRNA：5′-GGG-ACUGGUCAUUCAAGAUTT-3′； si-CPNE3-2 siRNA：5′-GCAAUGGAAUCCAAGGCAUTT-3′。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞實驗

將A549細(xì)胞以每孔3×103個細(xì)胞的密度接種在96孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，分別在鋪板后24、48、72 h加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，然后用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞在450、630 nm的吸光度(OD值)。

1.5 克隆形成實驗

將A549細(xì)胞以1×103/mL的密度接種于小皿中，搖勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5～7 d后顯微鏡下觀察，待每個細(xì)胞克隆含有約10～15個細(xì)胞數(shù)時，取出培養(yǎng)皿，PBS洗滌后甲醇固定30 min，再用結(jié)晶紫染色2 h，使用相機(jī)拍照并計數(shù)。

1.6 Transwell實驗

將A549細(xì)胞接種在6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h，待細(xì)胞密度達(dá)到90%，消化細(xì)胞并使用含1% FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。向基質(zhì)膠包被的小室上室中加入200 μL含6×104細(xì)胞的細(xì)胞懸液，向無基質(zhì)膠的小室上室加入200 μL含3×104細(xì)胞的細(xì)胞懸液，下室均加入800 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS洗滌后甲醇固定30 min，再用結(jié)晶紫染色2 h，用棉棒輕輕擦去上室表面細(xì)胞，于顯微鏡下觀察拍照并計數(shù)。

1.7 Western blot實驗

在A549細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染干擾序列后，使用RIPA法提取細(xì)胞總蛋白。以每孔50 μg蛋白樣品量加樣，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，4 ℃過夜孵育一抗，次日TBST洗4次，每次5 min，室溫孵育二抗2 h，TBST洗4次，每次5 min，顯影液孵育數(shù)秒后，使用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測蛋白表達(dá)。

1.8 動物模型實驗

選用4～6周齡，體質(zhì)量16～20 g的雌性BALB/c nude小鼠10只(由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，批號：0051246)。在A549細(xì)胞中使用慢病毒侵染細(xì)胞構(gòu)建CPNE3的過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。培養(yǎng)對照組和CPNE3過表達(dá)細(xì)胞株，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時消化，離心后使用無血清的培養(yǎng)基重懸。計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/50 μL，取等體積的基質(zhì)膠混合，隨后迅速置于冰上備用。在無菌條件下吹打細(xì)胞混勻，隨后用1 mL胰島素注射器分別吸取100 μL細(xì)胞混懸液接種于裸鼠的兩側(cè)肋下，使其成為一皮丘，5～7 d后待皮丘消退，觀察小鼠成瘤情況。密切記錄成瘤時間，以后每隔2天使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑和短徑值，按照計算公式：V(mm3)=a×b2/2計算體積，其中a為長徑，b為短徑。同時觀察裸鼠體質(zhì)量及生長狀態(tài)等。待腫瘤體積達(dá)800 mm3時處死裸鼠，取裸鼠皮下瘤體拍照、稱重，并研磨組織蛋白，Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平。

1.9 生物信息學(xué)分析

從癌癥和腫瘤基因圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(https：//portal.gdc.com)獲得NSCLC組織的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床信息，并與配對癌旁組織的RNA-seq數(shù)據(jù)對比，得到配對差異分析結(jié)果，使用Rstudio軟件v4.0.3進(jìn)行統(tǒng)計分析，P值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。Kaplan-Meier生存分析比較上述兩組或多組之間的生存差異。對于Kaplan-Meier曲線，P值和具有95%CI的風(fēng)險比(hazard ratio,HR)通過logrank檢驗和單變量Cox回歸得出。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中CPNE3高表達(dá)并與患者的不良預(yù)后相關(guān)

基于來自TCGA數(shù)據(jù)庫獲得的NSCLC組織的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床信息進(jìn)行生信分析，結(jié)果顯示，與配對癌旁組織相比，CPNE3在NSCLC組織中表達(dá)水平顯著升高(P=0.024，圖1A)，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)(HR=2.198 7，P=0.001 2，圖1B)。

2.2 NSCLC細(xì)胞株中CPNE3表達(dá)升高

通過Western blot檢測CPNE3在正常支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B和NSCLC細(xì)胞株A549、H1299、H460和H520中的表達(dá)水平(圖2)。與正常支氣管上皮細(xì)胞相比，CPNE3在NSCLC細(xì)胞的表達(dá)顯著升高。選取表達(dá)量中等的A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

A：TCGA數(shù)據(jù)庫分析配對的106對癌/癌旁組織中CPNE3的mRNA表達(dá)情況(n=106)；B：TCGA數(shù)據(jù)庫中CPNE3表達(dá)情況與NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)性

2.3 干擾CPNE3抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

在A549細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染干擾序列，Western blot檢測CPNE3蛋白水平顯著降低(圖3A)，通過CCK-8實驗和克隆形成檢測發(fā)現(xiàn)，與si-NC組相比，si-CPNE3-1和si-CPNE3-2組A549細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.001，P<0.001，圖3B、C)。Transwell實驗表明si-CPNE3-1組和si-CPNE3-2組的細(xì)胞較si-NC組相比，遷移和侵襲能力亦顯著降低(P<0.001，P<0.01，圖3D)。

a：P<0.001，b：P<0.01，與BEAS-2B比較

A：Western blot檢測CPNE3干擾后蛋白水平；B：CCK-8法檢測干擾CPNE3后細(xì)胞的增殖能力a：P<0.001，與si-NC組比較；C：克隆形成實驗檢測干擾CPNE3后細(xì)胞的增殖能力 a：P<0.01，與si-NC組比較；D：Transwell實驗檢測干擾CPNE3后細(xì)胞的遷移和侵襲能力 a：P<0.001，b：P<0.01，與si-NC組比較

A：Western blot檢測A549細(xì)胞干擾CPNE3后各組之間CPNE3和下游蛋白的表達(dá)和定量結(jié)果 a：P<0.001，與si-NC組比較；B：Western blot檢測EGFR磷酸化水平及其下游相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)和定量結(jié)果 a：P<0.001，與si-NC EGF(+)組比較；b：P<0.01，與si-NC EGF(+)組比較

2.4 CPNE3對AKT/ERK和EGFR信號通路的影響

在A549細(xì)胞中干擾CPNE3后，通過Western blot檢測增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白標(biāo)志物的表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-CPNE3組AKT、ERK和EGFR的磷酸化水平顯著下降，而總AKT、ERK和EGFR的表達(dá)并沒有顯著變化(圖4A)。為了進(jìn)一步驗證CPNE3和EGFR信號通路的關(guān)系，在CPNE3干擾組加入外源性EGF(50 ng/mL)刺激，30 min后提取總蛋白。Western blot結(jié)果顯示，與si-NC EGF(+)組相比，干擾CPNE3后，外源加入EGF所誘導(dǎo)的EGFR磷酸化及其下游相關(guān)信號通路的激活被抑制(圖4B)。證明干擾CPNE3后可以通過EGFR信號通路抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

2.5 過表達(dá)CPNE3在體內(nèi)增強(qiáng)A549細(xì)胞的增殖能力

通過構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，觀察皮下移植瘤生長速度、腫瘤重量，發(fā)現(xiàn)與NC組相比，過表達(dá)CPNE3組的瘤體生長速度明顯更快，瘤體重量也高于NC組(圖5A～C)。通過Western blot檢測瘤體組織的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CPNE3組AKT、ERK和EGFR的磷酸化水平顯著上升(圖5D)。證明過表達(dá)CPNE3可以增強(qiáng)A549細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力，這與EGFR信號通路的激活相關(guān)。

3 討論

本研究首先通過TCGA數(shù)據(jù)庫生信分析發(fā)現(xiàn)：CPNE3在NSCLC組織中表達(dá)明顯升高，并且其高表達(dá)與NSCLC患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，提示CPNE3可能作為癌基因在NSCLC中發(fā)揮促癌作用，并可能對患者的預(yù)后有一定指導(dǎo)意義。隨后通過一系列體外表型實驗和體內(nèi)動物實驗進(jìn)行研究探索，發(fā)現(xiàn)干擾CPNE3可以抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，伴隨著AKT/ERK、EGFR的磷酸化水平的下降；提示CPNE3通過影響EGFR及其下游信號通路發(fā)揮作用。體內(nèi)動物實驗進(jìn)一步證實了過表達(dá)CPNE3可以在裸鼠體內(nèi)促進(jìn)移植瘤的生長。以上結(jié)果證實了CPNE3這一膜結(jié)合蛋白家族成員，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有潛力成為全新的治療靶點或者評估患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

Copines是一個鈣依賴性的膜結(jié)合蛋白家族，在真核生物中普遍存在，具有高度保守、可溶性的特點。目前已確定該家族中有九個成員，越來越多的證據(jù)表明，Copines家族成員參與了多種癌癥的發(fā)生和進(jìn)展[7]。

a：P<0.001，與NC組比較；b：P<0.001，與NC組比較；c：P<0.05，與NC組比較；d：P<0.05，與NC組比較；e：P<0.05，與NC組比較；f：P<0.01，與NC組比較

在本文中重點研究的CPNE3是該家族中的一員，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用得到越來越多的關(guān)注。已有文獻(xiàn)報道，在乳腺癌中，CPNE3可以通過激活ErbB2蛋白誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition， EMT)，繼而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移[8]。在結(jié)直腸癌中，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)外泌體中CPNE3水平較低的結(jié)直腸癌患者的無病生存期和總生存期明顯更好，提示CPNE3可能作為診斷和評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物[9]。在肝細(xì)胞癌中，有研究證實敲低CPNE3的表達(dá)會增強(qiáng)肝細(xì)胞癌細(xì)胞對分子靶向藥物索拉非尼的敏感性[10]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，研究表明CPNE3可以通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[11]。在NSCLC中，CPNE3可以與RACK1相互作用并激活黏著斑激酶(focal adhesion kinase， FAK)信號通路，促進(jìn)NSCLC的增殖和轉(zhuǎn)移[12]。

CPNE3在多種癌癥中發(fā)揮的促癌作用提示其可能與重要腫瘤相關(guān)信號通路存在潛在聯(lián)系，其機(jī)制亟需進(jìn)一步探索，為腫瘤靶向治療的臨床實踐提供新的線索。