祝夢(mèng)曉，胡 晨，何 勇

400042 重慶，陸軍特色醫(yī)學(xué)中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

肺癌是目前致死率最高的惡性腫瘤，5年生存率僅10%～20%[1]。肺癌靶向治療顯著延長(zhǎng)了晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的生存周期并改善其生活質(zhì)量，為肺癌患者帶來(lái)了新的治療希望[2]。目前最為常見(jiàn)的肺癌驅(qū)動(dòng)基因是表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變以及間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因融合[3-4]。針對(duì)鼠類(lèi)肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)突變開(kāi)發(fā)的靶向藥物也在臨床研究中有較好的表現(xiàn)[5]。

血清腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的診斷、病理類(lèi)型及原發(fā)灶的判定上發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)其治療過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化也可用于療效及預(yù)后的判斷。既往研究表明，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、糖類(lèi)抗原125(carbohydrate antigen 125，CA-125)、細(xì)胞角蛋白19的可溶性片段(cytokeratin fragment 19，CYFRA21-1)等腫瘤標(biāo)志物存在于正常細(xì)胞中，但在腫瘤細(xì)胞中合成和分泌量明顯增加[6]。既往研究表明血清腫瘤標(biāo)志物可用于預(yù)測(cè)肺癌靶向治療療效[7]。與此同時(shí)，有研究指出血清腫瘤標(biāo)志物水平與肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變率存在相關(guān)性，但也有研究得出相反結(jié)論[8-10]。因此，血清腫瘤標(biāo)志物與肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變發(fā)生率是否存在相關(guān)性尚待進(jìn)一步研究。本研究基于陸軍特色醫(yī)學(xué)中心大樣本回顧性臨床研究資料，進(jìn)一步分析肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變率與血清腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性，并探討其內(nèi)在的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究采用橫斷面研究設(shè)計(jì)[11]，通過(guò)PASS 15.0.5計(jì)算樣本量，根據(jù)已有研究EGFR在NSCLC中的突變率占比50.09%，CEA診斷EGFR檢出率的受試者工作特征曲線(xiàn)(receiver operating characteristic curve，ROC)下面積(area under the curve，AUC)為0.715[10]，使用雙側(cè)z檢驗(yàn)，設(shè)定把握度為0.9，在顯著性水平0.050處，樣本量估算結(jié)果為至少需要70例患者，其中基因突變NSCLC患者35例，非基因突變NSCLC患者35例?；仡櫺约{入2015年12月至2021年3月來(lái)自陸軍特色醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行組織活檢明確為原發(fā)性肺癌并行基因檢測(cè)的患者，包含呼吸科、腫瘤科、胸外科的住院及門(mén)診患者，共計(jì)1 261例。入組標(biāo)準(zhǔn)如下：病理學(xué)符合NSCLC的診斷；未經(jīng)治療的初診患者；在病理活檢前后1周內(nèi)進(jìn)行血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，至少有CEA檢測(cè)結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：病理學(xué)診斷為混有小細(xì)胞肺癌成分的混合性NSCLC；患者臨床信息不完整。最終共納入1 008例患者進(jìn)入下一步分析。

1.2 研究方法

通過(guò)醫(yī)院病歷系統(tǒng)收集納入1 008例患者的性別、年齡、吸煙史，參照第八版肺癌TNM分型確定臨床分期。記錄患者的年齡、性別、吸煙史、TNM分期、病理類(lèi)型、基因突變類(lèi)型以及腫瘤標(biāo)志物結(jié)果。首先根據(jù)不同的基因突變類(lèi)型進(jìn)行分組(包含EGFR各種突變亞型)，分析突變型與野生型患者在臨床特征及各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的差異。其次，通過(guò)中位數(shù)比較不同基因突變型與野生型患者在腫瘤標(biāo)志物水平上的差異。根據(jù)腫瘤標(biāo)志物水平進(jìn)行連續(xù)分組，分析不同腫瘤標(biāo)志物升高水平組中基因突變患者占比差異。同時(shí)，通過(guò)分期進(jìn)行亞組分析上述差異性。最后采用ROC曲線(xiàn)分析不同因素對(duì)EGFR突變率的影響。根據(jù)國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)第八版肺癌TNM分期，將患者分為早期可手術(shù)組(Ⅰ～ⅢA期)及晚期不可手術(shù)組(ⅢB～Ⅵ期)，分析兩組患者腫瘤標(biāo)志物和基因突變相關(guān)性的差異。

本研究經(jīng)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020第117號(hào))。

1.3 基因檢測(cè)

經(jīng)皮穿刺、支氣管鏡或胸腔鏡獲取原發(fā)腫瘤組織標(biāo)本。采用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)按生產(chǎn)廠家說(shuō)明書(shū)提取腫瘤組織DNA。用Qubit dsDNA檢測(cè)技術(shù)(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)測(cè)定腫瘤組織的DNA濃度。聚合酶鏈反應(yīng)用ABI7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行，通過(guò)采用擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)(ARMS)和肺癌驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)試劑盒(廈門(mén)艾德生物技術(shù)有限公司提供)進(jìn)行檢測(cè)標(biāo)本是否存在驅(qū)動(dòng)基因突變。用于定性檢測(cè)NSCLC患者EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因變異。

1.4 血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)

在組織活檢的前后1周內(nèi)晨采空腹靜脈血3 mL，血液采集均在治療前進(jìn)行。離心機(jī)4 000 r/min高速分離血清15 min。嚴(yán)格按照電化學(xué)發(fā)光分析儀和試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用相同的電化學(xué)發(fā)光免疫法對(duì)血清腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。正常血清腫瘤標(biāo)志物參考范圍：CEA 0～5.0 ng/mL、NSE 0～16.3 ng/mL、CYFRA21-1 0～3.3 ng/mL、CA-125 0～35 U/mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

本研究使用SPSS 20.0版本對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用夏皮羅-威爾克檢驗(yàn)(shapiro-wilk test)評(píng)估正態(tài)性，結(jié)果顯示各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物均為偏態(tài)數(shù)據(jù)(P<0.001)，因此對(duì)腫瘤標(biāo)志物采用M(P25，P75)描述。對(duì)連續(xù)非正態(tài)分布的變量使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。分類(lèi)變量采用皮爾森χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。通過(guò)斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)來(lái)評(píng)估兩個(gè)非正態(tài)分布連續(xù)變量之間的相關(guān)性。采用ROC曲線(xiàn)分析，采用Delong法計(jì)算AUC的標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)(cochran-armitage trend test)分析組間是否存在線(xiàn)性趨勢(shì)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 一般資料及基因突變分布

納入患者中位年齡58歲(年齡范圍35～76歲)，男性占66.8%(674/1 008)，女性占33.2%(334/1 008)。包含了217例Ⅰ～ⅢA期患者，以及791例ⅢB～Ⅵ期患者。病理類(lèi)型以腺癌(807例)為主，鱗癌139例，其他類(lèi)型62例(包含31例非小細(xì)胞癌，12例腺鱗癌，7例大細(xì)胞癌，6例肉瘤樣癌，5例低分化癌，1例SMRCA4缺失型癌)。吸煙或既往吸煙患者共661例，非吸煙患者共347例。

本組病例中，驅(qū)動(dòng)基因的檢出率為64.5%(651/1 008)，最常見(jiàn)的驅(qū)動(dòng)基因突變是EGFR突變(44.1%，424/1 008)，其次是為KRAS突變(10.4%，105/1 008)，ALK融合突變共檢出54例(5.4%)。EGFRL858R突變是最常見(jiàn)的突變亞型，占EGFR突變患者的47.2%，占總突變?nèi)巳旱?1%。EGFR19del突變亞型占EGFR突變患者的44.8%，占總突變?nèi)巳旱?9%。非經(jīng)典EGFR突變共34例，包括22例EGFR20插入突變、9例EGFRL861Q突變、3例EGFR19del/L858R復(fù)合突變(圖1)。在無(wú)明確腺癌成分的病理類(lèi)型中，基因突變的總體檢出概率較低(23/153)，包含8例PIK3CA突變、5例KRAS突變、4例EGFR19del突變、3例EFGRL858R突變、2例MET14跳躍突變、1例ALK融合突變(圖1)。

圖1 651例驅(qū)動(dòng)基因突變的NSCLC患者突變類(lèi)型分布圖

2.2 臨床特征與基因突變關(guān)系

EGFR基因突變更常見(jiàn)于女性(61.4%vs.34.0%，P<0.001)、無(wú)吸煙史(40.1%vs.31.5%，P<0.001)的腺癌患者(50.2%vs.5.0%vs.19.4%，P<0.001)，而與年齡及腫瘤分期無(wú)明顯相關(guān)性。腫瘤標(biāo)志物方面，CEA異常升高(49.9%vs.32.6%，P<0.001)以及正常范圍的CYFRA21-1(48.5%vs.38.3%，P=0.003)患者更易發(fā)生EGFR基因突變，而NSE、CA-125與EGFR基因突變無(wú)明顯相關(guān)性。ALK融合突變同樣常見(jiàn)于無(wú)吸煙史(7.8%vs.4.1%，P=0.013)、女性(7.8%vs.4.2%，P=0.016)、腺癌(6.4%vs.0.7%vs.1.6%，P=0.006)人群，但其更容易見(jiàn)于年輕的患者(7.0%vs.3.0%，P=0.006)。ALK融合突變與各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的異常升高無(wú)明顯相關(guān)性。KARS基因突變常發(fā)生于男性(12.6%vs.5.7%，P<0.001)、吸煙(12.7%vs.5.8%，P<0.001)以及肺腺癌(11.6%vs.2.9%vs.9.7%，P=0.009)患者，KARS基因突變與NSE異常升高有相關(guān)性(12.9%vs. 8.5%，P=0.030,表1)。

EGFR各突變亞型與野生型相比均較易發(fā)生在無(wú)吸煙史、女性以及CEA異常升高的患者中。較為特殊的是：①EGFR19del突變(22.5%vs.16.3%，P=0.020)和非經(jīng)典突變(4.5%vs.2.6%，P=0.042)更易發(fā)生在高齡患者，而EGFRL858R突變與年齡無(wú)明顯相關(guān)(21.7%vs.17.1%，P=0.331)；②血清CYFRA21-1正?；颊甙l(fā)生EGFR19del突變的比率較高(24.1%vs.16.4%，P=0.001)，而EGFRL858R突變(21.7%vs.18.3%，P=0.051)和EGFR非經(jīng)典突變(2.7%vs.3.6%，P=0.782)與血清CYFRA21-1水平無(wú)明顯相關(guān)性；③EGFR19del突變(22.9%vs.2.9%vs.1.6%，P<0.001)和EGFRL858R(23.4%vs.2.2%vs.12.9%，P<0.001)突變更易發(fā)生在肺腺癌當(dāng)中，而EGFR非經(jīng)典突變(3.8%vs.0.0%vs.4.8%，P=0.050)與病理類(lèi)型無(wú)明顯相關(guān)性(表2)。

表1 NSCLC患者不同基因突變組與野生型組臨床特征及腫瘤標(biāo)志物的比較 [n(%)]

表2 NSCLC患者EGFR基因不同突變亞型組與野生型組臨床特征及腫瘤標(biāo)志物的比較 [n(%)]

2.3 不同基因突變類(lèi)型患者血清腫瘤標(biāo)志物水平的差異

在本組病例中，EGFR突變患者的血清CEA水平顯著高于EGFR野生型患者[12.19(3.49，79.05)vs.4.93(2.47，17.29) ng/mL，P<0.001]。亞組分析顯示，EGFR19del突變[15.85(3.31，90.35)vs.4.93(2.47， 17.29) ng/mL)，P<0.001]、EGFRL858R突變[ 9.57(3.28，76.64)vs.4.93(2.47，17.29) ng/mL，P<0.001]以及非經(jīng)典突變亞型[18.96(6.92，100.00)vs.4.93 (2.47，17.29) ng/mL，P<0.001]患者血清CEA水平均顯著高于野生型患者。同時(shí)，EGFR突變患者的血清CYFRA21-1水平低于野生型患者[3.92(2.32，8.92)vs.4.87(2.65，9.16) ng/mL，P=0.017]。亞組分析顯示，EGFR19del突變患者組與EGFR野生型患者在血清CYFRA21-1水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3.61(2.31，8.03)vs.4.87(2.65，9.16) ng/mL，P=0.008]。KARS突變型患者的血清NSE水平高于KARS野生型患者[16.43(13.50， 22.63)vs. 14.97(11.40, 20.52) ng/mL,P=0.029]。ALK融合突變患者與ALK野生型患者與在所有納入分析的血清腫瘤標(biāo)志物水平上的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 不同基因突變類(lèi)型NSCLC患者血清腫瘤標(biāo)志物水平差異 [M(P25，P75)]

A: Ⅰ～ⅢA期患者組中不同EGFR突變亞型與野生型比較 a：P=0.689, b：P=0.123, c：P=0.091；B: ⅢB～Ⅵ期患者組中不同EGFR突變亞型與野生型比較 a：P=0.006, b：P<0.001, c：P=0.144；C:Ⅰ～ⅢA期患者組中ALK融合突變與ALK野生型對(duì)比 a：P=0.001；D: ⅢB～Ⅵ期患者組ALK融合突變與ALK野生型對(duì)比 a：P=0.026

2.4 不同分期影響突變類(lèi)型與血清腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

在Ⅰ～ⅢA期患者中，不同EGFR突變亞型與EGFR野生型患者血清CEA水平的差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A)。而在ⅢB～Ⅵ期患者中，EGFR經(jīng)典突變亞型患者血清CEA水平顯著高于EGFR野生型患者，但EGFR非經(jīng)典突變患者的血清CEA水平與EGFR野生型患者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。ALK融合突變與ALK野生型患者血清CYFRA21-1水平的差異，無(wú)論是早期組還是晚期組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 圖2C、D)。

2.5 血清CEA水平與EGFR基因突變率相關(guān)性

結(jié)果顯示EGFR突變率均隨著CEA水平的升高而逐漸升高，兩組變化有直線(xiàn)相關(guān)關(guān)系(Mantel-Haenszel差異檢驗(yàn)，P<0.001，圖3)。分層分析顯示，ⅢB～Ⅵ期患者組中EGFR突變率均隨著CEA水平的升高而逐漸升高，兩組變化有相關(guān)關(guān)系(P<0.001)，而Ⅰ～ⅢA期患者組CEA水平與EGFR突變不具有直線(xiàn)相關(guān)關(guān)系(P=0.568,圖3)。通過(guò)各指標(biāo)ROC曲線(xiàn)的參數(shù)結(jié)果顯示，無(wú)論是總體人群還是ⅢB～Ⅵ期患者組，血清CEA水平均有最大的曲線(xiàn)下面積(總?cè)巳海?.635，晚期組：0.681)；而在Ⅰ～ⅢA患者組，血清CEA水平曲線(xiàn)下面積僅有0.388，遠(yuǎn)低于吸煙及性別因素(圖4)。

A：總納入病例不同CEA水平EGFR突變類(lèi)型構(gòu)成比及變化趨勢(shì)；B：Ⅰ～ⅢA患者組不同CEA水平EGFR突變類(lèi)型構(gòu)成比及變化趨勢(shì)；C：ⅢB～Ⅵ期患者組不同CEA水平EGFR突變類(lèi)型構(gòu)成比及變化趨勢(shì)

A：總納入病例中各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)EGFR基因突變效能；B：Ⅰ～ⅢA患者組各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)EGFR基因突變效能；C：ⅢB～Ⅵ患者組各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)EGFR基因突變效能

3 討論

近年來(lái)，靶向治療顯著提高了晚期NSCLC患者的生存時(shí)間以及生活質(zhì)量。與既往研究結(jié)論一致，我們的研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)EGFR突變通常發(fā)生在女性、非吸煙的腺癌人群中，ALK融合突變更易發(fā)生在年輕人群中，KARS突變?cè)谖鼰?、男性人群中更加常?jiàn)[12]。于此同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)不同基因突變與血清腫瘤標(biāo)志物呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。EGFR突變更易發(fā)生在血清CEA異常升高以及血清CYFRA21-1水平正常的患者，且血清CEA水平越高的肺癌患者EGFR突變概率越高。

既往研究表明，CEA升高可增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞間粘附并促進(jìn)腫瘤形成[13]，且可通過(guò)造成細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞失錨狀態(tài)，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[14-15]。同時(shí)，突變的EGFR蛋白會(huì)異常激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和激活，從而破壞抗凋亡通路，加速細(xì)胞增殖[16]。EGFR下游激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，如蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)和信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3/5(signal transducer and activator of transcription 3/5，STAT3/5)，在EGFR突變誘導(dǎo)的抗凋亡效用中發(fā)揮重要作用[17]。在間皮瘤相關(guān)的基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，CEA表達(dá)受EGFR信號(hào)通路的正向調(diào)節(jié)[18]。這可能是EGFR突變體誘導(dǎo)的抗凋亡信號(hào)導(dǎo)致CEA蛋白的表達(dá)水平升高的潛在分子機(jī)制，但仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

CYFRA21-1是較為公認(rèn)用于鱗狀細(xì)胞癌鑒別診斷的腫瘤標(biāo)志物，其水平高低與病情呈正相。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生溶解時(shí)，其中的細(xì)胞角質(zhì)蛋白釋放入血，而使血中CYFRA21-1升高。既往研究提示治療前血清CYFRA21-1水平與NSCLC靶向治療效果呈負(fù)相關(guān)[19-21]，這可能與腫瘤的異質(zhì)性導(dǎo)致鱗狀細(xì)胞癌成分較多相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)CYFRA21-1與EGFR突變發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)，也有可能是腫瘤的異質(zhì)性所導(dǎo)致。

不同于既往的研究，我們的研究還納入了部分早期肺癌患者。結(jié)果提示，盡管在早期患者中EGFR野生型與突變型在血清CEA水平上差異并不明顯，但攜帶ALK融合突變的早期肺癌患者中CYFRA21-1水平低于野生型患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往研究提示早期NSCLC患者中，ALK融合突變患者的OS更長(zhǎng)， 預(yù)后更好[22]。同時(shí)有研究證明，術(shù)前高水平的CYFRA21-1是NSCLC患者術(shù)后預(yù)后不良獨(dú)立危險(xiǎn)因素[23]，但上述研究未對(duì)患者的基因突變狀況進(jìn)行檢測(cè)。我們結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期肺癌患者中ALK融合突變患者組中CYFRA21-1水平低于野生型患者，也似乎預(yù)示此類(lèi)患者的預(yù)后較好，可待后續(xù)的跟蹤隨訪(fǎng)進(jìn)一步驗(yàn)證。來(lái)自韓國(guó)的研究報(bào)道顯示，ALK融合突變的早期肺癌患者通常原發(fā)灶較小，T分期主要集中在1期[24]。這可能是導(dǎo)致早期ALK融合突變患者血清CYFRA21-1水平較低的一方面原因。

本研究仍存在一定局限性，首先納入的罕見(jiàn)突變患者數(shù)量較少，針對(duì)罕見(jiàn)突變的研究需要更大樣本的臨床研究加以探索。其次，本研究為回顧性研究，存在不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)腫瘤標(biāo)志物的影響，且入組病例部分腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)項(xiàng)目缺失，會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定的影響。最后，本研究檢測(cè)出的多重基因突變的概率較低，可能與研究采用的基因檢測(cè)為PCR法相關(guān)，后續(xù)可設(shè)計(jì)采用二代測(cè)序?yàn)榛驒z測(cè)手段的前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證腫瘤標(biāo)志物與肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變的關(guān)系。

綜上所述，本研究通過(guò)大樣本的臨床資料，揭示了腫瘤標(biāo)志物與常見(jiàn)的肺癌驅(qū)動(dòng)基因之間的聯(lián)系。血清CEA、CYFRA21-1和NSE水平可作為判斷NSCLC驅(qū)動(dòng)基因突變的輔助指標(biāo)。在無(wú)法獲知患者基因突變的情況下，通過(guò)結(jié)合腫瘤標(biāo)志物及患者臨床特征，判斷是否應(yīng)用靶向藥物治療，具有一定的參考意義。