許 瑾，覃安琪，張 蘭，杜曉夢，賁祖麗，喬自林,2,3，楊 琨,2*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心/甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心/生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

白細胞介素-4（IL-4）是Howard于1982年在T細胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)的一種多效性細胞因子[1]，活化的T淋巴細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞均可產(chǎn)生IL-4調(diào)節(jié)免疫應答反應。IL-4在腫瘤細胞逃逸、生長及增殖方面發(fā)揮著重要作用，有研究報道IL-4通過誘導白細胞介素4誘導蛋白1，阻礙淋巴細胞的正常生理功能，抑制機體腫瘤免疫調(diào)節(jié)，從而利于腫瘤形成[2]。韓潔等[3]發(fā)現(xiàn)在Hela細胞遷移和侵襲中，IL-4可通過激活巨噬細胞分泌趨化因子CCL18，激活腫瘤細胞NF-κB信號通路，促進腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達，進而促進腫瘤細胞的遷移。此外，IL-4在某些腫瘤存在時高表達，包括淋巴母細胞性白血病[4]、多發(fā)性骨髓瘤[5]、非霍奇金病[6]、急性早幼粒細胞性白血病[7]和某些實體瘤。

肝臟是機體的重要代謝器官，同時也是消化系統(tǒng)中最大的消化腺。肝臟通過新陳代謝將體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物徹底分解或直接排出體外，對維持機體正常生命活動有著重要作用。肝的生理功能受多種細胞因子的調(diào)控，晚期肝癌患者中IL-4表達水平較高[8]，IL-4的多態(tài)性與肝癌密切相關(guān)。也有學者指出白細胞介素-4多態(tài)性會影響個體對肝臟疾病的易感性，但這一結(jié)果仍然存在爭議[9]。

裸鼠具有先天性免疫功能缺陷的特點。本研究選取裸鼠為試驗對象，通過構(gòu)建Hela細胞裸鼠模型，取肝臟組織制備切片進行H&E染色觀察裸鼠肝組織病理結(jié)構(gòu)變化，免疫組化染色觀察IL-4在裸鼠肝臟組織中的表達情況，進而為研究IL-4蛋白在腫瘤形成中的作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4～7周齡雌性BALB/c裸鼠10只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器

試劑：Hela細胞懸液，購自國家實驗細胞資源共享服務(wù)平臺；兔IL-4多克隆抗體和免疫組織化學檢測試劑盒（SP-0023），均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB濃縮型顯色試劑盒（DA1010），購自北京索萊寶科技有限公司。

主要儀器：病理組織切片機、YD-AB2生物組織攤烤片機、電熱鼓風干燥箱、顯微鏡拍照系統(tǒng)等。

1.3 Hela細胞裸鼠模型構(gòu)建

Hela細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后獲得Hela細胞懸液，裸鼠肩胛部位皮下注射20 μm Hela細胞懸液，約1.0×107活細胞，獲得Hela細胞裸鼠模型，飼養(yǎng)60 d后頸椎脫臼法處死。

1.4 組織采集與固定

構(gòu)建的10只Hela細胞裸鼠模型在肩胛部位均有腫瘤形成，裸鼠處死后采集肝臟等組織立即置于4%多聚甲醛中固定，12 h后更換培養(yǎng)液以便長期儲存。固定1～2月后取約1 cm3肝臟組織進行石蠟包埋，包埋好的組織塊用病理組織切片機進行切片，粗切20 μm待組織完全暴露后改為5 μm細切。調(diào)整生物組織攤烤片機，攤片溫度45 ℃，烤片溫度45 ℃，制備組織切片。

1.5 H&E染色

制備好的組織切片于45 ℃烤片15 min后進行蘇木精-伊紅染色，切片在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ及苯酒精中均放置5 min，蘇木精核染約2 min，酸水分化約2～3 s，伊紅染色約4 min，最后用中性樹脂封片，以便后期觀察。

1.6 免疫組化染色

以兔IL-4多克隆抗體為一抗，使用濃度IL-4∶PBS=1∶299，組織切片45 ℃烤片15 min后按照SP試劑盒及DAB顯色試劑盒的操作流程進行脫蠟，抗原修復，阻斷，封閉，滴加一抗、二抗、三抗，孵育，DAB顯色，蘇木精復染等操作，最后用中性樹脂封片。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織形態(tài)觀察

Hela細胞裸鼠模型肝臟組織H&E染色結(jié)果見圖1。裸鼠肝小葉間結(jié)締組織較少，每個肝小葉之間沒有明顯的區(qū)分界線。肝細胞由中央靜脈向四周呈放射狀分布，肝臟組織結(jié)構(gòu)較完整，靜脈有明顯的充血，肝血竇內(nèi)也可見出血現(xiàn)象，肝竇內(nèi)分布有枯否細胞和淋巴細胞，枯否細胞多呈長條狀，靜脈附近有大量嗜堿性細胞聚集。

圖1 Hela細胞裸鼠模型肝臟組織切片H&E染色觀察

2.2 免疫組化染色結(jié)果

Hela細胞裸鼠模型肝臟組織經(jīng)IL-4蛋白免疫組化染色后陽性表達顯著，結(jié)果見圖2。IL-4蛋白主要在肝細胞胞質(zhì)陽性表達，細胞核、肝血竇、淋巴細胞、枯否細胞均無表達。C圖觀察到每個肝小葉間結(jié)締組織較少，分界不清，肝組織內(nèi)有大量嗜堿性細胞聚集，且IL-4在此類細胞中無表達。

圖2 Hela細胞裸鼠模型肝臟IL-4蛋白免疫組化染色結(jié)果

3 結(jié)論與討論

IL-4是由Th2細胞分泌的多功能細胞因子，在機體免疫以及腫瘤發(fā)生過程中具有調(diào)節(jié)作用[2-3]。有研究表明在促進腫瘤形成中，IL-4主要通過3條信號通路來抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞的增殖、分化、遷移，調(diào)控腫瘤形成[10]，即通過JAK/STAT6信號通路誘導STAT6磷酸化，促進細胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、VEGF等促進腫瘤形成的細胞因子間接作用腫瘤細胞；通過AKT/mTOR信號通路及MAPK信號通路增強抗凋亡蛋白的表達，促進腫瘤細胞增殖。本試驗發(fā)現(xiàn)IL-4蛋白在肝細胞胞質(zhì)中顯著表達，說明在注射Hela細胞形成異源移植瘤的過程中，通過細胞過表達IL-4蛋白誘導相關(guān)信號通路，促進腫瘤細胞增殖、逃逸，有利于腫瘤形成，IL-4在腫瘤形成中發(fā)揮著重要作用。

枯否細胞（KC）本質(zhì)上是一種巨噬細胞，形態(tài)不規(guī)則，常駐于肝臟內(nèi)，參與肝臟固有免疫反應[11]。它具有極強的可塑性，在不同微環(huán)境下可以極化為M1和M2兩種功能截然不同的類型[12]，M1型主要在促進炎癥發(fā)生、引起肝臟損傷方面發(fā)揮作用；M2型的主要作用是抑制炎癥反應，促進肝臟修復。但有研究發(fā)現(xiàn)可通過抑制KC細胞向M2型極化抑制結(jié)腸癌向肝組織轉(zhuǎn)移[11]。本試驗發(fā)現(xiàn)枯否細胞多呈長條狀，在肝血竇內(nèi)廣泛分布，說明該細胞通過變形運動穿梭在肝血竇內(nèi)，可能與腫瘤形成有關(guān)[13]，但其具體生理作用仍需進一步研究。

Hela細胞異源移植瘤的形成是多種細胞因子相互作用的結(jié)果，其中IL-4蛋白在肝細胞胞質(zhì)的顯著表達可能對腫瘤的形成有著重要作用，同時穿梭在血竇中的枯否細胞也有可能與腫瘤形成有關(guān)。