尹 磊，潘孝成*，沈學懷，張丹俊，戴 銀，王潔茹

(1.安徽省農科院畜牧獸醫(yī)研究所 安徽省畜禽疫病研究中心，合肥 230031;2.畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室，合肥 230031)

雞白痢沙門菌(S. Pullorum)是禽類的重要病原體，對家禽業(yè)構成嚴重威脅。雞白痢沙門菌可利用大囊泡(Salmonellacontaining vacuole, SCV)有效逃避宿主免疫系統(tǒng)，使宿主長期保持持續(xù)或隱性感染，造成機體持續(xù)帶菌且細菌長期定植于脾巨噬細胞或生殖道內，通過血液循環(huán)進入全身各組織器官，進而導致免疫抑制和免疫系統(tǒng)損害，引起嚴重的系統(tǒng)性疾病。相較于其他種屬沙門菌，雞白痢沙門菌具有高度的宿主特異性，雞最為易感，其次是火雞。它能引起雛雞白痢并引發(fā)急性敗血癥，造成較高的發(fā)病率和死亡率[1]。盡管S. Pullorum病在發(fā)達國家的商業(yè)雞群中已得到了很好的控制，但在發(fā)展中國家，包括中國，仍然是一個主要問題[2]。因此，更全面地了解雞對S. Pullorum的反應將有助于改進防控策略，并為有效控制和預防S.Pullorum病提供新的理論基礎。

骨髓是家禽中最重要的器官之一[3]，它在抵抗和抑制細菌及病毒等各種病原體中發(fā)揮著重要作用。骨髓不僅是多能造血干細胞的重要來源，而且也是兩大類白細胞，即淋巴系和骨髓系的儲備庫。其中，淋巴系分化為B細胞、T細胞和自然殺傷細胞，而骨髓系則發(fā)展為巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞和樹突狀細胞(DCs)。所有這些細胞在先天性和適應性免疫反應中發(fā)揮關鍵作用[4-5]。目前，通過組學技術對免疫器官或免疫細胞在感染期間進行基因差異表達分析，有助于理解S. Pullorum致病機制和免疫調控水平。

微小核糖核酸(miRNA)是一類20至23個核苷酸的非編碼小RNA，作為生物過程的轉錄后調節(jié)器，在調控發(fā)育、分化、器官形成、生長控制和細胞凋亡等生命活動中發(fā)揮重要作用[6]。研究表明，miRNA在微生物感染宿主過程中發(fā)揮著重要作用，如禽致病性大腸桿菌感染雞后，脾miRNA的表達失調與免疫細胞的發(fā)育分化及炎癥反應密切相關[7]。骨髓提供的原始細胞，即兩大類白細胞，不受淋巴器官中存在的發(fā)育細胞因子和其他因素的影響[8]，因此，骨髓可以用來識別感染S. Pullorum的新的候選調控分子和網絡。本研究對感染和未感染雞骨髓中不同的miRNA表達進行分析，以確定骨髓對S. Pullorum感染的免疫反應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集

無特異性病原體(SPF)的來航雞的胚胎蛋購自北京梅里亞實驗動物技術有限公司。SPF雞在封閉環(huán)境中孵化，并在負壓隔離器中飼養(yǎng)，以保證動物實驗中無沙門菌。在7日齡時，30只SPF雞口服1 mL 108cfu的S. Pullorum (CVCC 2216)作為感染組，另外15只雞口服1 mL PBS作為對照組，感染組與對照組分別單獨隔離飼養(yǎng)。在感染后24 h內，對雞靜脈注射巴比妥鈉安樂死。用解剖刀去除雞腿骨上的結締組織,然后用刀將骨剖開，用刮刀將其中的骨髓取出，最后用1.05 mm的尼龍網過濾，得到純骨髓，快速冷凍并保存在-80 ℃。

1.2 總RNA提取及樣品準備

使用TRIzol試劑(Invitrogen)和Polyacryl Carrier(MRC)從樣品中提取總RNA。在1%瓊脂糖凝膠上監(jiān)測RNA的降解和污染情況。使用NanoPhotometer分光光度計(IMPLEN)、Aglient Bioanalyzer 2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000檢測試劑盒(Aligent Technologies)和Qubit 2.0 Flurometer的Qubit RNA檢測試劑盒(Life Technologies)測量RNA純度、完整性和濃度。只有吸光度(260/280 nm)之比>1.8和RNA完整性編號(RINs)>7的RNA樣品被用于RNA分析。

1.3 miRNA測序及生物學功能分析

由Oebiotech公司(中國上海，http://www.oebiotech.com)對樣品進行microRNA分析。提取的RNA被標記并雜交到Agilent-070154 RatmiRNA Microarray V21.0 8×15K(Agilent)。采用Genespring軟件(13.1版，Agilent Technologies)對原始數據進行標準化，并識別差異表達的miRNAs(DEmiRNAs)。上調或下調的基因的閾值是倍數變化≥2和P≤0.05。通過檢查兩個數據庫(Targetscan和microRNAorg)的重疊交集來選擇DEmiRNAs的目標基因。使用基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)對推測的基因進行了功能和途徑富集分析。GO和KEGG分析的意義閾值被定義為P≤0.05。miRNA和靶基因之間的潛在調節(jié)關系使用Cytoscape軟件(http://www.cytoscape.org/)進行分析[9]。

1.4 qRT-PCR分析miRNAs

使用ABI Step One熱循環(huán)儀(Applied Biosystems, CA, USA)和miRcute miRNA qPCR SYBR Green檢測試劑盒(Vazyme, Nanjing, China)進行qRT-PCR。本研究使用的miRNA特異性正向引物見表1。U6 snRNA被用來作為內部標準。每個基因都使用了3個獨立的生物重復。每個miRNA的相對表達水平通過2-ΔΔct方法計算[10]。

表1 本研究所用引物序列

2 結 果

2.1 骨髓中差異表達的miRNA分析

對轉錄組數據通過P值≤0.05和差異倍數變化≥2的閾值進行過濾。根據這些標準，在雞白痢沙門菌感染后的骨髓中，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)了20個差異表達的已知miRNAs。其中11個上調，9個下調，通過對樣本進行差異化處理的聚類熱圖，結果如圖1所示。

圖1 差異表達miRNAs聚類熱圖Fig.1 Heat map of differentially expressed miRNAs clustering

2.2 通過qRT-PCR驗證miRNAs

為了驗證miRNA測序結果的可靠性，隨機選取6個關鍵差異顯著的miRNAs進行驗證，以U6作為內參基因，根據NCBI中的基因序列設計引物，通過qRT-PCR檢測，結果如圖2所示，與未感染組相比，3個miRNAs(gga-miR-6643-5p、gga-miR-1466和gga-miR-2954)表達上調，3個miRNAs(gga-miR-762、gga-miR-6690-5p和gga-miR-1647)表達下調，測序結果與qRT-PCR趨勢一致，表明轉錄組數據可信。

2.3 miRNA靶基因分析

利用miRanda算法預測差異表達miRNAs的潛在靶基因，并進行生物信息學分析。通過差異表達miRNAs預測靶基因并進行GO功能注釋和富集分析，確定miRNA靶基因的功能。從圖3可以看出，預測的靶基因主要注釋到膜運輸、信號轉導、免疫系統(tǒng)、碳水化合物代謝、糖類的生物合成和代謝等等分子功能上(圖3)。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達miRNA的靶基因主要富集于Notch信號通路、Hedgehog信號通路、PPAR信號通路、AMPK信號通路、Hippo信號通路等信號通路(圖4)。

2.4 與免疫相關的miRNA-mRNA調控網絡互作分析

利用Cytoscape軟件構建與免疫過程相關的miRNA-mRNA網絡互作圖。圖5結果顯示，有11個與免疫相關的差異表達的miRNAs，結合miRNAs與mRNA的連接性及所擁有的mRNA靶基因數量，發(fā)現(xiàn)gga-miR-1466和gga-miR-6643-5p可能是參與免疫過程相關的關鍵miRNA。

圖2 qRT-PCR結果與miRNA測序結果的比較Fig.2 Comparison of the qRT-PCR results with the miRNA sequencing results

圖3 差異表達miRNA靶基因GO分析Fig.3 GO analysis of differentially expressed miRNA target genes

圖5 miRNA-mRNA互作網絡圖Fig.5 miRNA-mRNA interactions network map

3 討 論

先天免疫是抵御病原體入侵的第一道防線，當病原體相關分子模式(PAMPs)被模式識別受體(PRRs)識別時就會被激活[11]。骨髓作為未成熟免疫細胞的儲存庫，它在抵抗病原菌感染過程中發(fā)揮著重要作用。雞白痢沙門菌作為一種重要的宿主特異性致病菌，只在雞中引起疾病。目前，關于骨髓細胞在應對雞白痢沙門菌感染過程中的作用及機制未見報道。因此，本研究利用miRNA-seq技術獲得了感染S. Pullorum與未感染雞的骨髓轉錄表達譜測序數據。隨后，基于對骨髓中miRNA和潛在靶標mRNA表達譜的聯(lián)合分析，目的是更好地了解宿主在抵抗S. Pullorum感染過程中的免疫機制。

miRNAs已被證明與病原體入侵和宿主抵抗力密切相關[12-13]。因此，有必要對雞感染S. Pullorum等病原體免疫反應中的關鍵miRNAs進行鑒定和定性，以了解發(fā)病機制，改善動物福利，減少家禽生產中的損失，保證食品安全。本研究中miRNA表達譜數據顯示，共獲得20個已知的差異表達miRNAs，其中11個表達上調，9個表達下調，其中與免疫相關的差異表達miRNAs有11個，包括gaa-miR-762、gaa-miR-2954、gaa-miR-1647等。研究表明，gaa-miR-762的表達變化與免疫系統(tǒng)和炎性損傷密切相關，在病原體感染宿主過程中，LPS誘導的骨髓衍生巨噬細胞誘導特定的miRNAs上調，這其中包括gaa-miR-762，進而導致炎性炎癥細胞因子(IL-6、IL-12和TNF)的產生減少，但它們增加了IL-10的釋放[14-15]；Zhou等[16]通過注射地塞米松(Dex)建立了7日齡雞的免疫抑制模型，分析了雞胸腺中miRNA表達譜特征，發(fā)現(xiàn)gaa-miR-2954高度富集，通過影響Toll樣受體信號通路、Jak-STAT信號通路等免疫信號通路進而影響雞的胸腺免疫功能；gaa-miR-1647參與禽巨噬細胞的表達分化，在應對病原體時能夠成功激活相關通路從而發(fā)揮重要作用[17]?？傊驹囼灲Y果表明，這些差異表達的miRNAs可能參與了宿主骨髓細胞與S. Pullorum的相互作用，具體機制有待后續(xù)進一步的研究。

通過預測miRNAs的靶點和注釋其生物功能，對預測miRNAs的功能和構建調控網絡很有幫助。本研究中，11個與免疫有關的生物過程被顯著富集，同時，發(fā)現(xiàn)富集的基因主要集中在Notch信號通路、Hedgehog信號通路、PPAR信號通路、AMPK信號通路、Hippo信號通路上。Notch信號通路在控制淋巴細胞介導的炎癥反應中發(fā)揮著重要作用[18]；Hedgehog信號通路相關基因的表達失調會導致巨噬細胞的組織特異性炎癥[19]；PPAR信號通路可以被Genipin激活，引導并維持巨噬細胞向M2亞型的極化，從而緩解炎癥反應[20]；AMPK信號通路作為能量應激和鈣誘導自噬的關鍵調節(jié)因子，它的激活對宿主在炎癥反應下的損傷有保護作用[21]；Hippo通路作為先天免疫中最原始的信號通路，其信號成分LATS2通過PQBP1-cGAS途徑增強先天免疫，從而抑制病原微生物的感染[22]。本試驗結果突出了差異表達的miRNAs在宿主對S. Pullorum感染反應中的潛在功能。

當前，雞白痢沙門菌所造成的經濟損失對中國養(yǎng)禽業(yè)仍是一個重大的挑戰(zhàn)，需要高效精準的防控解決方案。miRNA在S. Pullorum感染致病過程中發(fā)揮著重要作用，從miRNA水平解析S. Pullorum的致病機制，有助于發(fā)現(xiàn)防控S. Pullorum的新途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，gaa-miR-1647在S. Pullorum感染過程中顯著差異表達，gaa-miR-1647作為激活免疫細胞應對病原感染的關鍵因子[17]，可以考慮利用gaa-miR-1647作為診斷雞白痢沙門菌感染的生物標志物，有待后續(xù)進一步的驗證與研究。同時，miRNA靶向宿主基因作為新型治療靶標的研究方向，通過將聚合物納米技術與miRNA調控技術相結合，開發(fā)出一種靶向聚合物納米顆粒[23]，將包裹著gaa-miR-762和gaa-miR-2954共同遞送到雞體內，通過調節(jié)Toll樣受體信號通路、Jak-STAT信號通路和炎癥信號通路，實現(xiàn)對S. Pullorum的防控。

4 結 論

本試驗通過miRNA測序來篩選和識別S. Pullorum感染雞骨髓的差異表達miRNAs，這些差異表達的miRNAs與免疫和炎癥反應的信號通路有關，本研究為闡明S. Pullorum致病機制和病原與宿主的相互作用提供了基礎，也為防控S. Pullorum提供了新的策略。