張然然，榮 敏，董依萌，王天驕，邢秀梅*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112；2.德州市畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，德州 253000)

鹿茸是一種能夠完全再生的骨質(zhì)器官，為雄性鹿科動(dòng)物第二性征。鹿茸生長(zhǎng)周期在 100 d左右，呈“S”型生長(zhǎng)，最快生長(zhǎng)速度可達(dá) 2.75 cm·d-1或 300 g·d-1[1]。鹿茸細(xì)胞的增殖速率比癌細(xì)胞快30倍，但有序、可控，是研究骨骼快速生長(zhǎng)、骨質(zhì)疏松的良好模型。茸尖被認(rèn)為是鹿茸的生長(zhǎng)中心，以軟骨內(nèi)成骨方式驅(qū)動(dòng)鹿茸的快速生長(zhǎng)過程。近些年，利用RNA-seq、iTRAQ、label-free等組學(xué)技術(shù)對(duì)鹿茸的基因、蛋白質(zhì)表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行了詳細(xì)研究，并篩選到了與鹿茸快速生長(zhǎng)相關(guān)的基因、信號(hào)通路[2-5]。

繼基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)，又衍生出了代謝組學(xué)(metabonomics)，主要研究生物體相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000 的內(nèi)源性小分子代謝物的種類、數(shù)量及其在內(nèi)外因素作用下的變化規(guī)律，如氨基酸、脂質(zhì)、核苷等化合物[6]。與基因組、蛋白質(zhì)組相比，代謝組更能直觀地反映生物體對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)，且可以放大基因組、蛋白質(zhì)組的微小改變，是對(duì)基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的有力補(bǔ)充與相互印證。目前，代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥研究、臨床疾病診斷、化學(xué)生態(tài)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、毒理研究等多個(gè)科學(xué)領(lǐng)域[7-8]。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，代謝組學(xué)技術(shù)也逐漸應(yīng)用在鹿茸組分的研究。孫偉麗等[9]、劉文媛等[10]、唐麗昕等[11]利用UPLC-QTOF/MS代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)不同區(qū)段鹿茸的內(nèi)源性小分子代謝進(jìn)行了鑒定與差異分析；張楠茜等[12]對(duì)比分析了鹿茸熱炮制前后的化學(xué)組成差異；Su等[13]利用代謝組學(xué)技術(shù)分析了梅花鹿和馬鹿鹿茸之間的代謝物差異；本課題組前期利用UPLC-QTOF/MS技術(shù)對(duì)梅花鹿靜脈血與鹿茸血小分子代謝物成分進(jìn)行了對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)了天然抗氧化劑-麥角硫因在鹿茸血中含量顯著高于靜脈血[14]。

代謝組學(xué)技術(shù)不僅可以分析鹿茸組分，也是探究鹿茸復(fù)雜生長(zhǎng)機(jī)制的一種重要技術(shù)手段。本研究利用UPLC-QTOF/MS技術(shù)對(duì)生長(zhǎng)25、45、65、100與130 d的梅花鹿鹿茸進(jìn)行代謝組學(xué)研究，分析小分子代謝物在鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育過程中的表達(dá)變化，為鹿茸快速生長(zhǎng)、骨化分子調(diào)控機(jī)制的解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所需的梅花鹿鹿茸取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所試驗(yàn)動(dòng)物基地。選取體況良好的 4歲齡雄性東北梅花鹿，收取生長(zhǎng)25、45、65、100與130 d的鹿茸，每時(shí)期樣品分別取自不同的 3 頭梅花鹿做為生物學(xué)重復(fù)。用 PBS 緩沖液將新鮮鹿茸組織表面的血液與污漬沖洗干凈，然后選取鹿茸的尖部，去除茸皮，并將其切成 1 mm3小塊，用液氮研磨儀研磨成粉末，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

乙腈購自Merck公司，甲醇、乙酸銨購自Honeywell公司(均為L(zhǎng)C-MS級(jí)別)；質(zhì)譜儀5600/6600購自AB SCIEX公司，超高壓液相色譜儀1290購自Agilent 公司，低溫高速離心機(jī)5430R購自Eppendorf公司；液相色譜柱均購自Waters公司，ACQUITY UPLC BEH Amide column (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)，ACQUITY UPLC HSS B3 column(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)。

1.3 樣本預(yù)處理

每份樣品分別稱取80 mg至1.5 mL離心管中，加入800 μL甲醇乙腈水溶液(體積比2∶2∶1)，渦旋混勻30 s，冰上超聲30 min，-20 ℃ 靜置1 h；之后 4 ℃，13 000 r·min-1離心15 min；小心地取出上清溶液，冷凍干燥，甲醇乙腈水溶液復(fù)溶。每個(gè)樣本各取10 μL混合成QC質(zhì)控樣本。

1.4 HPLC-MS分析

試驗(yàn)所用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)由Aglient 1290 Infinity LC串聯(lián)AB Sciex Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀組成。所使用的色譜柱為Waters的UPLC BEH Amide 色譜柱。柱溫設(shè)置25 ℃，正離子掃描模式進(jìn)樣量3 μL，負(fù)離子掃描模式進(jìn)樣量4 μL。每進(jìn)6個(gè)樣品后加入一個(gè)QC樣品。流動(dòng)相為25 mmol·L-1醋酸銨及25 mmol·L-1氨水的水溶液(A液)，純乙腈(B液)，梯度洗脫程序見表1；整個(gè)分析過程中樣品置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中。

利用AB 5600 Triple TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。ESI離子源參數(shù)設(shè)置如下：霧化氣壓：40 Psi，輔助氣壓：80 Psi，氣簾氣壓：30 Psi，溫度：650 ℃，噴霧電壓：5 000 V(正、負(fù)兩種離子掃描模式)。二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量(35±15)eV。數(shù)據(jù)采集按照分段模式進(jìn)行：50～300，290～600，590～900，890～1 200 m·z-1。所采集獲得的數(shù)據(jù)分別使用自建MetDDA和LipDDA方法，進(jìn)行代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定。

表1 液相洗脫梯度

1.5 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard轉(zhuǎn)換成.mzXML格式，然后采用XCMS程序進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預(yù)處理后，進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，包括無監(jiān)督主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)[15]。單維統(tǒng)計(jì)分析包括Student’st-test和變異倍數(shù)分析。利用 MetaboAnalyst 5.0在線軟件進(jìn)行代謝物的通路富集分析[16]。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(<25 ppm)和二級(jí)譜圖匹配的方式，檢索自建數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié) 果

2.1 試驗(yàn)質(zhì)量控制

對(duì)比6份相同QC樣本的正、負(fù)離子檢測(cè)模式下的總離子流圖，結(jié)果顯示，各QC樣本的色譜峰響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊且基線穩(wěn)定，說明在整個(gè)試驗(yàn)過程中儀器誤差引起的變異較小(圖1)。采用XCMS軟件對(duì)梅花鹿鹿茸樣品的代謝物離子峰進(jìn)行提取，正離子模式下共提取到保留峰12 063個(gè)，負(fù)離子模式下提取到8 974個(gè)。

2.2 統(tǒng)計(jì)分析

分別對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto-scaling處理，然后進(jìn)行樣品間主成分分析(PCA)與層次聚類分析。結(jié)果顯示，各時(shí)期鹿茸在PC1(34.3%)維度上顯著分離(圖2A)。樣品層次聚類結(jié)果顯示，5個(gè)時(shí)期樣品可以分為兩類(圖2B)，第一類包括25、45、65 d三個(gè)時(shí)期鹿茸，第二類包括100 與130 d兩個(gè)時(shí)期鹿茸。

A. 鹿茸樣品PCA分析；B. 鹿茸樣品層次聚類分析A. PCA analysis of antler; B. Hierarchical cluster analysis of antler圖2 不同生長(zhǎng)時(shí)期鹿茸樣品統(tǒng)計(jì)分析Fig.2 Statistical analysis of antler samples in different growth periods

2.3 鹿茸發(fā)育過程中代謝物表達(dá)動(dòng)態(tài)

為篩選鹿茸不同生長(zhǎng)時(shí)期的顯著差異表達(dá)代謝物，首先進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，通過運(yùn)用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣品間的關(guān)系模型，來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè)；同時(shí)通過計(jì)算變量投影重要度(VIP)來衡量各代謝物的表達(dá)模式對(duì)各樣本分類的影響強(qiáng)度和解釋能力。最終設(shè)定顯著差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)：VIP>1，P<0.05，|fold change|>2。結(jié)果共鑒定到171種顯著差異表達(dá)代謝物，其中T25vs.T45有39種差異代謝物，T45vs.T65組有7種差異代謝物，T65vs.T100組有70種差異代謝物；T100vs.T130組有84種差異代謝物(圖3)。

圖3 顯著差異表達(dá)代謝物Fig.3 Significant differentially expressed metabolites

2.4 差異代謝物分類

差異代謝物匹配到HMDB數(shù)據(jù)庫的112種化合物，可分為7大類，分別為有機(jī)酸及其衍生物類，脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子，核苷、核苷酸和類似物，有機(jī)氮化合物，有機(jī)氧化合物，有機(jī)雜環(huán)化合物以及苯類化合物(圖4)。

有機(jī)酸及其衍生物類有39種顯著差異代謝物，其中29種為氨基酸，包括L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、D-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-焦谷氨酸、N-乙酰-L-天冬氨酸、L-天冬氨酸、L-纈氨酸、甘氨酸、L-瓜氨酸、L-絲氨酸、L-蛋氨酸、L-谷氨酸、D-天冬氨酸、L-組氨酸等。除L-焦谷氨酸、L-組氨酸外，其他氨基酸類化合物均在鹿茸生長(zhǎng)期表達(dá)上調(diào)；而L-焦谷氨酸、L-組氨酸、L-肌肽(β-丙氨酰-L-組氨酸)與阿坎酸等有機(jī)酸類化合物在100 d含量最高，隨后在130 d時(shí)顯著下降。所有有機(jī)酸及其衍生物類化合物均在130 d時(shí)表達(dá)顯著下調(diào)。

脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子是差異代謝物的第二大類，包含了27種差異代謝物。其中13種為脂肪酸化合物，包括羥基異己酸、3-羥基-3-甲基戊二酸、乙酰肉堿、肉豆蔻酸、十五烷酸、cis-9-棕櫚油酸、十七烷酸、油酸、16-羥基棕櫚酸、花生酸、山崳酸、L-棕櫚酰肉堿、硬脂酰肉堿等，其中L-棕櫚酰肉堿在骨化期上調(diào)，其他均在生長(zhǎng)期上調(diào)；6種為類固醇類代謝物，其中鵝去氧膽酸鹽、膽酸在25 d含量上調(diào)，甘膽酸在100 d時(shí)顯著上調(diào)，而膽鈣化醇、甾醇在130 d時(shí)顯著上調(diào)；此外，還包含有3種類花生酸化合物，15-脫氧-Δ12,14-前列腺素J2、前列腺素H2、前列腺素I2均在130 d顯著上調(diào)。

核苷、核苷酸和類似物包含了11種顯著差異代謝物。8種為嘌呤核苷酸，包括脫氧肌苷、肌苷、腺苷、N6-甲基腺苷、鳥苷、黃嘌呤核苷、2-甲基鳥苷、1-甲基鳥苷等，其中肌苷與鳥苷在100 d時(shí)含量最高，所有嘌呤核苷酸類代謝物均在130 d時(shí)表達(dá)顯著下調(diào)。有機(jī)氮化合物包含了12種差異代謝物，其中組胺、鞘氨醇、鞘氨醇、植物鞘氨醇、亞油酰乙醇酰胺、N-油酰乙醇胺等胺類化合物均在130 d含量顯著上調(diào)。

有機(jī)氧化合物有11種，主要為碳水化合物或碳水化合物結(jié)合物，這些化合物均在130 d時(shí)含量顯著下調(diào)，包括甘油酸、L-山梨糖、D-甘露糖、α-D-葡萄糖、N-乙?；?D-氨基葡萄糖、L-蘇糖酸鹽、D-葡萄糖酸鹽、D-核糖、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰神經(jīng)氨酸等。有機(jī)雜環(huán)化合物有8種，其中5-甲基胞嘧啶、二氫胸腺嘧啶、次黃嘌呤、2-羥基腺嘌呤在100 d顯著上調(diào)；尿囊素、L-色氨酸在130 d時(shí)下調(diào)。苯類差異代謝物有4種，其中酪胺、多巴胺、馬尿酸等在130 d下調(diào)。

圖4 基于HMDB數(shù)據(jù)庫的差異代謝物分類Fig.4 Classification of differential metabolites based on HMDB database

2.5 差異代謝物通路富集分析

差異代謝物共顯著富集到13種KEGG代謝通路(P<0.05)，分別為氨酰-tRNA生物合成，組氨酸代謝，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，乙醛酸和二羧酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，嘌呤代謝，甘油磷脂代謝，泛酸和CoA 生物合成，谷胱甘肽代謝等代謝通路(圖5)。組氨酸代謝通路見圖6。

圖5 差異代謝物代謝通路分析Fig.5 Differential metabolite metabolic pathway analysis

代謝物上方的熱圖代表25、45、65、100、130 d的相對(duì)含量。紅色代表上調(diào)，藍(lán)色代表下調(diào)Heatmaps above metabolites represent relative amounts at 25, 45, 65, 100, 130 d. Red represents up-regulation, blue represents down-regulation圖6 組氨酸代謝通路Fig.6 Histidine metabolism pathway

3 討 論

鹿茸生長(zhǎng)過程可分為生長(zhǎng)期與骨化期[17]，其生長(zhǎng)速度、相對(duì)骨質(zhì)密度以及基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)模式均有顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)期與骨化期在代謝組水平也存在顯著差異，且篩選到了171種顯著差異表達(dá)代謝物，主要為氨基酸類、脂質(zhì)、核苷酸類等化合物。

鹿茸中含有豐富的氨基酸，其總量占鹿茸干重的30%～50%，其中天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、精氨酸等氨基酸占氨基酸總量的32.5%～37.2%，這主要是由于膠原蛋白的存在[18]。KEGG富集結(jié)果顯示，氨基酸代謝在鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)生了顯著變化，如組氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝。除L-組氨酸外，其他氨基酸均在鹿茸生長(zhǎng)期表達(dá)上調(diào)。這與前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果是一致的，參與翻譯起始、蛋白折疊、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過程的蛋白質(zhì)在生長(zhǎng)期表達(dá)上調(diào)[2]。另一類在生長(zhǎng)期表達(dá)上調(diào)的化合物為有機(jī)酸類，其中檸檬酸、磷酸烯醇式丙酮酸、L-蘋果酸、琥珀酸等都是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。三羧酸循環(huán)是機(jī)體將糖或其他物質(zhì)氧化而獲得能量的最有效方式，能夠?yàn)闄C(jī)體的生命活動(dòng)提供大量能力。因而，三羧酸循環(huán)相關(guān)化合物可提供鹿茸快速生長(zhǎng)所需的能量供應(yīng)。

組氨酸代謝是差異代謝物顯著富集通路之一，涉及到了L-組氨酸、組胺、肌肽、鵝肌肽等。組氨酸是合成蛋白質(zhì)所必需的，在酶的活性位點(diǎn)起著重要作用，如絲氨酸蛋白酶[19]。肌肽與鵝肌肽是由β-丙氨酸和L-組氨酸兩種氨基酸組成的內(nèi)源性二肽[20]，鵝肌肽可由肌肽-N-甲基轉(zhuǎn)移酶 1(CARNMT1)催化肌肽形成[21]。肌肽富含在脊椎動(dòng)物的肌肉和大腦組織中，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物效應(yīng)，包括抗炎[22]、抗氧化[23]、抗衰老[24]、抗糖基化[25]等，也有研究發(fā)現(xiàn)肌肽可能通過抑制β-catenin信號(hào)通路調(diào)控的成骨因子轉(zhuǎn)錄生成和細(xì)胞凋亡，而抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化[26]。組氨酸可以在組氨酸脫羧酶的酶解下形成組胺。組胺是一種重要的化學(xué)介質(zhì)，主要由肥大細(xì)胞合成，參與胚胎發(fā)育[27]、組織再生[28-29]、傷口愈合[30]、免疫[31]、骨代謝[32]。有研究證實(shí)，組氨酸脫羧酶敲除OVX(卵巢切除術(shù))小鼠的骨小梁丟失減少。同時(shí)，組胺也可以增加破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體的數(shù)量，而組胺受體1和組胺受體2的拮抗劑則降低了破骨細(xì)胞的招募和骨吸收[33-34]。進(jìn)一步有研究證明，組胺是通過RANKL-RANK信號(hào)通路誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的[35]，而且組胺能通過刺激牙齦成纖維細(xì)胞IL-2、IL-4表達(dá)升高，間接促使前列腺素 E2的分泌表達(dá)。因此，組氨酸代謝通路可能參與了鹿茸快速骨化過程的調(diào)控。

脂類化合物在鹿茸生長(zhǎng)過程中也發(fā)生了顯著差異變化，其中前列腺素H2、前列腺素I2、前列腺素J2等參與了前列腺素生物合成過程。前列腺素H2是所有前列腺素生物合成的第一個(gè)中間體，其中前列腺素E2是骨代謝的重要調(diào)節(jié)劑，體外注射可增加骨小梁表面的成骨細(xì)胞數(shù)量[36]，誘導(dǎo)新生松質(zhì)骨形成，促進(jìn)骨折愈合[37]。Weinreb等[38]發(fā)現(xiàn)，前列腺素E2可通過結(jié)合EP4受體，激活鞘氨醇激酶，抑制caspase活性，從而增加大鼠骨髓成骨基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。此外，前列腺素E2還可直接刺激成骨細(xì)胞分化，或通過刺激成骨細(xì)胞中RANKL表達(dá)，抑制骨保護(hù)素的表達(dá)，而間接刺激破骨細(xì)胞分化，進(jìn)而調(diào)控骨重塑[39]。因此可以推測(cè)，前列腺素合成通路在鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育過程中也同樣發(fā)揮重要的作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用UHPLC-TOF-MS技術(shù)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的梅花鹿鹿茸進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果共檢測(cè)到了171種顯著差異代謝物，其中L-組氨酸、L-肌肽、組胺、前列腺素等化合物在骨化期表達(dá)上調(diào)，推測(cè)這些化合物可能參與了鹿茸的快速骨化過程。本研究從代謝組水平為鹿茸快速生長(zhǎng)與骨化分子機(jī)制的探究提供數(shù)據(jù)支撐。