吳居業(yè)，盧寶春，祝宇凡，賈 坤*

(1.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642； 2.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣州 510642； 3.廣東省寵物工程技術研究中心，廣州 510642)

犬乳腺腫瘤是犬最常見的腫瘤之一，嚴重影響犬的生命健康，在獸醫(yī)臨床上備受關注[1]。犬乳腺腫瘤是一種具有復雜背景的異質性疾病，該疾病主要發(fā)生在未絕育的中小型雌犬上，其中，41%～53%的病例惡性程度較高，并且腫瘤有轉移傾向，引起腫瘤的發(fā)生與多種因素的相互作用有關[2-3]。犬乳腺腫瘤的早期癥狀不明顯，并且犬乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制尚未清楚，往往確診的犬已經處于腫瘤發(fā)生的晚期，因此從分子機制上深入探討犬乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關重要。THBS1是血小板凝血酶蛋白家族(thrombospondin，THBS)中第一個被確定的成員，最初發(fā)現(xiàn)于血小板中，是可以由許多細胞合成和分泌的糖蛋白[4]。THBS1不僅能夠調節(jié)細胞的生物學功能、血管形成、蛋白質-蛋白質和蛋白質-黏多糖的相互作用，還參與了復雜的細胞凋亡過程，在各類腫瘤的凋亡機制方面起重要作用[5-7]。在前期的研究中，作者發(fā)現(xiàn)THBS1 mRNA在犬乳腺腫瘤中高表達，并且犬乳腺腫瘤組織的THBS1 mRNA表達水平與患犬的純雜品種具有顯著性相關[8]。目前，THBS1在犬臨床上少有報道，研究THBS1對犬乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機制，可以為后續(xù)犬乳腺腫瘤的分子機制的深入研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細胞及質粒 人胚胎腎上皮細胞HEK293T、犬乳腺腫瘤細胞CHMp、慢病毒三質粒(pCDH-CMV-MCS-3flag-TST-EF1-CopGFP-T2A-Puro、PsPaX2、PMD2.G)以及逆病毒基因沉默質粒pSuper.Retro.Neo+GFP均由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院外科教研室保存。

1.1.2 主要試劑產品及耗材 同源重組試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性核酸內切酶購自寶日醫(yī)生物技術有限公司；胎牛血清FBS、高糖培養(yǎng)基DMEM和磷酸鹽緩沖液PBS購自以色列Biological Industries公司；LipofectamineTM3000 reagent轉染試劑購自賽默飛世爾科技有限公司；無內毒素質粒小提中量試劑盒購自天根生化科技有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；高效RIPA組織/細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；通用RNA提取試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自翌圣生物科技股份有限公司；鼠源單克隆抗體購自美國優(yōu)寧維生物有限公司等。

1.1.3 主要儀器 QuantStudio 5熒光定量PCR儀、NanoDropTM微量分光光度計、細胞培養(yǎng)箱、細胞計數(shù)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；凝膠電泳成像系統(tǒng)、紅外雙色激光成像系統(tǒng)(香港基因有限公司)；倒置熒光顯微鏡(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海智城儀器有限公司)；核酸膠電泳儀(美國Bio-Rad公司)；流式細胞儀(貝克曼庫爾特商貿有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 THBS1慢病毒過表達載體的構建 根據NCBI發(fā)布的犬THBS1(GenBank登錄號：XM_038441944.1)的序列及慢病毒質粒的序列，采用同源重組方法，設計THBS1基因全長CDS區(qū)的擴增引物，CDH-THBS1-F:5′-gacaagggtaccccgctcgag-ATGGGGCTGGCCTGGGCA-3′，pCDH-THBS1-R:5′-gatccttgcggccgcggatccTTAGGAATCTCTGCATTCGTATTTCA-3′，序列小寫部分是5′端添加的質粒重組序列，下劃線部分分別是XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點，引物由天一輝遠基因科技有限公司合成。以犬乳腺腫瘤細胞CHMp提取的RNA反轉錄成cDNA作為模版進行PCR擴增，以獲得THBS1基因。使用限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ對慢病毒質粒進行雙酶切后，根據同源重組試劑盒將目的片段與慢病毒載體連接。將同源重組產物轉化入DH5α感受態(tài)細胞，在氨芐抗性瓊脂培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)后進行菌液PCR鑒定，選取結果為陽性的菌液樣品送測序，測序結果正確的重組質粒命名為pCDH-THBS1。

1.2.2 慢病毒包裝、感染及藥物篩選穩(wěn)定細胞系 將pCDH-THBS1質粒、pMD2.G質粒、PsPaX2質粒按3∶2∶2的比例用LipofectamineTM3000試劑共轉染到HEK293T細胞中進行慢病毒包裝。轉染48 h后收集慢病毒液感染CHMp細胞。用不同終濃度(1、2、4、6、8、10、12 μg·mL-1)嘌呤霉素篩選CHMp細胞的嘌呤霉素最適殺滅濃度，培養(yǎng)48 h后細胞基本死光的最低濃度即為嘌呤霉素最適篩選濃度。向感染慢病毒的CHMp細胞中加入篩選好濃度的嘌呤霉素，進行篩選直至CHMp細胞基本不死亡，篩選得到的THBS1慢病毒過表達細胞系命名為THBS1-CHMp、慢病毒空載細胞系命名為pCDH-CHMp。

1.2.3 靶向THBS1的沉默載體構建 根據犬的THBS1基因序列，設計靶向THBS1基因的特異寡肽核苷酸序列引物，同時設計了一條非特異的對照序列，具體序列如表1。將合成的寡核苷酸序列通過PCR反應生成雙鏈核苷酸延伸物：配制正反義鏈核苷酸各2 μL、10xDNA連接酶buffer 5 μL和ddH2O 41 μL的體系，在PCR儀中設置相應程序進行連接反應，反應程序：1)95 ℃反應10 min；2)從95 ℃開始每8 s下降0.1 ℃，進行700個循環(huán)；3)得到核苷酸延伸物。使用內切酶BglⅡ和HindⅢ對沉默質粒進行雙酶切后與核苷酸延伸物進行連接，得到沉默重組質粒。

表1 靶向THBS1基因的寡核苷酸序列

1.2.4 沉默重組質粒的鑒定及轉染 得到的重組質粒轉化入感受態(tài)細胞，在氨芐抗性培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，取陽性單菌落進行增殖培養(yǎng)后，提取重組質粒。使用EcoRI和XhoI內切酶對沉默重組質粒進行鑒定，將酶切鑒定為陽性的重組質粒進行測序，將序列正確的重組質粒用LipofectamineTM3000試劑共轉染到CHMp細胞中，得到shRNA-THBS1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細胞系。

1.2.5 CCK-8試驗檢測THBS1對CHMp細胞增殖能力的影響 取生長狀態(tài)良好的細胞，將細胞密度稀釋至1×103·100 μL-1，接種于 96 孔細胞培養(yǎng)板，設置3個重復組，以接種細胞的時間定位為0 h，向細胞培養(yǎng)板中每孔加入10 μL的CCK Solution，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，用酶標儀在450 nm波長處檢測OD值。每隔24 h，重復上述操作，直至72 h，以時間(h)為橫坐標，細胞OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，并根據公式：[(試驗孔—空白孔)/(對照孔—空白孔)]×100%，計算各個細胞的存活率。

1.2.6 劃痕試驗檢測THBS1對CHMp細胞遷移能力的影響 將細胞密度稀釋成1×106·孔-1，接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞密度達到80%～90%時，用10 μL槍頭垂直于背面所畫的橫線，對貼壁細胞進行劃痕，然后用PBS將劃痕劃下的細胞洗滌干凈，在顯微鏡下拍照。加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞，分別在12和24 h后再次拍照，結果用Image J軟件分析細胞遷移的面積，通過細胞遷移面積的變化判斷THBS1對CHMp細胞遷移能力的影響。

1.2.7 Transwell試驗檢測THBS1對CHMp細胞侵襲能力的影響 往Transwell小室中央加入60 μL稀釋好的基質膠，將Transwell小室置于恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行風干，待Matrigel基質膠凝固后，將小室中的殘余液體吸出，往小室中加入200 μL稀釋好的細胞懸液(5×105·mL-1)。在24孔板中加入500 μL完全培養(yǎng)基，然后將 Transwell小室放入24孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。經過漂洗、固定、染色液后。用棉簽輕輕擦去小室內膜上未侵襲成功的細胞，在顯微鏡下觀察濾膜底附著的細胞數(shù)并拍照，選取5個視野進行計數(shù)，取平均值進行統(tǒng)計學分析。

1.2.8 THBS1對CHMp細胞的細胞周期的影響 將細胞密度稀釋成1×106·孔-1，接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞密度達到80%～90%時，參照細胞周期檢測試劑盒收集細胞，進行細胞固定、碘化丙啶染色液的配制及染色，最后通過流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光，采用FlowJo軟件分析細胞DNA含量情況。

1.2.9 THBS1對CHMp細胞的細胞凋亡的影響 參照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，使用原位熒光檢測方法，將細胞懸液的密度稀釋成5×105·mL-1，接種于48孔細胞培養(yǎng)板，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入195 μL Annexin V-FITC結合液和5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。再加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕晃動混勻，室溫避光孵育20 min，置于冰浴中，隨即在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.10 qRT-PCR檢測THBS1對細胞凋亡相關因子的mRNA表達量的影響 提取各個細胞的總RNA，將RNA反轉成cDNA，qRT-PCR檢測Bcl-2、Bax和p53 3種因子的mRNA，以ACTB基因作為內參基因，各因子的引物序列如表2，反應條件：1)95 ℃預變性30 s；2)循環(huán)反應：95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；3)熔解曲線：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。每個樣品做3個重復，使用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。

表2 qRT-PCR所用的引物

1.2.11 Western blot檢測THBS1對細胞凋亡相關蛋白表達量的影響 提取細胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，加入 SDS上樣緩沖液，用沸水煮樣10 min，冷卻至室溫后進行SDS-PAGE電泳，然后進行轉膜，經過洗膜、封閉、孵育鼠源單克隆抗體、回收抗體、洗膜、孵育抗鼠二抗等操作后，進行Western blot分析Bcl-2、Bax、和P53蛋白的表達量。Western blot的結果通過Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，根據目的蛋白條帶的灰度值與內參蛋白條帶的灰度值的比值算出相對表達量。

2 結 果

2.1 THBS1過表達細胞系及沉默表達細胞系的構建

對CHMp細胞的嘌呤霉素最適殺滅濃度進行篩選得出最適篩選濃度為4 μg·mL-1。慢病毒液感染CHMp細胞后，用最適濃度的嘌呤霉素進行篩選得到慢病毒穩(wěn)定過表達細胞系。將靶向THBS1基因的核苷酸延伸物與沉默質粒進行連接，使用雙酶切方法對沉默重組質粒進行鑒定，結果如圖1，陽性重組質粒雙酶切后，在約281 bp大小處有條帶，符合陽性重組沉默質粒雙酶切后的目的條帶；而沉默空載質粒雙酶切后大約在1 200 bp有條帶，在約281 bp大小處的沒有條帶。將沉默重組質粒轉染進CHMp細胞得到THBS1沉默表達細胞系。

M. DS 2000 DNA Marker；1. shRNA-THBS1；2. shRNA-NC；3. pSuper.Retro.Neo+GFP質粒M. DS 2000 DNA Marker; 1. shRNA-THBS1; 2. shRNA-NC; 3. pSuper.Retro.Neo+GFP plasmid圖1 雙酶切法鑒定沉默重組質粒Fig.1 Identification of silent recombinant plasmids by double-enzyme digestion

2.2 CCK-8試驗檢測THBS1對CHMp細胞增殖能力的影響

通過連續(xù)4 d的檢測，用測量的OD值變化以及細胞存活率反映細胞的增殖情況，繪制細胞生長曲線如圖2A所示，細胞存活率如圖2B所示：在第3天檢測的細胞OD值中，過表達組THBS1-CHMp細胞的OD值和存活率極顯著(P<0.01)高于CHMp和pCDH-CHMp細胞，表明在THBS1過表達的CHMp細胞中，細胞的增殖能力明顯增強；而沉默組shRNA-THBS1-CHMp細胞的OD值和存活率明顯低于CHMp和shRNA-NC-CHMp細胞(P<0.01)，表明在沉默THBS1表達的CHMp細胞中，細胞的增殖能力明顯減弱。

2.3 劃痕試驗檢測THBS1對CHMp細胞遷移能力的影響

各個細胞劃痕后的橫向遷移結果如圖3A和3B所示。通過Image J軟件分析各個細胞劃痕后的橫向遷移面積的變化，結果如圖3C所示：在THBS1過表達組中，劃痕間隔12 h后，THBS1-CHMp細胞的橫向遷移面積與CHMp和pCDH-CHMp細胞相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，在劃痕間隔24 h后，THBS1-CHMp細胞的橫向遷移面積明顯大于CHMp和pCDH-CHMp細胞(P<0.01)；在THBS1沉默表達組中(3D圖)，劃痕間隔12和24 h后測量shRNA-THBS1-CHMp細胞的橫向遷移面積均顯著小于CHMp和shRNA-NC-CHMp細胞的橫向遷移面積(P<0.05,P<0.01)。

A.5種細胞的細胞生長曲線；B.5種細胞的細胞存活率。*.P<0.05, **.P<0.01,***.P<0.01,下同A.Cell growth curves of five types of cells; B.Cell surviving rate of five types of cell. *.P<0.05, **.P<0.01,***.P<0.01, the same as below圖2 THBS1對CHMp細胞增殖能力的影響Fig.2 The effect of THBS1 on the proliferation ability of CHMp cells

A.過表達組細胞劃痕后鏡下圖(100×)；B.沉默表達組細胞劃痕后鏡下圖(200×)；C.過表達組細胞劃痕后的遷移面積；D.沉默表達組細胞劃痕后的遷移面積A.The micrograph of the cells in the overexpression group after scratching (100×); B. The micrograph of the cells in the silenced expression group after scratching (200×); C. The migration area of cells in overexpression group after scratching; D. The migration area of cells in the silenced expression group after scratching圖3 細胞劃痕試驗的結果Fig.3 Results of cell scratch test

2.4 Transwell試驗檢測THBS1對CHMp細胞侵襲能力的影響

在顯微鏡下觀察各個細胞系侵襲的細胞數(shù)，結果如圖4A、4B所示。選取5個視野進行計數(shù)和統(tǒng)計學分析，結果如圖4C所示：過表達組THBS1-CHMp細胞的侵襲數(shù)量均明顯多于CHMp細胞和pCDH-CHMp細胞(P<0.01)；而沉默組shRNA-THBS1-CHMp細胞的侵襲數(shù)量均明顯少于CHMp和shRNA-NC-CHMp細胞(P<0.05)。

2.5 流式細胞術檢測THBS1對CHMp細胞周期的影響

細胞周期分布情況結果如圖5A～F所示。將每種細胞的3個重復按G0/G1期、S期、G2/M期進行統(tǒng)計學分析，結果如圖5G所示：在THBS1過表達組中，THBS1-CHMp細胞在G0/G1期的細胞數(shù)量的占比百分量均顯著少于CHMp細胞和pCDH-CHMp細胞在G0/G1期的細胞數(shù)量的占比百分量(P<0.01)，而THBS1-CHMp細胞的S期和G2/M期細胞數(shù)量的占比百分量卻明顯多于對照組和空載對照組(P<0.01)；在沉默THBS1表達組中，shRNA-THBS1-CHMp細胞在G0/G1期細胞數(shù)量的占比百分量均顯著多于對照組CHMp細胞和空載組shRNA-NC-CHMp細胞(P<0.01)，而shRNA-THBS1-CHMp細胞的S期和G2/M期細胞數(shù)量的占比百分量均顯著少于對照組和空載對照組(P<0.01)。

A.過表達組細胞侵襲鏡下圖(200×)；B.沉默表達組細胞侵襲鏡下圖(200×)；C.各細胞侵襲能力的比較A. Invasion microscope of cells in overexpression group (200×); B. Invasion microscope of cells in the silenced expression group (200×); C. Comparison of the invasive ability of each cell圖4 Transwell試驗檢測THBS1對CHMp細胞侵襲能力的影響Fig.4 Transwell assay detects the effect of THBS1 on the invasive ability of CHMp cells

A～C.過表達組細胞周期分布情況；D～F.沉默表達組細胞周期分布情況；G.5種細胞的周期分布情況比較A-C. Cell cycle distribution in overexpression group; D-F. Cell cycle distribution of silent expression group; G. Comparison of cycle distribution of five types of cells圖5 流式細胞術檢測THBS1對CHMp細胞周期的影響Fig.5 The effect of THBS1 on the cell cycle of CHMp detected by flow cytometry

2.6 THBS1對CHMp細胞凋亡的影響

通過Annexin V-FITC和碘化丙啶雙染處理細胞，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況如圖6A所示，綠色熒光：Annexin V-FITC染色陽性細胞；紅色熒光：PI染色陽性細胞。進行統(tǒng)計學分析的結果如圖6B所示：過表達組THBS1-CHMp細胞的細胞凋亡數(shù)量均明顯少于對照組CHMp細胞和空載組pCDH-CHMp細胞(P<0.01)；而沉默試驗組shRNA-THBS1-CHMp細胞的細胞凋亡數(shù)量均明顯多于CHMp和shRNA-NC-CHMp細胞(P<0.01)。

2.7 qRT-PCR檢測與細胞凋亡相關因子的mRNA表達量

為了進一步探討THBS1在細胞凋亡方面的調控作用，采用qRT-PCR方法檢測了p53、Bcl-2和Bax的mRNA表達量，結果如圖7所示：過表達試驗組THBS1-CHMp細胞的p53和Bcl-2 mRNA表達量均明顯增高，結果均具有顯著性差異(P<0.01)，而Bax mRNA的表達量明顯減少(P<0.01)；在沉默試驗組shRNA-THBS1-CHMp細胞中，p53 mRNA和Bcl-2 mRNA的表達量均明顯減少(P<0.01)，而Bax mRNA的表達量明顯增加(P<0.01)。

2.8 Western blot檢測與細胞凋亡相關蛋白的表達量

Western blot方法檢測p53、Bcl-2和Bax蛋白表達量的結果如圖8A所示。通過Image J軟件對Western blot的結果進行灰度值分析，以GAPDH作為內參蛋白，對p53、Bcl-2和Bax蛋白進行相對表達量的分析，結果如圖8B所示：過表達試驗組THBS1-CHMp細胞的p53 和Bcl-2 蛋白表達量均明顯增高(P<0.01)，而Bax 蛋白的表達量明顯減少(P<0.01)；在沉默試驗組shRNA-THBS1-CHMp細胞中，p53 和Bcl-2 蛋白的表達量均明顯減少(P<0.01)，而Bax蛋白的表達量明顯增加，結果具有顯著性差異(P<0.01)。

A. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色效果圖(100×)；B. 凋亡情況的比較A. The staining effect of Annexin V-FITC and propidium iodide (PI)(100×); B. Comparison of apoptosis of various cells圖6 THBS1對CHMp細胞凋亡的影響Fig.6 The effect of THBS1 on apoptosis of CHMp cells

圖7 qRT-PCR檢測與細胞凋亡相關因子的mRNA表達量Fig.7 mRNA expression of apoptosis-related factors detected by qRT-PCR

3 討 論

近年來，隨著犬數(shù)量的增多，犬乳腺腫瘤病例中出現(xiàn)的頻率越來越高，該病也得到了寵物主人和寵物醫(yī)生的密切關注。目前，獸醫(yī)技術水平發(fā)展有限，也反映出相關科學巨大的研究空間[9]。THBS1作為一種細胞膜表面的黏附蛋白，通過影響腫瘤微環(huán)境從而影響多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[10]?；赥HBS1與犬乳腺腫瘤的關系未知，研究THBS1對犬乳腺腫瘤的影響具有重要意義，為研究THBS1對犬乳腺腫瘤細胞CHMp的影響提供了材料和平臺，同時為犬乳腺腫瘤的其他分子機制研究提供了參考。

3.1 THBS1對犬乳腺腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

犬乳腺腫瘤發(fā)展的過程表現(xiàn)出細胞無序地增殖，即細胞的增殖能力變強，細胞瘋狂地增殖以滿足腫瘤塊的生長和腫瘤微環(huán)境的形成。研究表明，犬乳腺腫瘤往往會表現(xiàn)出遷移性，根據腫瘤的分級，惡性腫瘤還表現(xiàn)出明顯的侵襲性，利于腫瘤在機體內的發(fā)展[11-13]。據報道，THBS1可以促進癌細胞遷移，參與腫瘤的血管形成，與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[14-15]。本研究在細胞水平上探討了THBS1對犬乳腺腫瘤細胞生物學功能的影響。通過CCK-8試驗和平板克隆形成試驗、劃痕試驗、Transwell試驗發(fā)現(xiàn)，過表達THBS1能有效促進犬乳腺腫瘤細胞CHMp的增殖、遷移、侵襲，而沉默THBS1表達能有效抑制CHMp細胞的增殖、遷移、侵襲。本研究結果與其他人報道THBS1在其他腫瘤上的作用相一致，也證明了THBS1在犬乳腺腫瘤上的潛在作用[6,16]。綜上表明，THBS1能夠影響犬乳腺腫瘤細胞CHMp的增殖、遷移、侵襲生物學功能，進而表明THBS1潛在參與影響犬乳腺腫瘤進展。

A.Western blot檢測與細胞凋亡相關蛋白的表達量(1.THBS1-CHMp；2.pCDH-CHMp；3.CHMp；4.shRNA-NC-CHMp；5.shRNA-THBS1-CHMp)；B.各細胞中凋亡相關蛋白的表達量比較A. Western blot detects the expression of apoptosis-related proteins (1. THBS1-CHMp; 2. pCDH-CHMp; 3. CHMp; 4. shRNA-NC-CHMp; 5. shRNA-THBS1-CHMp)； B. Comparison of the expression levels of apoptosis-related proteins in various cells圖8 THBS1對CHMp細胞凋亡相關蛋白表達量的影響Fig.8 The effect of THBS1 on the expression of apoptosis-related proteins in CHMp cells

3.2 THBS1對犬乳腺腫瘤細胞CHMp細胞周期的影響

在正常的細胞周期中，細胞在G0/G1期會進行大量的物質合成，為DNA的合成做準備，在S期開始合成DNA和組蛋白，細胞在G2/M期DNA復制結束并且處于有絲分裂之間的間隙，即根據細胞S+M時期的百分比就可以判斷處理后的細胞增殖能力。而腫瘤的形成是一種無序生長的過程，其細胞周期分布受到影響，進而影響細胞的DNA合成，最終導致細胞增殖特性的改變而影響腫瘤的發(fā)展[17-18]。本研究通過流式細胞術檢測細胞周期，得出在THBS1過表達的CHMp細胞中G0/G1期的細胞百分比明顯減少，S期+G2/M期的細胞百分比增加；而沉默THBS1表達后CHMp細胞在G0/G1期的細胞百分比明顯增多，S期+G2/M期的細胞百分比減少。細胞的S期+G2/M期是DNA合成的關鍵時期，這個時期被阻斷，或者細胞周期停滯在G0/G1期，表明正常的細胞周期被破壞，即THBS1能夠影響犬乳腺腫瘤細胞CHMp的細胞周期分布，進而影響犬乳腺腫瘤細胞CHMp的增殖特性，最終影響腫瘤的形成。

3.3 THBS1對犬乳腺腫瘤細胞凋亡的影響

在腫瘤進展中，細胞促凋亡基因和抑凋亡基因的表達往往出現(xiàn)異常，進而導致相關凋亡信號通路受到抑制。本研究通過原位熒光檢測發(fā)現(xiàn)在THBS1過表達的CHMp細胞中，凋亡細胞的數(shù)量明顯減少；而在沉默THBS1表達的CHMp細胞中，凋亡細胞的數(shù)量明顯增多。Bcl-2、Bax和p53是與細胞凋亡相關的研究熱點分子，在癌細胞凋亡方面起著重要作用，p53基因還具有幫助細胞基因修復缺陷的功能，這點在腫瘤中表現(xiàn)最明顯，是機體維持自身基因復制穩(wěn)定的關鍵[19-20]。本研究通過qRT-PCR和Western blot試驗進一步探討THBS1的異常表達對細胞凋亡相關因子表達影響，發(fā)現(xiàn)THBS1過表達后，CHMp細胞中p53和Bcl-2的表達量均明顯增高，而Bax的表達量明顯減少；在沉默THBS1后，CHMp細胞中p53和Bcl-2的表達量均明顯減少，而Bax的表達量明顯增加。表明THBS1的異常表達會影響CHMp細胞中p53、Bcl-2和Bax表達量，這與前人在相關癌癥上的報道相一致。即THBS1通過調控細胞凋亡相關因子的表達進而影響凋亡相關通路，在犬乳腺腫瘤發(fā)揮重要作用，最終導致腫瘤的形成。以上結果與前面的犬乳腺腫瘤細胞生物學功能和細胞周期的檢測結果相符，更加證明了THBS1在參與犬乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展方面的重要作用。

4 結 論

本研究證實了THBS1的異常表達能夠影響犬乳腺腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲、細胞周期以及細胞凋亡。此外，THBS1異常表達可以調控細胞凋亡關鍵因子p53、Bcl-2和Bax的表達，進而調控犬乳腺腫瘤的細胞凋亡通路，最終影響犬乳腺腫瘤的發(fā)展。