王 斐，楊 潔，呂慶杰，王米雪，劉 鵬，張若愚，史聰聰，王雪瑩，林 琳，華 琳，宋文博，梁 婉，陳煥春，吳 斌*，彭 忠,3*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070； 3.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)是一種重要的革蘭陰性呼吸道病原菌，能感染多種動(dòng)物及人，主要引起呼吸道疾病和出血性敗血癥[1]。Pm毒力因子眾多，已被報(bào)道的毒力因子包括莢膜、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、黏附因子、毒素、鐵代謝相關(guān)蛋白、唾液酸代謝酶、透明質(zhì)酸酶、外膜蛋白等[1-2]。根據(jù)編碼莢膜或LPS基因的不同，Pm可被分為A、B、D、E、F 5種莢膜基因型或L1～L8 8種LPS基因型[3-4]。此外，多序列位點(diǎn)分型(multilous sequence typing，MLST)也常被用于Pm的分型[1]。在臨床上常將上述3種分型系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用(表示為“莢膜：LPS：MLST 基因型”)用來對(duì)Pm臨床分離菌株進(jìn)行分型，以便更好地闡述不同宿主中分離的Pm的基因型特征[1]。

豬是Pm的重要宿主之一[5]。Pm一般定植于豬上呼吸道(如鼻腔和氣管)，主要引起豬群發(fā)生萎縮性鼻炎、肺炎、氣管炎和支氣管炎等呼吸道疾病[6]。臨床上也偶有Pm引起豬出血性敗血癥的病例報(bào)道，但不多見[5]。除了上述疾病外，目前鮮見Pm感染引起豬群其他疾病尤其是腦膜炎的報(bào)道。本研究從山東某豬場(chǎng)1頭表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀并診斷為腦膜感染的病豬腦組織中分離出1株P(guān)m，命名為SD001。本研究針對(duì)SD001的生物學(xué)特征進(jìn)行研究，并利用納米孔技術(shù)進(jìn)行全基因組測(cè)序，明確其基因組特征，為進(jìn)一步探究Pm引起腦膜炎的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究中使用的參考菌株包括多殺性巴氏桿菌HN07(GenBank登錄號(hào)：CP007040)，Pm-P1(莢膜A型)和Pm-G1(莢膜A型)，均由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。其中，HN07是1株典型的肺炎型Pm[7]，而Pm-P1和Pm-G1則分別分離自因敗血癥死亡的病豬的脾組織和肝組織。胰蛋白大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。新生牛血清(NBS)購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司。RAW264.7細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 病例描述

2020年3月，山東某養(yǎng)豬場(chǎng)，育肥欄豬出現(xiàn)咳嗽氣喘, 呼吸困難, 后發(fā)展為神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為肌肉震顫、后腿不穩(wěn)、臥倒劃動(dòng)。病期用氨芐青霉素、鏈霉素等藥治療效果不佳。對(duì)發(fā)病嚴(yán)重的3頭豬進(jìn)行了剖檢, 其主要病變?yōu)榇竽X水腫腫脹，軟腦膜明顯充血。

1.3 病原菌的分離和鑒定

采集有神經(jīng)癥狀死亡豬的腦樣品于第一時(shí)間冰浴運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測(cè)。檢測(cè)對(duì)象為常見的可能引起神經(jīng)感染的病原，包括偽狂犬病病毒(PRV)、日本腦炎病毒(JEV)、豬瘟病毒(CSFV)、鏈球菌(Ss)、副豬嗜血桿菌(Hps)等。PRV、JEV、CFSV病原檢測(cè)分別參考GB/T 35911—2018、SN/T 2067—2008、GB/T 16551—2020。病原菌的分離、純化和鑒定參照美國(guó)微生物學(xué)會(huì)出版的《Manual of Clinical Microbiology》(第12版)進(jìn)行，即在生物安全柜中利用無菌接種環(huán)將腦組織內(nèi)部未與外部環(huán)境接觸的部位劃線接種至含有10 μg·mL-1NAD及5% NBS的TSA平板上，然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h。待長(zhǎng)出菌落后注意肉眼觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小、光澤度，同時(shí)盡可能挑取不同形態(tài)、大小和光澤度的單菌落接種至含有10 μg·mL-1NAD及5% NBS的TSB中，置于37 ℃、180 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)至渾濁。隨后以菌液為模板，利用細(xì)菌的16S rRNA基因通用引物(F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送往武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，從而確定細(xì)菌的種屬。Pm鑒定：進(jìn)一步通過種屬特異性基因kmt1進(jìn)行確認(rèn)，引物序列及PCR反應(yīng)條件參考已有報(bào)道[3]；同時(shí)根據(jù)該報(bào)道進(jìn)行Pm莢膜基因型的鑒定。

1.4 一步生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)

挑取Pm單菌落至含有5%新生牛血清的TSB中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整菌液OD600 nm至0.6，將菌液分別按照1∶100體積比轉(zhuǎn)接至含有5% NBS的TSB培養(yǎng)基中，使用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀(Oy Growth Gurves Ab Ltd)進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定。

1.5 血清殺菌試驗(yàn)

從Pm陰性的3～4周齡的健康豬群采集血液，置于4 ℃過夜析出血清。取上清，經(jīng)3 000 r·min-1離心10 min后，以0.22 μm 濾器過濾。制備好血清后，將部分血清56 ℃作用30 min滅活。將Pm在含5%血清的TSA平板上劃線培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落后，以2 mL 0.01 mol·L-1無菌PBS洗脫菌落，調(diào)整細(xì)菌的濃度為1×107CFU·mL-1。隨后，分別取800 μL正常血清和滅活血清加入到1.5 mL無菌離心管中，同時(shí)取200 μL菌液加入與血清充分混合，將混合液于37 ℃作用 60 min后，冰浴10 min 終止反應(yīng)，進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，取適當(dāng)?shù)南♂尪韧科矫笥?jì)數(shù)，計(jì)算 CFU。每組做3個(gè)重復(fù)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)兩次。最終結(jié)果以存活率=[正常血清中的菌量(CFU·mL-1)]/[滅活血清中的菌量(CFU·mL-1)]×100%來表示。

1.6 細(xì)胞內(nèi)存活試驗(yàn)

使用小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)作為試驗(yàn)細(xì)胞。將含菌液的細(xì)胞培養(yǎng)基加入細(xì)胞長(zhǎng)成單層的 6孔板中，每孔的細(xì)胞數(shù)在 106左右。將細(xì)胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)到 37 ℃培養(yǎng)，分別培養(yǎng)1、2、3 h后，以PBS輕洗細(xì)胞5遍，移去未結(jié)合的細(xì)菌。加入含卡那霉素(終濃度 100 ng·μL-1)的1640細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，于4 ℃靜置 30 min殺死結(jié)合在細(xì)胞表面的細(xì)菌。以 PBS 輕洗細(xì)胞5遍，洗去抗生素及死菌，利用1 mL預(yù)冷的ddH2O裂解細(xì)胞10 min，倍比稀釋后取適當(dāng)稀釋度涂平板計(jì)數(shù)。最終結(jié)果以存活率=[胞內(nèi)菌量(CFU)]/[接種菌量(CFU)]×100%來表示。

1.7 納米孔測(cè)序(ONT sequencing)和生物信息學(xué)分析

挑取Pm單菌落接種至含有5% NBS的TSB中，置于37 ℃、180 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)至渾濁。利用商業(yè)化的QIAamp DNA minikit(Qiagen, Hilden, Germany)試劑盒參照說明書的步驟提取基因組。經(jīng)濃度為0.35%瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop分光光度儀(Thermo Fisher Scientific)和Qubit 3.0熒光測(cè)定儀器(Thermo Fisher Scientific)檢測(cè)合格后，利用納米孔測(cè)序公司(ONT)研發(fā)的SQK-LSK109 ligation sequencing kit商業(yè)化試劑盒構(gòu)建大小為20～30 kb的DNA文庫，隨后利用ONT公司研發(fā)的PromethION測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因組重測(cè)序。利用Nanocall軟件(https://github.com/mateidavid/nanocall)以默認(rèn)參數(shù)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行堿基判定(base calling)。ONT測(cè)序共獲得1 131 731 447 bp的原始數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后，獲得1 001 345 400 bp的高質(zhì)量數(shù)據(jù)(Q20, 97.98%; Q30, 94.08%)。所獲得的數(shù)據(jù)利用Canu v1.5 (https://canu.readthedocs.io/en/latest/)組裝，并利用Racon v3.4.3(https://github.com/isovic/racon)和Circlator v1.5.5(https://sanger-pathogens.github.io/circlator/)對(duì)組裝的質(zhì)量進(jìn)行檢查，最終獲得細(xì)菌的全基因組序列。所獲得的序列提交至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為CP090428。

利用Prokka軟件(https://github.com/tseemann/prokka)對(duì)SD001的全基因組進(jìn)行注釋；基于CRISPRfinder(https://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)進(jìn)行CRISPR預(yù)測(cè)；基于IslandViewer 4(https://www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer/)進(jìn)行基因島預(yù)測(cè)；前噬菌體序列通過PHASTER(https://phaster.ca/)進(jìn)行分析；SD001的基因型(莢膜：LPS：MLST基因型)利用作者前期開發(fā)的PmGT在線工具(http://vetinfo.hzau.edu.cn/PmGT/)[8]進(jìn)行確定；毒力基因采用VFDB數(shù)據(jù)庫(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)進(jìn)行分析。利用MAFFT軟件(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)進(jìn)行DNA或氨基酸序列比對(duì)，同時(shí)利用MEGA11軟件(https://www.megasoftware.net/)進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。進(jìn)化樹基于全基因組序列進(jìn)行構(gòu)建，所選的運(yùn)算方法為NJ法，bootstrap值設(shè)定為1 000。多殺性巴氏桿菌HB03(GenBank登錄號(hào)：NZ_CP003328，豬源，莢膜A型，肺炎型)、3480(GenBank登錄號(hào)：NC_017764，豬源，莢膜A型，肺炎型)、ATCC43137(GenBank登錄號(hào)：NZ_CP008918，豬源，莢膜A型，肺炎型)、HN06(GenBank登錄號(hào)：NC_017027，豬源，莢膜D型，萎縮性鼻炎型)、HN07(GenBank登錄號(hào)：NZ_CP007040，豬源，莢膜F型，肺炎型)、Pm70(GenBank登錄號(hào)：NZ_002663，禽源，莢膜F型)的基因組在本研究中作為參考基因組。全基因組比利用BRIG(http://brig.sourceforge.net/)軟件進(jìn)行。

1.8 小鼠感染試驗(yàn)

28只4～5周齡雌性昆明小鼠，分為7組，每組4只，分別通過尾靜脈注射的方式感染Pm，感染劑量為每只小鼠107CFU，具體分組及處理情況如表1所示(12 h感染情況未展示)。感染后2、4、6、12 h后，摘眼球采血并處死小鼠，解剖取腦組織稱重后進(jìn)行勻漿，稀釋后涂板計(jì)數(shù)，測(cè)定組織載菌量(CFU·g-1)。血液通過抗凝管收集，稀釋后涂板計(jì)數(shù)，測(cè)定其載菌量。取腦組織制作組織切片進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

表1 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 多殺性巴氏桿菌SD001的分離鑒定及其在不同條件下的生存能力、生長(zhǎng)比較

針對(duì)腦組織的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果顯示，PRV、JEV、CSFV等均為陰性。腦組織樣品接種至TSA培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，平板上長(zhǎng)出形態(tài)較為相似的菌落。隨機(jī)挑取單菌落經(jīng)16S rRNA測(cè)序后鑒定為Pm，這一結(jié)果隨后通過PCR擴(kuò)增Pm的種屬特異性基因kmt1得到確認(rèn)(圖1A)。隨后，將所分離的Pm命名為SD001。PCR結(jié)果顯示SD001的莢膜基因型為A型(圖1A)。血清殺菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，SD001的抗血清殺菌能力顯著強(qiáng)于豬肺炎型Pm以及豬肝和腎中分離的Pm(圖1B)；胞內(nèi)存活試驗(yàn)顯示SD001在小鼠巨噬細(xì)胞中存活能力也顯著強(qiáng)于豬肺炎型Pm以及豬肝和腎中分離的Pm(圖1C～E)；一步生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)顯示SD001的生長(zhǎng)速度也較豬肺炎型Pm(HN07)以及豬肝(Pm-G1)和脾(Pm-P1)中分離的Pm顯著更快(圖1F)。

A.多殺性巴氏桿菌SD001的PCR鑒定(M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.PCR擴(kuò)增Pm種屬特異性基因，460 bp；2.PCR擴(kuò)增鑒定莢膜A型基因，1 044 bp；3.陰性對(duì)照)；B.不同組織分離的多殺性巴氏桿菌的抗血清殺菌能力；C～E.不同組織分離的多殺性巴氏桿菌在不同時(shí)間點(diǎn)在RAW264.7中的存活能力(C.接種后1 h;D.接種后2 h；E.接種后3 h)；F.不同器官分離的多殺性巴氏桿菌的生長(zhǎng)曲線對(duì)比(**.P<0.01)A. PCR identification of Pasteurella multocida SD001 (M. DL2000 DNA marker; 1. PCR amplifying the species-specific gene of Pasteurella multocida, 460 bp; 2. PCR amplifying the capsular genotype A gene, 1 044 bp; 3. Negative control); B. Anti-serum bactericidal capacity of Pasteurella multocida isolates from different organs of pigs; C-E. Survival bacteria of different Pasteurella multocida strains in RAW264.7 at different time point post inoculation (C. 1 hours post inoculation; D. 2 hours post inoculation; D. 3 hours post inoculation); F. Growth curve of Pasteurella multocida isolates from different organs (**.P<0.01)圖1 致腦膜炎多殺性巴氏桿菌SD001的PCR鑒定及抗血清殺菌能力、胞內(nèi)存活能力及生長(zhǎng)評(píng)估Fig.1 PCR identification of Pasteurella multocida SD001 and evaluation of its anti-serum bactericidal capacity and surviving capacity in RAW264.7 and growth

2.2 多殺性巴氏桿菌SD001的基因組特征

利用納米孔測(cè)序技術(shù)成功獲得了SD001的全基因組序列，結(jié)果顯示，SD001的全基因組大小約為2.45 Mb，平均GC含量為40.25%(圖2)。

圖2 多殺性巴氏桿菌SD001的全基因組環(huán)狀圖Fig.2 Circle map of the complete genome of Pasteurella multocida SD001

未發(fā)現(xiàn)SD001攜帶有游離質(zhì)粒。經(jīng)Prokka軟件注釋后，SD001全基因組含有2 399個(gè)基因，編碼2 281個(gè)蛋白以及57個(gè)tRNA、19個(gè) rRNA和1個(gè)tmRNA。SD001基因組中含有2條CRISPR結(jié)構(gòu)，5個(gè)基因島，7條前噬菌體序列。毒力基因預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，SD001含有233個(gè)毒力基因，其中，24個(gè)毒力基因位于基因島中。利用PmGT基于全基因組序列對(duì)SD001分型，結(jié)果顯示，SD001為莢膜：LPS：MLST 基因型A: L6: ST10。遺傳進(jìn)化分析顯示，SD001與其他豬源Pm的親源關(guān)系較近(圖3A)。全基因組比對(duì)的結(jié)果顯示相對(duì)于豬肺炎型Pm(HB03、3480、ATCC 43137、HN07)和豬萎縮性鼻炎型Pm(HN06)的基因組而言，SD001的基因組中存在3個(gè)大的特異性區(qū)域，其中區(qū)域I為Mu噬菌體編碼區(qū)，區(qū)域II主要編碼和DNA修飾、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制等有關(guān)的蛋白質(zhì)，值得一提的是區(qū)域III；該區(qū)域編碼1個(gè)表面脂蛋白裝配修飾器(surface lipoprotein assembly modifier, SLPAM)、1個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白類似溶質(zhì)結(jié)合蛋白(transferrin-binding protein like solute binding protein, TBPLSBP)以及1個(gè)TonB依賴受體(TonB-dependent receptor, TDR)(圖3B)。

A. 不同多殺性巴氏桿菌的遺傳進(jìn)化分析；B. 不同組織分離的豬多殺性巴氏桿菌的比較基因組學(xué)分析A. Phylogenetic relationships of different Pasteurella multocida strains; B. Comparisons of the whole genome sequences of different Pasteurella multocida isolates from pigs圖3 多殺性巴氏桿菌SD001的遺傳進(jìn)化及比較基因組學(xué)分析Fig.3 Phylogenetic and comparative genomics analyses of Pasteurella multocida SD001

2.3 多殺性巴氏桿菌SD001引起小鼠腦膜炎的能力

小鼠試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)尾靜脈感染后在相同的時(shí)間點(diǎn)，SD001在小鼠腦組織和血液中的載量均顯著高于豬肺炎型Pm(圖4)；腦組織切片觀察結(jié)果顯示，SD001感染的小鼠腦組織相對(duì)于對(duì)照小鼠的腦組織而言，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、出血等病理變化(圖5)；同時(shí)從小鼠腦組織中也分離出了Pm。上述結(jié)果表明，SD001經(jīng)血液感染后可以突破血腦屏障，定植于小鼠腦組織中并引起腦膜炎。

A.感染12 h細(xì)菌載量；B.血液載菌量；C.腦組織載菌量?！? SD001；▼. HN07A. Bacterial load at 12 h post infection; B. Bacterial load in blood; C. Bacterial load in brain. ●. SD001；▼. HN07圖4 多殺性巴氏桿菌SD001和HN07經(jīng)尾靜脈感染小鼠后在血液和腦組織中的載菌量Fig.4 Bacterial load of Pasteurella multocida SD001 and HN07 in mouse blood and brain after challenging via tail vein

A.SD001感染小鼠的腦組織切片；B. PBS感染小鼠的組織切片A. Pathological damages in brain of the mice challenged with SD001； B. Pathological damages in brain of the mice challenged with PBS圖5 多殺性巴氏桿菌SD001感染小鼠及PBS感染小鼠的腦組織切片(400×)Fig.5 Pathological damages in brain of the mice challenged with Pasteurella multocida SD001 and PBS (400×)

3 討 論

作為一種呼吸道病原菌，Pm在體內(nèi)主要定植于上呼吸道，呼吸系統(tǒng)器官尤其是肺是Pm的主要靶器官[5-6]。然而，本研究從山東地區(qū)1頭具有神經(jīng)癥狀的豬腦組織中分離出了1株P(guān)m。2020年，印度學(xué)者首次報(bào)道了Pm引起豬的神經(jīng)系統(tǒng)感染，并在實(shí)驗(yàn)室中首次用小鼠模型證實(shí)了Pm可以侵入神經(jīng)系統(tǒng)造成感染[9]。通過查閱文獻(xiàn)得知，國(guó)內(nèi)目前還未見類似的報(bào)道。進(jìn)一步通過查閱文獻(xiàn)得知，在獸醫(yī)領(lǐng)域也有Pm引起兔和牛腦部感染的報(bào)道[10-11]。而在人醫(yī)領(lǐng)域Pm引起病人腦部感染的案例報(bào)道相對(duì)較多[12-15]。人醫(yī)臨床上更是有人員因接觸過豬而發(fā)生Pm感染腦部的報(bào)道[13]。以上結(jié)果表明，雖然Pm在臨床上引起人和動(dòng)物腦部感染的病例盡管不多見，但是也絕非個(gè)案，在細(xì)菌性腦膜炎的臨床診斷中應(yīng)該將Pm感染的可能性納入。此外，Pm可能導(dǎo)致的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)引起足夠的重視。

理論上，幾乎所有的致病菌均能引起宿主腦膜炎[16]。然而，在血液中生存、復(fù)制并形成高滴度的菌血癥則有助于病原菌隨血流到達(dá)血腦屏障及細(xì)菌性腦膜炎的發(fā)生[17]。在本研究中，血清殺菌試驗(yàn)的結(jié)果顯示，SD001相對(duì)于豬其他器官中分離的Pm而言具有更強(qiáng)的抗血清殺菌的能力；同時(shí)SD001表現(xiàn)出了更強(qiáng)的胞內(nèi)存活能力、更快的生長(zhǎng)速度。這些結(jié)果提示SD001在血液中具有較強(qiáng)的生存能力，而這也可能是SD001能造成腦內(nèi)感染的原因之一。Pm的基因組大小一般為2.4 Mb，平均GC含量在40.2%左右[1]。從納米孔測(cè)序的結(jié)果看，SD001的全基因大小、平均GC含量、基因組編碼蛋白質(zhì)及RNA的數(shù)目均符合Pm的一般基因組特征。值得一提的是，SD001的基因組中含有較多的基因島和前噬菌體序列。一般而言，基因島常常與病原菌的毒力、耐藥性以及宿主適應(yīng)性有關(guān)，因此在病原菌的致病過程中發(fā)揮著重要的作用[17]，而前噬菌體也有可能參與調(diào)控病原菌中毒力基因的上調(diào)表達(dá)從而影響病原菌的毒力[18-19]。此外，SD001相對(duì)于豬肺炎Pm(HB03、3480、ATCC 43137、HN07)和豬萎縮性鼻炎型Pm(HN06)而言，含有3個(gè)特異性的蛋白，包括1個(gè)表面脂蛋白裝配修飾器(SLPAM)、1個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白類似溶質(zhì)結(jié)合蛋白(TBPLSBP)以及1個(gè)TonB依賴受體(TDR)。SLPAM對(duì)于細(xì)菌編碼表面脂蛋白(SLP)至關(guān)重要，而SLP被證實(shí)能夠促進(jìn)細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附；此外，在腸屏障的細(xì)胞模型中還發(fā)現(xiàn)SLP可以刺激腸上皮細(xì)胞Caco-2中炎癥因子(如IL-8)的產(chǎn)生[20]。TBPLSBP和TDR在Pm的鐵攝取中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用；而鐵攝取被證實(shí)是Pm重要的毒力因子之一，在Pm的環(huán)境適應(yīng)和致病過程中均發(fā)揮著重要的作用[1-2]。SD001特有的上述基因元件及基因可能有利于其能突破BBB進(jìn)入中樞并引起感染。SD001所攜帶的毒力基因中有23個(gè)毒力基因位于基因島。基因分型的結(jié)果顯示SD001的基因型為莢膜：LPS：MLST 基因型A: L6: ST10。根據(jù)已有的報(bào)道，該基因型是我國(guó)豬群中流行的常見基因型[21-22]。此外，在國(guó)外首次關(guān)于Pm引起豬腦膜炎的報(bào)道中，莢膜A型Pm占了較大比重[9]；該型菌株亦引起兔腦膜炎[10]。

在本研究中，SD001在經(jīng)血液感染小鼠后在小鼠血液和腦組織中的載量高于豬肺中分離的Pm，進(jìn)一步表明，SD001能形成一定程度的血流感染。而血流感染被認(rèn)為是細(xì)菌性腦膜炎發(fā)生的重要前提[17]。此外，小鼠試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)SD001經(jīng)血液感染后引起了腦組織中炎癥等病理損傷的發(fā)生。這與國(guó)外的報(bào)道[9]一致，從而再一次提示SD001可以引起宿主發(fā)生腦部感染。

4 結(jié) 論

從1頭表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀的病死豬腦組織中分離鑒定出多殺性巴氏桿菌SD001。體外研究表明，SD001相對(duì)于豬體其他部位分離的Pm而言具有更強(qiáng)的抵抗血清殺菌及吞噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力。小鼠試驗(yàn)表明，SD001經(jīng)血液感染后能在血液中形成高濃度的載量并且可以隨血流到達(dá)小鼠的腦組織，提示SD001能形成一定程度的血流感染；此外，SD001經(jīng)血液感染后能在小鼠腦部造成炎癥。較強(qiáng)的抗血清殺菌能力以及能形成血流感染的能力可能是SD001引起腦部感染的重要原因。本研究是國(guó)內(nèi)首次關(guān)于Pm引起豬腦部感染的報(bào)道。鑒于無論是在人醫(yī)還是獸醫(yī)領(lǐng)域均有Pm引起人和其他動(dòng)物腦部感染的報(bào)道，因此在獸醫(yī)臨床關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的診斷中應(yīng)該納入Pm感染的可能性。