劉志豪，賈 鵬，賴 琦，董利鋒，吳秋玨，高彥華，田忠紅，刁其玉*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所/反芻動物及其幼畜營養(yǎng)代謝中美聯(lián)合研究中心，北京 100081；2.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽 471003； 3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；4.山東銀香偉業(yè)集團有限公司，菏澤 274000)

人類活動向環(huán)境中排放大量的溫室氣體是全球變暖和極端氣候問題的主要原因。溫室氣體主要包括二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)、氧化亞氮(N2O)等[1]，其中CH4的排放量雖然遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CO2，但是造成的危害性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CO2，其增溫趨勢是CO2的28倍[2]。而反芻家畜胃腸道CH4排放是人類農(nóng)業(yè)活動產(chǎn)生的最主要的CH4排放源之一，其約占農(nóng)業(yè)CH4總排放量的59%，約占世界CH4總排放量的 17%，是絕對不可忽視的一大來源[3-4]。反芻動物瘤胃內(nèi)微生物降解生成揮發(fā)性脂肪酸時產(chǎn)生H2和CO2，產(chǎn)甲烷菌可利用H2生成CH4[5]，這部分CH4將造成奶牛6%～10%的能量損失[6]。因此，降低反芻動物瘤胃CH4排放對于節(jié)約飼料能源和減緩全球變暖均有著重要意義。

我國作為奶牛養(yǎng)殖大國，目前奶牛瘤胃CH4排放規(guī)律方面已有大量研究，王貝[7]采用六氟化硫(SF6)示蹤技術(shù)對泌乳早期(391.86 g·d-1)、泌乳中期(399.8 g·d-1)和泌乳后期(395.61 g·d-1)的奶牛瘤胃CH4排放量進行了測定，李斌昌[8]對9月齡(97～118 g·d-1)、12月齡(119～159 g·d-1)、15月齡(194～230 g·d-1)月齡后備奶牛CH4排放量進行了測定，發(fā)現(xiàn)隨著月齡增加，CH4排放量逐漸增加；王小林[9]則對犢牛(130.6 L·d-1)、青年牛(261.7 L·d-1)和干奶牛(340.5 L·d-1)的 CH4排放進行了測定，發(fā)現(xiàn)不同生理階段奶牛隨著年齡和體重增加，CH4排放量極顯著增加。目前，國內(nèi)主流的CH4測定方法為呼吸室測定和SF6示蹤技術(shù)測定，與前兩者相比，GreenFeed測定系統(tǒng)具有自動化、無創(chuàng)、非侵入性的特點，可用于大批量動物的測定，而我國通過GreenFeed測定系統(tǒng)對自然條件下奶牛CH4排放的研究尚處于空白，尤其是對于處于干奶期的不同胎次的荷斯坦奶牛的研究較少。干奶期在奶牛生產(chǎn)過程中至關(guān)重要，此階段牧場往往會調(diào)整飼糧配方，奶牛的采食量也會出現(xiàn)降低，這兩者的變化會對瘤胃內(nèi)溫室氣體排放量產(chǎn)生顯著的影響。假設(shè)干奶牛的CH4排放量隨著胎次和體重的增加而增加，本研究擬通過GreenFeed測定系統(tǒng)，系統(tǒng)測定不同胎次的干奶牛的CH4排放和瘤胃發(fā)酵指標(biāo)，在此基礎(chǔ)上建立瘤胃CH4預(yù)測模型，旨在探究奶牛瘤胃CH4排放規(guī)律，為提高奶牛能量利用效率和開發(fā)減排調(diào)控方法提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

本試驗于2020年10—11月在山東省菏澤市曹縣銀香偉業(yè)公司第三國際牧場完成。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

本試驗選取48頭體況健康，處于干奶期的荷斯坦奶牛，按照胎次將試驗動物分為4個處理組，每組12頭牛，4個處理組如下：一胎牛組、二胎牛組、三胎牛組、四胎及以上組。日糧配方參照NRC(2001)中干奶牛營養(yǎng)需要配置，以全混合日糧(TMR)形式飼喂，日糧的組成及其營養(yǎng)成分見表1。本試驗預(yù)試期5 d，正試期40 d(產(chǎn)前60 d～產(chǎn)前15 d)。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗所有用牛均采用舍飼，每天喂料兩次(07:00和15:00)，自由采食和飲水，每天清理剩料，定期清理水槽，保證飼料和飲水的清潔性。所有奶牛的飼喂方式、飼養(yǎng)環(huán)境和飼糧均保持一致。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 GreenFeed測定系統(tǒng) 該系統(tǒng)由美國某公司研發(fā)，配備有頭室、抽風(fēng)機和顆粒料飼養(yǎng)器，可以在奶牛正常進食條件下，測定奶牛排出的CH4，本研究使用的GreenFeed系統(tǒng)為我國引進的第一套設(shè)備。當(dāng)奶牛采食時，通過激光束保證牛的頭部處于正確位置，抽氣扇以大約20～40 L·s-1的速度從動物的鼻子吸入空氣，系統(tǒng)內(nèi)的非色散紅外分析儀會連續(xù)測量空氣中的CH4濃度，同時測量空氣流量、溫度和相對濕度。每次動物訪問GreenFeed測定系統(tǒng)時，CH4排放量計算公式如下：

CH4volume(L)=visit time (min)[CH4animal (%)-CH4background (%)]×air flow (L·min-1)[10]

式中：CH4volume——奶牛甲烷的排放量；

visit time——動物測定時間；

CH4animal——測定期間甲烷的平均濃度；

CH4background——背景空氣(即測定系統(tǒng)中沒有動物訪問時)的甲烷的平均濃度；

air flow——測定期間氣體的流速；

GreenFeed測定系統(tǒng)收集的數(shù)據(jù)包括動物測定次數(shù)、每次測定時間和持續(xù)時間、背景環(huán)境中的溫度和濕度以及測定時的CH4濃度，并將所獲得數(shù)據(jù)實時上傳至服務(wù)器，由測定系統(tǒng)生產(chǎn)商進行數(shù)據(jù)處理后得到最終的測定結(jié)果。

1.4.2 基本數(shù)據(jù)測定 體重的測定：于正式試驗結(jié)束前5 d，于晨飼前測定每頭奶牛的體重。

干物質(zhì)采食量的測定：在整個試驗期間，每天記錄投料量和剩料量，計算每頭奶牛的日采食量，通過對試驗期間采集日糧的干物質(zhì)含量測定，計算出奶牛每天的干物質(zhì)采食量。

1.4.3 瘤胃液采集與瘤胃發(fā)酵指標(biāo)測定 于正式試驗結(jié)束前3 d，晨飼后3 h通過口腔導(dǎo)管的方式采集瘤胃液樣品，使用便攜式pH計立即測定pH，隨即將所取的瘤胃液樣品用4層紗布過濾后，分裝于2個10 mL離心管，保存于-20 ℃，留待測定揮發(fā)性脂肪酸，氨態(tài)氮和微生物蛋白。

其中揮發(fā)性脂肪酸(VFA)采用氣相色譜儀(6890 N, Agilent，美國)測定。色譜柱為HP19091 N-213型毛細(xì)管柱，進樣口溫度為200 ℃，載氣為高純氮氣，流量為2.0 mL·min-1?；鹧鏆潆x子檢測器的溫度為250 ℃[11]。

氨態(tài)氮(NH3-N)：水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法測定[12]。

微生物蛋白(MCP)：使用嘌呤堿基法進行測定[13]。

1.4.4 瘤胃甲烷排放測定 CH4排放量的測定采用GreenFeed測定系統(tǒng)進行測定。測定過程中，保持每頭牛每天最多可訪問GreenFeed測定系統(tǒng)4次，每天最少訪問2次，每次持續(xù)測量時間在3 min以上，每次訪問間隔6 h。為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，每頭牛需測量30次以上，以其平均值為CH4排放量[14-16]。

1.4.5 飼料樣品的采集與分析 于正試期第15～17天，用四分法采集飼料樣品，于65 ℃烘箱中烘干48 h后，回潮24 h制成風(fēng)干樣，粉碎后過40目網(wǎng)篩留待測定干物質(zhì)(dry matter, DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein, CP)、粗脂肪(ether extract, EE)、粗灰分(Ash)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)和總能(gross energy, GE)，測定方法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[17]。

1.5 統(tǒng)計分析

通過Excel 2020進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(正態(tài)Q-Q圖和正態(tài)P-P圖)和方差齊性檢驗，剔除異常值后進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行差異顯著性分析，采用Pearson相關(guān)分析進行相關(guān)性分析，采用SPSS構(gòu)建線性回歸模型，試驗結(jié)果以P<0.05為差異顯著，以P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 試驗干奶?；倔w況

由表2可知，各個胎次的年齡之間均有顯著差異(P<0.05)，三胎和四胎及以上組干奶牛的體重、代謝體重顯著高于一胎組和二胎組(P<0.05)，而一胎和二胎組之間，三胎和四胎及以上組之間無顯著差異(P>0.05)。試驗干奶牛的體重隨著年齡的增加而增加，代謝體重與體重變化規(guī)律一致，干物質(zhì)采食量的估測數(shù)據(jù)為12.38 kg·d-1。

表2 試驗中干奶?；倔w況

2.2 胎次對干奶牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響

如表3所示，三胎組牛的NH3-N顯著高于一胎組(P<0.05)，與二胎和四胎及以上組之間沒有顯著差異(P>0.05)，一胎、二胎、四胎及以上組的NH3-N也沒有顯著差異(P>0.05)；一胎和二胎牛的瘤胃微生物蛋白顯著高于四胎及以上組(P<0.05)，與三胎組無顯著差異(P>0.05)，一胎和二胎之間，三胎和四胎及以上組之間均無顯著差異(P>0.05)；一胎組瘤胃中戊酸顯著低于三胎組(P<0.05)，與二胎和四胎之間無顯著差異(P>0.05)。此外，瘤胃中pH、TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和乙丙比在各個胎次之間均無顯著差異(P>0.05)。

表3 胎次對干奶牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響

2.3 胎次對瘤胃甲烷產(chǎn)量的影響

由表4可知，干奶牛的CH4排放量的平均值為336 g·d-1，最大值為477 g·d-1，最小值為250 g·d-1，中位數(shù)為334 g·d-1。CH4/代謝體重的平均值為2.31 g·kg-1，最大值為3.04 g·kg-1，最小值為1.86 g·kg-1，中位數(shù)為2.29 g·kg-1。

表4 干奶牛瘤胃甲烷產(chǎn)量

由圖1可知，干奶牛的瘤胃CH4排放量在一胎組最低，三胎和四胎及以上組瘤胃CH4排放量顯著高于一胎組(P<0.05)，二胎、三胎和四胎及以上組之間沒有顯著差異(P>0.05)，一胎組和二胎組之間沒有顯著差異(P>0.05)；各處理組之間的CH4排放量/代謝體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。

*. 表示相關(guān)性顯著(P<0.05)，**表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)*. Indicates significant correlation, ** indicates a extremely significant correlation圖1 胎次對干奶牛甲烷排放量的影響Fig.1 The effect of parity on methane emissions of dry dairy cows

2.4 干奶牛瘤胃甲烷排放量與體況和瘤胃發(fā)酵特征的相關(guān)關(guān)系

由表5可知，干奶牛的CH4排放量與胎次和體重均有著極顯著的相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，而與TVFA、乙酸、丙酸和乙丙比之間沒有顯著的相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。對CH4排放量和體重進行回歸分析可得到方程(圖2)。

表5 干奶牛甲烷排放量與體況及瘤胃發(fā)酵特征的相關(guān)性

圖2 基于體重的干奶牛CH4排放量預(yù)測模型Fig.2 Prediction equations of enteric methane emissions based on body weight

3 討 論

3.1 胎次對干奶牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響

瘤胃pH是反映瘤胃酸堿平衡狀況和瘤胃微生物所處環(huán)境是否正常的重要生理指標(biāo)，正常范圍在6.2～7.0之間[18]，本試驗中各個處理組干奶牛瘤胃pH均處在正常范圍。NH3-N是微生物合成菌體蛋白的前體物質(zhì)，瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮濃度反映瘤胃內(nèi)氮代謝的平衡情況，其質(zhì)量濃度范圍在6.58～36.7 mg·dL-1內(nèi)較佳[19-20]，本試驗各個處理組干奶牛瘤胃NH3-N均在此范圍內(nèi)，能夠滿足微生物蛋白合成所需。瘤胃NH3-N濃度反映了瘤胃內(nèi)微生物對日糧蛋白的降解速度，其含量既受到日糧組成的影響，也與瘤胃內(nèi)微生物的利用速率密切相關(guān)[21]。本試驗中三胎牛的瘤胃氨態(tài)氮濃度最高，顯著高于一胎牛，這可能是由于一胎組試驗牛的瘤胃微生物利用氨態(tài)氮合成更多的微生物蛋白，試驗測定的結(jié)果也表明一胎組牛瘤胃微生物蛋白含量高于三胎組牛。瘤胃揮發(fā)性脂肪酸是反芻動物能量利用過程中的重要產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸等，是反芻動物能量的主要來源[22]。瘤胃揮發(fā)性脂肪酸主要受日糧組成、日糧加工方式、飼喂方式等的影響[23]。本試驗中各個處理組的總揮發(fā)酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸均無顯著差異，這可能是由于試驗中所有干奶牛均采用同樣的日糧和飼喂方式，而戊酸雖然在一胎和三胎組之間出現(xiàn)顯著性差異，但其占總揮發(fā)性脂肪酸的比例極小，戊酸的含量和比例也處在合理的區(qū)間范圍內(nèi)。Khazanehei等[24]對二胎和三胎及以上干奶牛的研究也表明，胎次對乙酸、丙酸、丁酸和其他揮發(fā)性脂肪酸沒有影響，但其研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，二胎牛的總揮發(fā)性脂肪酸顯著高于三胎及以上牛。本試驗中，各個胎次干奶?？倱]發(fā)性脂肪酸之間沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異，但一胎牛的總揮發(fā)性脂肪酸最高，這可能是由于與頭胎牛相比，經(jīng)產(chǎn)牛每次采食速度更快，反芻效率更高，咀嚼等量飼料所需時間更少[25]，在短時間內(nèi)采食大量的飼料和有效咀嚼可能會增加瘤胃通過率，從而通過該途徑增加瘤胃通過VFA的能力[24]。

3.2 胎次對干奶牛瘤胃甲烷排放量的影響

CH4是反芻動物攝入的日糧在瘤胃中微生物發(fā)酵作用下產(chǎn)生的一種溫室氣體。本試驗使用國際先進的GreenFeed測定系統(tǒng)測定出干奶牛的CH4排放量處于250～477 g·d-1，平均CH4為336 g·d-1。Kasuya和Takahashi[26]的研究表明，干奶牛的CH4排放量處于285.2～396.5 L·d-1，其測定的范圍小于本試驗結(jié)果，這可能是因為本研究所測定的奶牛涉及到各個胎次，體重上有著更大的差異。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著胎次增加，干奶牛的瘤胃CH4排放量也逐漸增加，尤其是三胎組和四胎及以上組干奶牛瘤胃CH4排放量顯著高于一胎組，而用單位代謝體重來衡量CH4排放強度時，發(fā)現(xiàn)各個胎次組之間的CH4/代謝體重均無顯著差異。Neel等[27]的研究也表明，不同體重的牛其瘤胃CH4排放量在用單位代謝體重表示時其差異消失。這表明干奶牛瘤胃CH4排放量的差異可能是由于體重差異所造成的。Huhtanen等[28]基于瘤胃功能建模發(fā)現(xiàn)，單位干物質(zhì)采食量CH4排放量的增加與飼料在瘤胃中的滯留時間、有機物消化率的增強和微生物細(xì)胞合成效率降低有關(guān)。較大體重的奶牛有著更大的瘤胃容量，減少了攝入對日糧在瘤胃中平均停留時間的影響，導(dǎo)致平均瘤胃停留時間增加。由于奶牛攝入的日糧中較易發(fā)酵部分先發(fā)酵，平均瘤胃停留時間的增加將會導(dǎo)致日糧纖維素在瘤胃中被消化的比例更大，而更大比例的瘤胃纖維素消化則會導(dǎo)致CH4產(chǎn)量增加[29]。

3.3 干奶牛瘤胃甲烷排放預(yù)測模型

反芻動物瘤胃CH4排放量的精準(zhǔn)測定是核算溫室氣體排放和研究減排措施的基礎(chǔ)，目前測定反芻動物瘤胃CH4排放量的方法主要包括直接測定法(呼吸代謝室法、六氟化硫示蹤法、GreenFeed測定系統(tǒng)等)和間接測定法(CO2示蹤法、嗅探器法、激光檢測器法等)[16,30]，但無論哪種測定方法，在實際生產(chǎn)中測定CH4排放量都需要耗費大量人力物力，無法對所有動物全部進行測定。因此，需要根據(jù)反芻動物實測的CH4排放數(shù)據(jù)，應(yīng)用統(tǒng)計方法建立的預(yù)測模型，核算排放因子，來預(yù)測動物的CH4排放量。本試驗結(jié)果表明，干奶牛的CH4排放量與胎次(相關(guān)系數(shù)=0.47)和體重(相關(guān)系數(shù)=0.61)之間均存在著極顯著的正相關(guān)關(guān)系。Bird-Gardine等[31]對安格斯母牛和公牛的CH4排放量進行測定，發(fā)現(xiàn)其瘤胃CH4排放量與體重之間有著顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.74和0.66；Herd等[32]測定41頭安格斯牛的CH4排放量，也得到了相似的結(jié)果，相關(guān)系數(shù)為0.47；Donoghue等[33]測定了不同生長階段的安格斯牛的CH4排放量，發(fā)現(xiàn)其與斷奶(相關(guān)系數(shù)0.53)、一歲(相關(guān)系數(shù)0.61)和成年后(相關(guān)系數(shù)0.56)的體重均有顯著的相關(guān)性；Jonker等[34]在母羊和羔羊上也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，其利用兩種呼吸室測定CH4，發(fā)現(xiàn)CH4排放量與體重呈顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.31～0.61。這表明反芻動物體重越大，其CH4排放量就越高。在CH4排放量和體重呈極顯著正相關(guān)的基礎(chǔ)上，基于奶牛體重建立的預(yù)測模型的決定系數(shù)為R2=0.46。Bird-Gardine等[31]在安格斯母牛和公牛也基于體重建立了瘤胃CH4排放量線性預(yù)測模型，決定系數(shù)分別為0.46和0.26；Huhtanen等[35]在奶牛上的研究也得出CH4排放量與體重之間的預(yù)測模型決定系數(shù)R2=0.32；Jiao等[36]基于6、12、18和22月齡奶牛的甲烷排放量和體重建立預(yù)測模型發(fā)現(xiàn)其決定系數(shù)分別為0.26、0.34、0.18和0.45；董利鋒等[37]對后備奶牛的研究也表明基于體重及建立的CH4預(yù)測模型決定系數(shù)為0.42。與單一的指標(biāo)相比，增加預(yù)測模型中變量數(shù)量，建立多元預(yù)測模型有助于提高模型的決定系數(shù)，Jenstch等[38]基于日糧中各種可消化營養(yǎng)物質(zhì)建立的四元一次模型決定系數(shù)達(dá)到0.896，而Jiao等[36]基于代謝能攝入量、中性洗滌纖維采食量和粗飼料比例建立的三元一次模型決定系數(shù)達(dá)到0.95，具有較高的模型精度。但在實際生產(chǎn)中，想要大量精確的測得這些指標(biāo)十分困難，因此有必要使用易于獲得的指標(biāo)來構(gòu)建高精度預(yù)測模型。本試驗基于舍飼生理狀態(tài)和干奶期生理階段的荷斯坦奶牛，建立適用于我國典型養(yǎng)殖模式的奶牛CH4排放量預(yù)測模型，為我國精準(zhǔn)核算溫室氣體排放提供一定的數(shù)據(jù)，也為研究分析出最佳飼料配方及相關(guān)的減排措施提供參考。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，干奶牛CH4排放量處于250～477 g·d-1，平均CH4排放量為336 g·d-1，隨著胎次的增加，CH4排放量呈增加的趨勢，一胎最低，四胎最高。此外，CH4排放量與胎次和體重之間呈極顯著的正相關(guān)，基于體重建立的線性預(yù)測模型能夠用于反映和評估干奶時期奶牛的CH4排放量。