陳雪琴，張明順，黃 茂，吉寧飛*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)國家衛(wèi)生健康委員會(huì)抗體技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3免疫學(xué)系，江蘇 南京 211166

哮喘是一類具有不同病理生理特征、臨床表現(xiàn)、病理和預(yù)后的異質(zhì)性疾病。從氣道炎癥的角度可分為4 種類型：嗜酸粒細(xì)胞性哮喘（eosinophilic asthma，EA）、中性粒細(xì)胞哮喘、混合性粒細(xì)胞哮喘和寡粒細(xì)胞性哮喘，其中以EA最為常見［1］。誘導(dǎo)痰細(xì)胞是識別哮喘氣道炎癥的金標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)中常將EA定義為痰嗜酸粒細(xì)胞比例＞1%～3%的哮喘［2］。近年來EA越來越受到關(guān)注，有研究顯示部分EA患者盡管吸入高劑量糖皮質(zhì)激素（激素）但氣道嗜酸性炎癥仍持續(xù)存在，與更嚴(yán)重的疾病程度和預(yù)后相關(guān)［3］。聚類分析顯示，這類患者成年起病，無特應(yīng)性，常合并慢性鼻竇炎及鼻息肉，存在持續(xù)的氣流受限［4］。目前，新型靶向2 型炎癥的生物制劑能夠精準(zhǔn)化治療特定表型（如EA）的哮喘患者，對高特異性、可重復(fù)且易于測量的生物標(biāo)志物的需求也愈加明顯。誘導(dǎo)痰嗜酸粒細(xì)胞可預(yù)測哮喘急性發(fā)作以及調(diào)整吸入性糖皮質(zhì)激素（inhaled corticosteroid，ICS）的劑量［5-6］，但技術(shù)要求較高且耗時(shí)，需配備專門的實(shí)驗(yàn)室和操作人員。支氣管組織活檢和支氣管肺泡灌洗液能直接反映氣道嗜酸粒細(xì)胞炎癥，但這些方法具有侵入性、價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)，在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)中不能廣泛使用。一些非侵入性的生物標(biāo)志物包括外周血嗜酸粒細(xì)胞、呼出氣一氧化氮（fractional ex?haled nitric oxide，F(xiàn)eNO）和骨膜蛋白（periostin）等成為潛在的替代標(biāo)志物，但其預(yù)測嗜酸性氣道炎癥的能力仍存在爭議。本文就EA的生物標(biāo)志物作一綜述。

1 外周血嗜酸粒細(xì)胞

外周血嗜酸粒細(xì)胞一直是痰嗜酸粒細(xì)胞的良好替代指標(biāo)［7］。有研究顯示血嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在150個(gè)/μL及以上能準(zhǔn)確預(yù)測痰嗜酸粒細(xì)胞增多，敏感性為85%，特異性為75%［8］。同樣，Schleich等［9］提出血嗜酸粒細(xì)胞識別痰嗜酸粒細(xì)胞≥3%的理想界值為188 個(gè)/μL，敏感性為72%，特異性為73%。還有研究將截?cái)嘀翟O(shè)定在300 個(gè)/μL［5］甚至更高［10］。關(guān)于血嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)作為嗜酸粒細(xì)胞炎癥的截?cái)嘀瞪形催_(dá)成共識。一項(xiàng)病例對照研究顯示，外周血嗜酸粒細(xì)胞增多與哮喘嚴(yán)重程度和癥狀控制不佳相關(guān)，但與肺功能減退無明顯關(guān)聯(lián)［7］。血嗜酸粒細(xì)胞可以預(yù)測哮喘急性發(fā)作［11］并識別出對抗白介素（IL）?5 單抗治療有應(yīng)答的人群［12］，但用于指導(dǎo)2型生物制劑治療的閾值是可變的（從150～400個(gè)/μL不等），取決于哮喘常規(guī)用藥和使用的生物制劑［13］。

外周血嗜酸粒細(xì)胞的測量具有簡便、可重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)，但因其相對較高的假陰性率和假陽性率，仍不能完全代替痰嗜酸粒細(xì)胞［10］。Hastie 等［5］發(fā)現(xiàn)血嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＞300 個(gè)/μL 時(shí)識別嗜酸粒細(xì)胞表型的準(zhǔn)確度只有63%，陽性預(yù)測值50%。這種低準(zhǔn)確度可能是因?yàn)橄颊哐人崃＜?xì)胞的高度變異性［14］?？紤]到血嗜酸粒細(xì)胞在生物制劑的選擇方面有著不可或缺的作用，重復(fù)測量血嗜酸粒細(xì)胞是有必要的［14］。

2 FeNO

一氧化氮（nitric oxide，NO）是氣道上皮細(xì)胞表達(dá)的一氧化氮合酶合成的一種反應(yīng)性分子［2］，經(jīng)口測量的NO 又稱FeNO。多項(xiàng)研究表明，F(xiàn)eNO 與痰嗜酸粒細(xì)胞呈正相關(guān)［6，15］。2011年美國胸科協(xié)會(huì)指出FeNO＜25/20 ppb（成人/兒童）提示患者存在非嗜酸粒細(xì)胞炎癥，對激素治療不敏感；反之，F(xiàn)eNO＞50/35 ppb（成人/兒童）提示存在嗜酸粒細(xì)胞炎癥，對激素治療有效［16］。FeNO 不僅可以輔助診斷哮喘，還能指導(dǎo)哮喘抗炎治療［16-17］。一項(xiàng)Meta 分析顯示，基于FeNO 指導(dǎo)哮喘治療可降低哮喘發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)，但對哮喘控制和肺功能無明顯影響［18］。最近，F(xiàn)ielding等［19］使用7項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行個(gè)體患者數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，基于FeNO 指導(dǎo)治療的模式對于未接受白三烯受體拮抗劑治療且不肥胖的哮喘患者可能更有效。高FeNO水平的重癥哮喘患者存在明顯的嗜酸性氣道炎癥、嚴(yán)重的氣流受限和氣道重塑，也存在頻繁的急診就診［20］。在重癥哮喘患者中觀察到的FeNO與嗜酸粒細(xì)胞之間的聯(lián)系可能是由于激素抵抗或上皮細(xì)胞的持續(xù)激活，后者是NO 合成的主要部位，也是嗜酸性趨化因子的來源［21］。Abe等［22］連續(xù)3年測量100例重癥哮喘患者的FeNO值，發(fā)現(xiàn)FeNO 水平持續(xù)在50 ppb 以上與病情惡化有關(guān)。此外，F(xiàn)eNO 還可預(yù)測重癥EA 患者對生物制劑，如奧馬珠單抗（omalizumab）、美泊利單抗（mepo?lizumab）和貝那利珠單抗（benralizumab）等的治療反應(yīng)［23］。

與誘導(dǎo)痰相比，F(xiàn)eNO 具有快速、簡便、安全、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。但FeNO 的測定易受過敏、年齡、激素用量、食物飲料、晝夜節(jié)律、吸煙等多種因素的影響。Nanda等［24］研究發(fā)現(xiàn)在5～7 d內(nèi)多次測量FeNO的平均值比單次測量值能更好地反映痰嗜酸粒細(xì)胞水平。

3 骨膜蛋白

骨膜蛋白是一種與纖維化有關(guān)的分泌型基質(zhì)蛋白，重組IL?4和IL?13在培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中可上調(diào)骨膜蛋白的表達(dá)［25］。在哮喘患者中，骨膜蛋白的表達(dá)水平與網(wǎng)狀基底膜厚度相關(guān)［25］。血清骨膜蛋白是哮喘嗜酸性氣道炎癥的生物標(biāo)志物，與痰嗜酸粒細(xì)胞和激素治療反應(yīng)相關(guān)［25-26］。以25 ng/mL 為分界值，血清骨膜蛋白可有效區(qū)分嗜酸粒細(xì)胞低和高的個(gè)體，敏感性為57%，特異性為85%，陽性預(yù)測值為93%［25］。然而，研究結(jié)果顯示，在兩個(gè)獨(dú)立的哮喘隊(duì)列中，與血嗜酸粒細(xì)胞和FeNO相比，血清骨膜蛋白在鑒別嗜酸粒細(xì)胞性炎癥（痰嗜酸粒細(xì)胞≥3%）和非嗜酸粒細(xì)胞性炎癥方面的準(zhǔn)確度最低［27］。盡管診斷EA 的能力相對較弱，血清骨膜蛋白可預(yù)測哮喘患者的固定氣流受限［28］以及新型生物制劑的療效［26，29］。在一項(xiàng)人源化抗IL?13 單抗（lebrikizumab）的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，治療前血清骨膜蛋白水平較高的哮喘患者使用lebrikizumab后肺功能的改善比骨膜蛋白水平較低的患者更明顯［29］。

相較于其他2 型炎癥生物標(biāo)志物，血清骨膜蛋白的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本處理和分析工作缺乏標(biāo)準(zhǔn)化流程，且易受年齡、吸煙、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、合并癥等因素的影響［26，30］，因此對于結(jié)果的解讀需謹(jǐn)慎。

4 免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）

IgE 通過Fc 區(qū)與肥大細(xì)胞上的FcεR Ⅰ受體或B淋巴細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞上的FcεR Ⅱ受體結(jié)合，釋放炎癥介質(zhì)，在過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［13，31］。IgE與痰嗜酸粒細(xì)胞相關(guān)［5-6］，但其診斷嗜酸粒細(xì)胞性哮喘的效力可能劣于FeNO和血嗜酸粒細(xì)胞。Wester?hof 等［32］通過受試者工作特征曲線比較血嗜酸粒細(xì)胞、FeNO 和總IgE 3 種生物標(biāo)志物預(yù)測痰嗜酸粒細(xì)胞增多的準(zhǔn)確度發(fā)現(xiàn)，總IgE的曲線下面積（area un?der the curve，AUC）最小。Good 等［33］通過支氣管鏡檢查以鑒定哮喘表型，也發(fā)現(xiàn)總IgE 水平與支氣管肺泡灌洗液或活檢標(biāo)本中的嗜酸粒細(xì)胞缺乏相關(guān)性，盡管這部分有嗜酸粒細(xì)胞證據(jù)的患者大多（＞80%）過敏原皮膚試驗(yàn)陽性。

血清總IgE 雖不能預(yù)測哮喘患者的臨床應(yīng)答，但抗IgE 治療可顯著減少氣道和外周血嗜酸粒細(xì)胞［34］。對這一矛盾可能的解釋是與抗IgE下調(diào)肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面的FcεRⅠ有關(guān)，表達(dá)FcεRⅠ細(xì)胞的減少限制過敏原誘導(dǎo)的IgE介導(dǎo)的反應(yīng)，進(jìn)而阻止細(xì)胞因子的釋放和嗜酸粒細(xì)胞在氣道中的募集［2］。此外，抗IgE治療還可以通過降低氣道樹突狀細(xì)胞水平促進(jìn)Th2 分化、嗜酸粒細(xì)胞存活和募集所必需的2型細(xì)胞因子減少。

5 血嗜酸粒細(xì)胞、FeNO、血清骨膜蛋白和總IgE 的組合

Korevaar 等［6］納入32 項(xiàng)研究的薈萃分析顯示，使用單一的替代生物標(biāo)志物將導(dǎo)致大量假陽性或假陰性。不難理解，EA 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、涉及不同的分子途徑，而不同的生物標(biāo)志物可能代表不同的2型氣道炎癥途徑。因此，兩個(gè)或兩個(gè)以上生物標(biāo)志物的組合或許可以提高檢測嗜酸性氣道炎癥的敏感性和特異性。

Westerhof 等［32］聯(lián)合使用FeNO 和血嗜酸粒細(xì)胞顯著提高了診斷EA的準(zhǔn)確度，但將總IgE加入FeNO和血嗜酸粒細(xì)胞的組合時(shí)，AUC值無明顯變化。而Hastie 等［5］聯(lián)合使用血嗜酸粒細(xì)胞、FeNO 和IgE 并未提高EA診斷的準(zhǔn)確度。同樣，Wagener等［27］將血嗜酸粒細(xì)胞、FeNO和血清骨膜蛋白3個(gè)標(biāo)志物組合在一起時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)任何改善。在指導(dǎo)治療方面，Malerba等［35］研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)策略（基于臨床癥狀）相比，聯(lián)合FeNO和痰嗜酸粒細(xì)胞調(diào)整ICS劑量可提高EA控制水平以及減少急性發(fā)作。正在進(jìn)行中的英國醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)的難治性哮喘分層計(jì)劃（RASP?UK）旨在探索重癥哮喘的新型生物標(biāo)志物分層策略，以改善重癥哮喘患者的臨床管理和靶向治療，其結(jié)果在未來將提供更多的信息［36］。

6 嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白和嗜酸粒細(xì)胞源性神經(jīng)毒素

嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白（eosinophil cationic pro?tein，ECP）和嗜酸粒細(xì)胞源性神經(jīng)毒素（eosinophil?derived neurotoxin，EDN）是嗜酸粒細(xì)胞活化的標(biāo)志，被認(rèn)為是哮喘2型炎癥的潛在生物標(biāo)志物［37-38］。一項(xiàng)美泊利單抗治療重癥EA的Ⅲ期臨床試驗(yàn)的事后分析［39］結(jié)果顯示，EDN 和ECP 可預(yù)測第1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in first second，F(xiàn)EV1）的改善，同時(shí)高基線EDN 亞組的哮喘急性發(fā)作頻率較低基線EDN 亞組下降更明顯。但研究者指出，EDN的預(yù)測能力很大程度上是由于其與基線外周血嗜酸粒細(xì)胞的相關(guān)性。最近，有研究顯示血清EDN 可用于評估EA 的嚴(yán)重程度［40］。An 等［41］發(fā)現(xiàn)EDN 比血嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)能更好地反映哮喘控制狀況（AUC 0.726vs.0.628，P=0.024）。

7 呼吸組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)等

“組學(xué)（omics）”反映了一種基于從單個(gè)樣本獲取大規(guī)模數(shù)據(jù)集的實(shí)驗(yàn)范式，目的是識別疾病的生物標(biāo)志物和/或闡明新的功能或病理機(jī)制［42］。測量呼出氣冷凝物中的揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile or?ganic compound，VOC）稱為“呼吸組學(xué)”。呼出氣中含有數(shù)千種VOC的復(fù)雜氣體混合物，它們來自全身和局部的代謝、炎癥和氧化過程［43］。目前用于分析VOC的技術(shù)包括氣相色譜?質(zhì)譜（gas chromatography?mass spectrometry，GC?MS）和電子鼻（electronic nose，eNose）。GC?MS作為一種化學(xué)分析技術(shù)，通過與先前建立的參考庫比較單個(gè)化合物的質(zhì)量與電荷比以識別出呼吸樣本中的單個(gè)成分；電子鼻則是類似哺乳動(dòng)物嗅覺的多傳感器設(shè)備，其對VOC混合物中的多種化合物具有交叉反應(yīng)，產(chǎn)生由VOC混合物驅(qū)動(dòng)并具有其特征的傳感器響應(yīng)模式［43］，缺點(diǎn)是不能對呼出氣的化學(xué)成分進(jìn)行精確分析。研究顯示，電子鼻技術(shù)能夠區(qū)分哮喘和對照組，其準(zhǔn)確度與FeNO 和痰嗜酸粒細(xì)胞相當(dāng)，并且預(yù)測哮喘患者對激素的反應(yīng)優(yōu)于痰嗜酸粒細(xì)胞和FeNO［44］。Schleich等［45］在一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究中使用GC?MS 分析發(fā)現(xiàn)，己烷和2?己酮能很好地識別EA，其準(zhǔn)確度與血嗜酸粒細(xì)胞和FeNO相當(dāng)。此外，F(xiàn)eNO、血嗜酸粒細(xì)胞和VOCs 的組合對EA 顯示出較好的預(yù)測能力（AUC為0.9）。

除上述呼吸組學(xué)可應(yīng)用于炎癥表型的識別，還有其他組學(xué)技術(shù)在開展。Rossios 等［46］發(fā)現(xiàn)痰IL1RL1（也稱為IL33R 或ST2）基因表達(dá)與重癥EA相關(guān)。Schofield等［47］采用無偏標(biāo)記定量質(zhì)譜和拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析方法對206例哮喘患者的痰上清液蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有10 種蛋白（組蛋白H4、玻璃體凝集素、富含組氨酸的糖蛋白、免疫球蛋白重常數(shù)g3、補(bǔ)體C3、轉(zhuǎn)甲狀腺素、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、α?1?抗胰蛋白酶、半乳糖凝集素?3 結(jié)合蛋白和ezrin）能較好地預(yù)測EA表型。Gai 等［48］使用液相色譜?質(zhì)譜法測定血清代謝甘油磷脂譜，結(jié)果顯示痰嗜酸粒細(xì)胞≥3%組血清溶血磷脂酰甘油水平明顯高于痰嗜酸粒細(xì)胞＜3%組，提示血清溶血磷脂酰甘油可能是EA的一個(gè)生物標(biāo)志物。

8 分子途徑相關(guān)標(biāo)志物

在過敏性EA中，Th2細(xì)胞是哮喘病理生理的驅(qū)動(dòng)因素，但近年來的研究表明，在成人起病的非過敏性EA中，2型固有淋巴細(xì)胞（group 2 innate lymphoid cell，ILC2）扮演著重要角色［49］。ILC2是一群不表達(dá)譜系標(biāo)志物（不表達(dá)T、B、NK、肥大及嗜堿性粒細(xì)胞等譜系標(biāo)志物），并且缺乏抗原識別受體的細(xì)胞群，在IL?33、IL?25和/或胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素的刺激下產(chǎn)生大量IL?5 和IL?13，介導(dǎo)2 型固有免疫［49］。研究顯示，ILC2 在哮喘患者外周血中增加［50］，且重癥EA患者的痰和外周血中ILC2水平比輕癥哮喘患者高［51］。Liu等［52］研究發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞ILC2的百分比（%ILC2）診斷EA 的準(zhǔn)確度略優(yōu)于血嗜酸粒細(xì)胞和FeNO。以0.076%ILC2 為界值，檢測嗜酸性氣道炎癥的敏感性為67.7%，特異性為95.3%，提示ILC2可能是EA的潛在生物標(biāo)志物。一項(xiàng)前瞻性研究結(jié)果顯示，ILC2與外周血嗜酸粒細(xì)胞百分比呈正相關(guān)，但與肺功能無關(guān)［53］。目前，關(guān)于ILC2 能否替代誘導(dǎo)痰診斷EA以及其在預(yù)測激素治療反應(yīng)和疾病預(yù)后方面尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，無創(chuàng)、易獲取、可重復(fù)的生物標(biāo)志物將極大地簡化和改善哮喘的診斷和治療。單一的生物標(biāo)志物并不能有效捕捉復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)，兩種或兩種以上生物標(biāo)志物的聯(lián)合也許能提高診斷的準(zhǔn)確度（如血嗜酸粒細(xì)胞和FeNO 的組合）。此外，隨著對EA發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識以及組學(xué)等新技術(shù)的開展，確定新的、更上游的嗜酸粒細(xì)胞炎癥生物標(biāo)志物將為EA 患者帶來理想的靶向治療。最后，考慮到部分生物標(biāo)志物的不穩(wěn)定性［14］，未來的研究應(yīng)著眼于這些炎癥性生物標(biāo)志物在長時(shí)間內(nèi)的縱向變異性，以更好地應(yīng)用于臨床。