王昭娣，王悅

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）調(diào)查統(tǒng)計，2020 年預計宮頸癌新發(fā)病例為604 127 例，新發(fā)死亡病例為341 831 例，均占女性癌癥的第4 位[1]。早期宮頸癌預后良好，晚期預后差且易復發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥，這些是宮頸癌治療中的難題。除了傳統(tǒng)手術(shù)治療、放療及化療外，腫瘤免疫治療和靶向治療也展現(xiàn)出較好前景。

表觀遺傳學指基于非基因序列改變所致基因表達水平的變化，主要包括組蛋白修飾、DNA 修飾、非編碼RNA 和核小體重塑等[2]。組蛋白甲基化是表觀遺傳學中的重要一環(huán)，其中果蠅zeste 基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）能通過介導H3K27 甲基化，使靶基因的表達下調(diào)或沉默，并與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及不良預后密切相關[3-4]。探索EZH2 在宮頸癌中的作用及機制，有助于尋找新的分子標志物，為宮頸癌的診斷及治療提供依據(jù)?，F(xiàn)對EZH2 在宮頸癌研究中的最新進展進行綜述。

1 EZH2 結(jié)構(gòu)及功能概述

EZH2 最早在1996 年被發(fā)現(xiàn)，最終被定位于染色體7q35 位點。EZH2 蛋白（含有746 個氨基酸殘基），包括20 個外顯子和19 個內(nèi)含子，長度41～323 bp和0.15～17.7 kb 不等，該基因的互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）序列與果蠅zeste 基因的增強子有高度同源性。EZH2 蛋白包含4 個高度保守的結(jié)構(gòu)：氨基（N）端的Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)、半胱氨酸富集區(qū)和羧基（C）端的SET 結(jié)構(gòu)域[5]，SET 結(jié)構(gòu)域可由S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-Adenosyl-Methionine，SAM）提供甲基，催化組蛋白H3K27 甲基化。

多梳家族蛋白（polycomb-group proteins，PcGs）以多梳抑制復合體（polycom repressor complex，PRC）的形式在生物體內(nèi)發(fā)揮抑制基因轉(zhuǎn)錄和沉默基因的作用，PRC 有維持復合物（PRC1）和起始復合物（PRC2）2 種主要形式。PRC2 由4 種核心組分構(gòu)成：EZH2、胚胎外胚層發(fā)育蛋白（embryonic ectoderm development，EED）、zeste 基因抑制子（suppressor of zeste 12，SUZ12）和視網(wǎng)膜母細胞瘤結(jié)合蛋白46/48（retinoblastoma -associated proteins 46/48，RbAp46/48）[6]。EZH2 是具有催化活性的亞基，在EED 和SUZ12 的輔助作用下通過C 端的SET 結(jié)構(gòu)域催化H3K27 甲基化，抑制或沉默靶基因。研究表明EZH2的高表達與腫瘤的惡性行為密切相關[7]。

2 EZH2 表達的臨床意義

有研究探討了EZH2 在宮頸癌中的表達及臨床意義。Azizmohammadi 等[8]選取39 例宮頸鱗癌組織和對應癌旁組織，通過實時定量聚合酶鏈反應（realtime quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）和免疫組織化學技術(shù)發(fā)現(xiàn)癌組織中EZH2 的mRNA水平（P=0.003）和蛋白水平（P=0.002）均顯著高于癌旁組織，EZH2 表達與國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關（P＜0.05）。腺癌和腺鱗癌約占宮頸癌病理類型的20%～25%，有研究共納入宮頸腺癌54 例、良性病變32 例和正常腺上皮樣本66 例，結(jié)果顯示與正常和良性病變組織相比，宮頸腺癌中EZH2 的表達顯著增高（P＜0.05）[9]。唐梅等[10]納入了更多組織樣本，包括174 例宮頸癌（鱗癌143 例、非鱗癌31 例）、62 例宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）以及40 例正常宮頸組織，通過免疫組織化學法發(fā)現(xiàn)宮頸癌組EZH2 的陽性表達率明顯高于CIN 組和正常組（73.0% vs.46.8%vs.7.5%，P＜0.05）；宮頸癌組中EZH2 表達除了與分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關外，還與腫瘤浸潤深度有關（P＜0.05），與年齡、病理類型、腫瘤大小無關（P＞0.05）；此外，EZH2 陽性患者的無進展生存期[progression free survival，PFS，（53.7±3.6）個月vs.（62.8±2.4）個月，P＜0.01]和總生存期[overall survival，OS，（56.2±3.0）個月vs.（64.2±1.9）個月，P＜0.01]均短于EZH2 陰性宮頸癌患者，多因素分析結(jié)果顯示此分子標志物陽性可能是影響預后的獨立危險因素（OR=1.483，95%CI：1.406～1.859，P＜0.05）。但是也有研究通過免疫組織化學法分析117 例宮頸鱗癌組織發(fā)現(xiàn)EZH2 表達與FIGO 分期（P=0.100）或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.564）無顯著相關性[11]。更多的研究表示病理分期較晚以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時宮頸癌患者EZH2陽性率顯著更高[10，12-13]。目前測定組織中EZH2 蛋白陽性主要使用單一免疫組織化學法，同時免疫組織化學的結(jié)果與抗體的選擇、組織的選取以及結(jié)果判讀等密切相關，這些因素可能導致研究結(jié)果之間的差異。未來研究還可以通過運用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）以及在mRNA 水平進一步探索EZH2 在宮頸癌中表達的意義。

3 EZH2 的促瘤作用及相關機制

3.1 EZH2 促進細胞增殖、侵襲及遷移Chen 等[14]通過基因編輯及短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）技術(shù)上調(diào)或下調(diào)EZH2，發(fā)現(xiàn)EZH2 促進宮頸癌細胞的增殖和腫瘤形成。該研究的熒光素酶報告實驗提示EZH2 能夠特異性結(jié)合到Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）通路抑制劑糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）和TP53 的啟動子上。免疫組織化學法提示EZH2 表達與βcatenin、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）和c-myc 表達呈正相關（P＜0.05）。EZH2 通過GSK-3β 和TP53 的表觀遺傳沉默激活Wnt/β-catenin 通路，促進宮頸癌細胞增殖和腫瘤形成。冀靜等[15]用RNA 干擾EZH2表達后，宮頸癌細胞周期阻滯于G1/S 期，增殖明顯受抑制，p21 蛋白水平明顯升高，提示沉默EZH2 基因可能通過上調(diào)p21 誘導C33A 細胞阻滯于G1 期，從而抑制宮頸癌細胞增殖，此研究從另一角度證實EZH2 的促腫瘤增殖作用。

EZH2 在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及深部浸潤時表達升高，可見EZH2 能夠促進腫瘤侵襲及遷移。Ding等[16]發(fā)現(xiàn)，使用EZH2 抑制劑GSK343 后，宮頸癌腫瘤細胞中上皮標志物E-鈣黏蛋白上調(diào)，間充質(zhì)標志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白下調(diào)，可見EZH2 通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）來促進宮頸癌的轉(zhuǎn)移及侵襲。另有研究發(fā)現(xiàn)用RNA 干擾技術(shù)抑制EZH2 后，宮頸腫瘤細胞的基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）下調(diào)，遷移侵襲能力降低，可見EZH2 的促進腫瘤轉(zhuǎn)移作用還可能通過調(diào)控MMP-2 基因來實現(xiàn)[17]。

有研究發(fā)現(xiàn)EZH2 的上游基因，可以通過對EZH2表達的調(diào)控影響宮頸癌的增殖及轉(zhuǎn)移。微小RNA-137（miR-137）及miR-214 在宮頸癌中低表達，其下調(diào)可解除對下游靶基因EZH2 表達的抑制，促進宮頸癌細胞體內(nèi)外的增殖和遷移[18-19]。另外，研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）LINC01535 能夠結(jié)合miR-214，解除miR-214 對其靶基因EZH2 的抑制作用，上調(diào)EZH2 蛋白的表達，發(fā)揮生物學作用[20]。

非編碼RNA 能將EZH2 定向募集到靶基因上，EZH2 通過使靶基因H3K27 甲基化在表觀遺傳學水平修飾靶基因，進而導致靶基因抑制或沉默。目前已有關于與宮頸癌細胞增殖或遷移、侵襲相關非編碼RNA 的研究。lncRNA ARAP1-AS1 通過募集EZH2沉默雙特異性磷酸酶5（dual-specificity phosphatase 5，DUSP5）的表達，激活ARAP1-AS1/EZH2/DUSP5軸促進SiHa 細胞增殖和遷移[21]。lncRNA PVT1 將EZH2 招募到miR-200b 啟動子上，增加該區(qū)域組蛋白H3K27 三甲基化水平，并抑制miR-200b 表達，導致宮頸癌細胞增殖和遷移[22]。lncRNA SNHG7 能夠促進宮頸癌細胞增殖，研究發(fā)現(xiàn)其機制是招募EZH2與Dickkopf 同源物1（Dickkopf-1，DKK1）啟動子的結(jié)合，下調(diào)DKK1 基因的表達，從而激活宮頸癌中Wnt/β-catenin 信號傳導途徑[23]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）AGFG1 在宮頸癌中過表達，與不良預后密切相關，通過募集EZH2 表觀遺傳修飾下調(diào)p53 發(fā)揮致癌作用，在體外影響SiHa 和HeLa 細胞的增殖能力[24]。circ_0019435 可導致EZH2 向DKK1和人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN 基因）啟動子方向募集，下調(diào)DKK1 和PTEN 基因的表達，激活Wnt/β-catenin途徑，增加HeLa 和SiHa 細胞體外的增殖、侵襲、遷移和EMT 作用[25]。在宮頸癌中，EZH2 參與的非編碼RNA 的募集作用，該定向募集對宮頸癌細胞其他惡性生物學行為的作用需要更多研究去驗證。

3.2 EZH2 促進腫瘤血管生成EZH2 高表達時宮頸惡性腫瘤微血管密度（microvascular density，MVD）更高。Fathy 等[26]通過對54 例宮頸癌組織免疫組織化學分析發(fā)現(xiàn)，EZH2 和內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）的表達與MVD 呈正相關（P＜0.01），EZH2 可作用于ET-1 促進腫瘤血管的生成。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)宮頸病變[包括65 例宮頸癌和90 例宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）]患者組織中EZH2 與血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）的表達呈正相關（r=0.857，P=0.000），EZH2 還可作用于VEGF-C 促進腫瘤血管的生成[27]。

3.3 EZH2 抑制細胞凋亡EZH2 在多種腫瘤中與細胞凋亡密切相關。在宮頸癌中的研究發(fā)現(xiàn)，用EZH2 抑制劑3-去氮腺嘌呤（3-deazaneplanocin A，DZNep）處理后，C33A 細胞（6.57±0.25 vs.1.35±0.12，P＜0.05）和SiHa 細胞（5.04±0.13 vs.0.75±0.11，P＜0.05）的凋亡比例顯著高于未經(jīng)DZNep 處理的對照組，Western blotting 結(jié)果顯示凋亡蛋白B 細胞淋巴瘤/白血病-xL（B cell lymphoma/leukemia-xL，BclxL）表達下調(diào)，促凋亡蛋白B 細胞淋巴瘤-2 促細胞凋亡（B cell lymphoma-2 interacting mediator of cell death，Bim）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）表達上調(diào)，可見在宮頸腫瘤中EZH2 也與細胞凋亡有關[28]。lncRNA SNHG8 通過增加回復引導半胱氨酸豐富蛋白Kazal 基元（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）啟動子區(qū)域中EZH2 和H3K27me3 的富集，表觀遺傳修飾RECK 使該基因沉默，增加了宮頸癌細胞的抗凋亡作用[29]。

3.4 EZH2 誘導順鉑耐藥宮頸癌的鉑耐藥一直是治療的難題，EZH2 也參與腫瘤的鉑耐藥。與HeLa細胞相比，順鉑耐藥宮頸癌細胞（HeLa/DDP）中EZH2 的表達更高，運用shRNA 技術(shù)敲低HeLa/DDP細胞的EZH2 表達，接著用順鉑處理細胞48 h，與未敲低EZH2 表達的HeLa/DDP 細胞（34.88 μg/mL）相比，IC50值顯著降低（19.09 μg/mL，P＜0.01），進一步研究發(fā)現(xiàn)抑制EZH2 后可能上調(diào)Dicer 酶而逆轉(zhuǎn)宮頸癌的順鉑耐藥[30]。另有研究表明miR-217 在SiHa/DDP 細胞中低表達，上調(diào)miR-217 可部分逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性并且下調(diào)EZH2 的表達，其可能通過作用于EZH2 參與宮頸癌順鉑耐藥的調(diào)控，具體調(diào)控機制尚待進一步研究[31]。

3.5 EZH2 促進腫瘤免疫逃逸T 細胞免疫球蛋白黏蛋白3（T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）和半乳糖凝集素9（galectin-9）的結(jié)合可引起免疫耐受[32]。Zhang 等[33]發(fā)現(xiàn)宮頸癌中EZH2 可直接與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）相互作用，抑制DNMT 的表達，降低Tim-3/galectin-9 啟動子區(qū)域甲基化水平，從而促進了該通路上調(diào)，引起免疫耐受并導致癌變過程中的免疫逃逸。但EZH2 促進腫瘤免疫逃逸的機制仍需進行更多研究加以證明。

3.6 EZH2 與人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的關系HPV 是宮頸癌發(fā)生發(fā)展最主要的危險因素。研究顯示在HPV16 陽性的宮頸癌細胞中沉默E7 基因，EZH2 的表達會顯著下調(diào)；HPV16 E7 通過介導口袋蛋白（pocket protein）釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F（E2F transcription factor），在轉(zhuǎn)錄水平上激活EZH2的表達，而E6 的刺激作用較弱；同時EZH2 能夠促進HPV 陽性的宮頸癌細胞的增殖以及凋亡抵抗[34]。此后有研究發(fā)現(xiàn)HPV18 E6 或E7 過表達均可導致EZH2 和H3K27me3 表達水平增加；HPV18 E6 和E7可能通過叉頭框蛋白M1（forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1）和E2F-1 與EZH2 啟動子區(qū)相互作用，上調(diào)EZH2 和H3K27me3 的表達[33]?？梢奅ZH2 能夠與HPV 蛋白相互作用，影響宮頸癌的進展，進一步提示EZH2 可以作為宮頸癌新的治療靶點。

4 EZH2 抑制劑

目前研究已證實EZH2 介導表觀遺傳修飾的失調(diào)在癌癥的發(fā)生發(fā)展中的作用，EZH2 可作為新型抗癌靶點。目前一些高選擇性的小分子EZH2 抑制劑已經(jīng)研制出來并用于多種腫瘤的實驗室以及臨床研究。GSK126、PF06821497 和CPI-1205 等抑制劑在淋巴瘤、非小細胞肺癌以及前列腺癌等方面已經(jīng)進入Ⅰ期臨床試驗階段；EPZ-6438 是一種選擇性可口服的EZH2 抑制劑，由美國Epizyme 公司研發(fā)，2020年該藥經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準上市，對多種惡性腫瘤的抗腫瘤活性和預后效果均表現(xiàn)良好[35]。

目前在宮頸癌中EZH2 抑制劑還在細胞水平研究階段，如GSK343 和DZNep。GSK343 能夠通過競爭抑制甲基供體SAM 來發(fā)揮作用。如GSK343 在作用濃度為50 μmol/L 時，處理HeLa、SiHa 細胞48 h、72 h 能夠顯著抑制HeLa 細胞的增殖以及遷移能力，并證明其抑癌作用可能是通過抑制HeLa 細胞EMT過程來實現(xiàn)的[16，36]。DNZep 能抑制S-腺苷高半胱氨酸水解酶（S-adenosy-L-homocysteine hydrolase，SAHH）活性，使失活的S-腺苷高半胱氨酸（Sadenosy-L-homocysteine，SAH）積聚，進而抑制EZH2的活性。利用DZNep 抑制C33A、SiHa 宮頸癌細胞中EZH2 的表達48 h 后，能夠誘導宮頸癌細胞早期凋亡，其對兩種細胞的IC50 分別為4 μmol/L 和6 μmol/L[28]。用不同濃度DZNep（1、5 和10 μmol/L）處理鉑耐藥HeLa/DDP 細胞后，Western blotting 顯示EZH2 和H3K27me3 的表達水平降低，隨著時間的增加，四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測的細胞活力顯著降低[30]。可見EZH2 抑制劑有望成為治療惡性腫瘤的新興手段，具有良好的發(fā)展前景。

5 結(jié)語與展望

組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2 在宮頸癌中高表達，與預后不良有關。宮頸癌中EZH2 參與腫瘤的增殖、遷移、侵襲、血管生成、耐藥以及免疫逃逸等作用。研究表明EZH2 有望作為宮頸癌新的生物標志物，有助于宮頸癌的早期診斷、預后評估和療效評價。但是目前關于EZH2 在宮頸癌中作用及機制的研究較少，未來將EZH2 作為藥物靶點，開發(fā)出高效、低毒性、高選擇性的EZH2 靶向藥物可作為發(fā)展方向之一，同時也需要進行更多臨床實驗來驗證該靶向藥物和生物標志物的診療效果?；趩我凰幬镒饔玫挠邢扌裕€可以探索EZH2 靶向藥聯(lián)合傳統(tǒng)治療的療效與安全性，從而制定出更好的治療方案。