于長清，汪希鵬

卵巢癌（ovarian cancer，OC）起病隱匿，治療困難，復發(fā)率高，據(jù)統(tǒng)計，2020 年全球OC 新發(fā)患者31萬余例，死亡20 余萬例，病死率居婦科惡性腫瘤首位[1]。OC 患者在疾病早期一般無明顯癥狀，而當臨床癥狀如腹脹、腹水和腸道梗阻等出現(xiàn)時，多已為晚期。盡管早發(fā)現(xiàn)早治療能明顯改善OC 患者的預后，但80%的OC 患者初次診斷時已是Ⅲ期或Ⅳ期[2]。目前OC 診治仍依賴于血清學、影像學方法及病理檢查結(jié)果，這些方法在OC 診治過程中各有局限，糖類抗原125（CA125）和影像學檢查在用于腫瘤監(jiān)測時缺乏時效性，而組織病理檢查受到取材部位和取材次數(shù)限制，因此，需要探索新的診斷和監(jiān)測OC 的有效方法。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作為一種新的檢測手段，具有無創(chuàng)、不受檢測次數(shù)限制、可反映腫瘤負荷和腫瘤異質(zhì)性等優(yōu)點，在OC 診治中的臨床應用價值正在逐步體現(xiàn)。盡管ctDNA 在OC 診治中的研究仍處在早期階段，越來越多的研究表明ctDNA 在OC 診治中具有巨大潛能，但同時也存在許多爭議。現(xiàn)綜述ctDNA 在OC 診治中的研究進展，展望ctDNA 在OC 診治中的研究方向，以期能為OC 診治開拓新的視野。

1 ctDNA 概述

1.1 ctDNA的生物學特性 ctDNA 通常指外周血中細胞外游離的腫瘤細胞來源的片段狀DNA，僅占細胞外游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）的很小部分，1989 年Stroun 等[3]首次證明了ctDNA 的存在。其分解主要靠核苷酸酶，清除主要靠腎臟排泄，半衰期極短，一般在16 min～2.5 h 之間。外周血中ctDNA 的含量極低，且ctDNA 含量及其與cfDNA 的比例也不固定，這歸因于患者所患疾病的類型、疾病所在的期別表現(xiàn)出明顯的個體化差異，并受到多種內(nèi)外界因素影響，如急性應激、創(chuàng)傷、手術(shù)、炎癥、年齡和體力活動等。盡管ctDNA 含量在不同患者中差異很大，但對同一個體而言，ctDNA 含量高低與腫瘤負荷大小存在著明顯的關(guān)聯(lián)[4]。ctDNA 和cfDNA 常與液體活檢聯(lián)系在一起，但是液體活檢的標志物不僅局限于這兩者，還包括染色體、RNA[信使RNA（mRNA）、小干擾RNA（siRNA），微小RNA（miRNA）]、蛋白質(zhì)、外泌體，甚至循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）。液體活檢的樣本來源也不局限于外周血，亦可以是尿液、腸液、唾液、腦脊液和胸腹水等。

1.2 ctDNA的獲取 血清中的ctDNA 含量高于血漿，但在血清制備過程中會導致白細胞裂解，釋放的DNA 會降低cfDNA 中ctDNA 的比例，影響檢驗的敏感度。因此，ctDNA 提取檢測一般選擇血漿而非血清。某些體液標本在診斷特定部位疾病時較血漿更佳，如尿液用于膀胱腫瘤檢測，腦脊液用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤檢測。由于ctDNA 的半衰期短，為減少ctDNA 降解，血液標本需置于4 ℃保存，并在4 h 內(nèi)進行血漿分離[5]。使用細胞固定液能穩(wěn)定細胞膜，減少細胞裂解，使樣本在室溫條件下保存數(shù)天，為樣本轉(zhuǎn)運、儲存提供時間。另外，為防止血液凝固必須使用抗凝劑，由于肝素化的血漿可能阻礙后續(xù)聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）過程，目前乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）是首選的抗凝劑。ctDNA 的分離可選擇吸附柱法、磁珠法和相分離法等，其中苯酚-氯仿分離法分離出的ctDNA 分子質(zhì)量范圍更大[6]。含量低、半衰期短的特點使ctDNA 提取過程會對檢測結(jié)果造成很大影響，目前在提取和純化ctDNA 方面尚無統(tǒng)一的標準。

1.3 ctDNA的檢測 ctDNA 的檢測方法主要分為2種：以PCR 為基礎的檢測方法和二代測序（next generation sequencing，NGS）?；赑CR 的方法主要有等位基因特異性PCR（allele-specific PCR，ASPCR）、數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）和BEAMing PCR。AS-PCR 選擇特異性的引物對目標基因進行擴增，主要用于熱點突變基因和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的檢測，其檢測精度可達到0.1%～1%[7]。dPCR 方法通過單分子模板PCR 擴增能夠?qū)NA 分子進行計數(shù)，達到很高的敏感度，但不適合高濃度DNA 樣本檢測。由dPCR 發(fā)展而來的IBSAFE 技術(shù)是一種超敏液滴數(shù)字PCR（ultra-sensitive droplet digital PCR，ddPCR），能檢測到OC 患者中突變頻率僅為0.006 8%的TP53 基因突變[8]。BEAMing PCR 因珠子（Bead）、乳劑（Emulsion）、擴增（Amplification）、磁力（Magnetic）4 個因素而得名，BEAMing 技術(shù)結(jié)合dPCR 和流式技術(shù)，能夠?qū)ν蛔冞M行定量檢測，敏感度高?；赑CR 的檢測技術(shù)都只能對已知突變進行測序，不能檢測未知突變，而NGS 則可通過靶向或非靶向的DNA 測序檢測所有異常突變。非目標靶向測序NGS 主要有全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）和全外顯子測序（whole exome sequencing，WES）。由于其檢測沒有目標基因，價格昂貴，檢測深度和檢測敏感度方面不如靶向測序方法，故實際應用較少。靶向測序NGS 是針對特定基因或特定序列的檢測，主要包括擴增子靶向測序（tagged-amplicon sequencing，TAm-Seq）、安全測試系統(tǒng)（safe sequencing system，Safe-SeqS）和腫瘤個體化深度測序分析（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）。其中Safe-SeqS 是在被擴增DNA 上標記1 個特有的標簽后進行擴增，以標簽為定位對擴增出來的DNA 進行分析，出現(xiàn)頻率大于95%的基因突變才被認為是真正的突變，使檢測誤差降低至0.02%[9]。近年應用于NGS 的數(shù)據(jù)統(tǒng)計模型也在發(fā)展，例如由PyClone 改進而來的PyClone-Ⅵ，在保證準確率的情況下顯著提高了檢測效率[10]。

2 ctDNA 在OC 診治中的應用

2.1 OC診斷 在OC 早期診斷和疾病篩查方面，目前仍缺乏有效的檢測手段。2021 年英國卵巢癌篩查聯(lián)合試驗（the UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening，UKCTOCS）的研究結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，CA125 篩查對1 年內(nèi)OC 的診斷敏感度為71%，而陰道超聲檢查的敏感度僅為61.5%[11-12]。ctDNA 在其他類型腫瘤如乳腺癌、肺癌、膀胱癌和結(jié)直腸癌的早期檢測中的應用已初見成效，研究已表明ctDNA 亦可被用于OC 檢測。Kamat 等[13]采用實時PCR 通過GAPDH、β-肌動蛋白（β-actin）和β-球蛋白（βglobin）3 個基因位點的檢測來測定晚期OC 患者血漿cfDNA 的含量，結(jié)果顯示OC 患者cfDNA 含量較健康對照組升高（P 分別為0.022、0.025 和0.008 9）。另外，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷（noninvasive prenatal testing，NIPT）技術(shù)不僅可以用于產(chǎn)前診斷，也能檢測出OC患者外周血染色體數(shù)目變異。Cohen 等[14]使用NIPT技術(shù)對32 例OC 患者和32 例卵巢良性腫瘤患者外周血染色體和亞染色體拷貝數(shù)進行了檢測，通過與已報道的OC 染色體拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，在32 例OC 患者中有13 例存在CNV，而在良性腫瘤組中僅有2 例存在CNV。Wang 等[15]采用Safe-SeqS 對83 例OC 患者血漿ctDNA 樣本中18 個腫瘤相關(guān)基因突變狀態(tài)進行了檢測，33 例患者結(jié)果顯示陽性，采用同樣方法檢測了254 例患者宮頸涂片樣本和51 例患者宮腔涂片樣本，陽性率分別為29%和41%。

研究已證實ctDNA 不僅可應用于OC 高風險者的篩查，其用于OC 診斷時較傳統(tǒng)方法更優(yōu)。2017 年Vanderstichele 等[16]首次將ctDNA 低覆蓋全基因組的z 評分結(jié)果用于OC 的檢測，68 例附件腫塊患者的測試結(jié)果顯示z 評分用于高級別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC）診斷時，受試者工作特征曲線下面積（AUC）為0.89，高于CA125（AUC=0.78）和惡性腫瘤危險指數(shù)（the risk of malignancy index，RMI，AUC=0.81）。Widschwendter等[17]將特制基因芯片應用于OC 診斷，該基因芯片能同時檢測ctDNA 中COL23A1、C2CD4D 和WNT6這3 個OC 特異性的甲基化異?；?，對43 例OC患者血漿ctDNA 樣本測試的結(jié)果顯示，該基因芯片對OC 診斷的敏感度為23.3%，特異度為96.9%。該研究中19 例患者樣本取自臨床確診前1 年內(nèi)，24例患者樣本取自臨床確診前1～2 年，提示ctDNA 檢測能將OC 的診斷時間明顯提前。Li 等[18]統(tǒng)計了22項研究中的OC 患者數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，ctDNA 對OC 的綜合診斷敏感度達73%，特異度達90%。另外，用于OC 檢測的新靶點也在研究中。Zhang 等[19]發(fā)現(xiàn)OC患者血漿ctDNA 中的ALU-219 含量明顯高于良性腫瘤患者和正常人，ALU-219 聯(lián)合ALU-219/ALU-115 預測OC 的AUC 為0.792。2019 年Dvorská 等[20]對128 例OC 患者血漿樣本中4 個抑癌基因（RASS1、PTEN、CDH1 和PAX1）甲基化程度進行檢測后發(fā)現(xiàn)，OC 組的CDH1 甲基化百分率高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義[（46.42±20.91）vs.（22.25±14.13），P＜0.05]，這表明CDH1 有望成為OC 無創(chuàng)檢測的靶點之一。

2.2 腫瘤分子分型ctDNA 檢測方法可以對腫瘤基因進行全方位的檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)基因突變和異常的基因改變。目前，組織學檢查仍是腫瘤分子分型的金標準及后續(xù)藥物治療方案選擇的主要依據(jù)；然而組織活檢技術(shù)有很大的局限性，如取材范圍不全面、取材次數(shù)有限和樣本無法獲取等。而且由于腫瘤異質(zhì)性的存在，單一部位取材的結(jié)果往往難以全面反映腫瘤特性。ctDNA 檢測可以彌補組織學檢查的不足，做到對各個部位腫瘤細胞釋放到外周血中的ctDNA 進行集體活檢，其檢測結(jié)果更能反映腫瘤的異質(zhì)性。

已有研究表明ctDNA 檢測結(jié)果與組織學檢測結(jié)果有較高的一致性。Chan 等[21]在罹患OC 和乳腺癌患者的血漿中能同時檢測到各自特異性的基因拷貝數(shù)畸變，表明ctDNA 用于OC 腫瘤異質(zhì)性檢測可行并具有特異性。在OC 患者中，2 項對于TP53 基因突變檢測研究的結(jié)果顯示ctDNA 檢測結(jié)果與組織樣本檢測結(jié)果一致性分別為100%和76.19%，對于BRCA1 檢測的特異度達100%，與組織學檢查結(jié)果一致性達95.24%[22-23]。Christie 等[24]對30 例BRCA1或BRCA2 胚系突變的OC 患者的腫瘤組織標本和血漿ctDNA 進行檢測后發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織BRCA 回復突變（reversion mutations）陽性的5 例患者中有3 例ctDNA 檢測結(jié)果同樣陽性，ctDNA 檢測敏感度為60%，特異度為100%。另一方面，Arend 等[25]對14 例OC 患者新輔助化療前后組織與血漿樣本中的突變基因進行檢測后發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中，化療前6 個基因的38 個突變位點中，有33 個突變位點在化療后未發(fā)生變化；而在血漿ctDNA 中，化療前后ctDNA檢測結(jié)果的差異明顯，化療后檢出的54 個突變位點與化療前檢出的59 個突變位點相比，僅有6 個相同。Jagelkova 等[26]研究發(fā)現(xiàn)ctDNA 檢測結(jié)果與組織學檢測僅有33.3%的一致性。因此，ctDNA 能否真實反映腫瘤異質(zhì)性、其與組織學檢查是否具有一致性仍存在爭議，需要進一步研究。

2.3 殘存病灶檢測和復發(fā)監(jiān)測ctDNA 作為一種檢測手段可用于OC 殘存病灶檢測和復發(fā)監(jiān)測。腫瘤殘留病灶大小與OC 患者的預后有關(guān)，2006 年有研究證明在動物模型血漿中腫瘤特異性的ctDNA與OC 腫瘤質(zhì)量大小呈正相關(guān)（R2=0.81，P＜0.01）[27]。2016 年P(guān)arkinson 等[28]檢測了12 例OC 患者治療前血漿ctDNA 樣本中TP53 等位基因突變比例（TP53 mutant allele fraction，TP53MAF），分析TP53MAF 與CT 影像檢查測得的腫瘤體積的相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)，在復發(fā)性OC 組，腫瘤體積每增加1 cm3，TP53MAF 增加0.04%；在初次診斷OC 組，腫瘤體積每增加1 cm3，TP53MAF 增加0.000 8%。進一步分析藥物治療后TP53MAF 下降幅度與復發(fā)時間之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TP53MAF 下降＞60%表示預后良好，以TP53MAF下降≤60%來預測6 個月內(nèi)復發(fā)與否，預測的敏感度為71%，特異度為88%。該研究證實了ctDNA 可以監(jiān)測OC 復發(fā)。2020 年Noguchi 等[29]發(fā)現(xiàn)治療前血漿中ctDNA 含量高的OC 患者，無進展生存期（progression free survival，PFS）更短（P=0.01）。另一方面，Paracchini 等[30]分析46 例高級別漿液性OC 患者數(shù)據(jù)后得出相同結(jié)果，初次確診時ctDNA 含量比例較高組的PFS 短于ctDNA 含量比例較低組（14.7 個月vs.18.4 個月，P=0.02）；同時發(fā)現(xiàn)在采用了ctDNA來監(jiān)測疾病的19 例OC 患者中，ctDNA 比CA125 預測的復發(fā)時間平均提前240 d。

2.4 評估藥物治療反應性ctDNA 半衰期短，其含量與腫瘤質(zhì)量大小有關(guān)，在反映藥物治療效果時具有獨特的優(yōu)越性。Alves 等[31]對11 例晚期轉(zhuǎn)移性OC患者化療過程中的血漿ctDNA 進行了系統(tǒng)性監(jiān)測，通過分析發(fā)現(xiàn)，第1 個化療周期結(jié)束后ctDNA 含量升高患者組較不升高患者組，化療達到部分緩解及完全緩解的比例更高（80%vs.16.6%，P=0.035），PFS獲益更大（P=0.007 4）。Kim 等[22]通過對比28 例OC患者治療過程中TP53 等位基因突變數(shù)目（TP53 mutant allele count，TP53MAC）和CA125 水平變化，發(fā)現(xiàn)在手術(shù)和化療后TP53MAC 和CA125 水平均明顯下降，分析術(shù)后和每次化療后兩者下降百分數(shù)發(fā)現(xiàn)，兩者下降趨勢具有一致性，僅在首次化療后兩者下降幅度差異有統(tǒng)計學意義（11.7%vs.29.1%，P=0.011）。OC 患者的ctDNA 基因檢測結(jié)果可用于預測藥物治療效果及指導臨床用藥。Du 等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA BRAC2 N372H 多態(tài)性檢測陽性的4 例OC患者均出現(xiàn)了耐藥復發(fā)（PFS＜6 個月），而檢測陰性的患者中僅有35.3%（6/17）出現(xiàn)了耐藥復發(fā)。Rusan等[32]檢測了BRCA 突變的OC 患者ctDNA 中同源框基因A9（HOXA9）啟動子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在維利帕利（Veliparib）治療3 個療程后HOXA9 啟動子甲基化的患者結(jié)局更差。Vidula 等[33]在9 例實體腫瘤患者的ctDNA 中檢測到了BRCA 回復突變，9 例患者均出現(xiàn)了耐藥性，其中7 例在檢測之前使用多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase，PARP]抑制劑治療。Lin 等[34]對97 例BRCA 陽性的復發(fā)OC 患者ctDNA 進行BRCA 回復突變檢測，發(fā)現(xiàn)在鉑難治和鉑耐藥復發(fā)患者中BRCA 回復突變比例分別為18%和13%，而在鉑敏感患者中僅為2%，后續(xù)使用盧卡帕利（Rucaparib）治療，無BRCA 回復突變組PFS 明顯高于回復突變組（9 個月vs.1.8 個月，P＜0.000 1）。

3 結(jié)語

OC 作為主要生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，缺乏有效預防措施，在篩查和早期診斷方面缺少有效檢測手段，其對女性生命健康的威脅正在增大。ctDNA 作為一種新的生物標志物，在OC 診斷、治療和預后等方面的研究已初步顯示其優(yōu)越性。但目前在OC 長期管理過程中，CT 等影像學檢查方法和腫瘤標志物CA125 仍是監(jiān)測OC 復發(fā)的主要手段。然而隨著醫(yī)學的發(fā)展，傳統(tǒng)檢驗方法的不足之處逐漸暴露，不能滿足臨床工作的需求。ctDNA 在臨床診治過程中有著廣闊的應用前景，未來有望成為OC 診療管理過程中一種補充或替代現(xiàn)有檢測方法的新方案。但目前ctDNA 提取檢測標準尚未統(tǒng)一，對ctDNA 認識存在不足，ctDNA 在OC 診治中應用的研究證據(jù)尚不充分，致使ctDNA 在OC 臨床應用過程中仍面臨諸多障礙。未來需要對ctDNA 進行更深入的研究，也需要更多的臨床研究來驗證其臨床應用價值。