張 苗，曹俊宇

（1.山西農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，山西太原 030001；2.呂梁學院，山西呂梁 033000）

棗樹是一種適應能力非常強的植物[1]，能夠適應旱澇和酸堿等較為極端的環(huán)境，在我國南北方均可種植。棗樹結實周期短，開花量大，且果實營養(yǎng)豐富，能夠作為良好的結實植物、蜜源植物[2]。呂梁棗產(chǎn)業(yè)利用沿黃各縣紅棗種植的優(yōu)勢，大力發(fā)展紅棗種植加工，全區(qū)紅棗基地面積達到11.13 萬hm2，加工轉化達4 000 kg。形成了以“山西天淵、山西天驕”為龍頭的一大批紅棗加工企業(yè)，產(chǎn)品遠銷日本、韓國、歐美等國家和地區(qū)[3-4]。

棗樹炭疽病是由膠孢炭疽菌感染引起的且常見于棗樹的一種病害[5-6]。病菌一般侵染棗樹的果實、葉片和棗股等，被炭疽菌侵染后，葉片發(fā)黃、早落，產(chǎn)生黑褐色焦枯狀斑點[7]；棗果表面產(chǎn)生黑褐色、圓形并向下凹陷的斑塊，果肉也變成褐色的絲綿狀，味苦，無法食用[8]；棗股中的病原菌如不進行清理和殺滅，會與病果中的菌絲一同成為次年的侵染源[9]。在炭疽病流行的年份，產(chǎn)量損失可高達80%[10]。

碳、氮是微生物生長必須的重要元素和生命代謝的基礎物質(zhì)，能提供生物體生長、發(fā)育和繁殖所需要的能量[11-12]，且不同的碳源和氮源對病原菌生長的影響不同[13-14]。棗炭疽病是棗生產(chǎn)中常見的病害之一，在我國各大棗種植產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。棗一旦染上炭疽病，對其產(chǎn)量及品質(zhì)會造成較大影響，甚至會造成棗樹的死亡。因此，本文研究碳源和氮源營養(yǎng)對棗樹炭疽病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)以及菌絲干質(zhì)量三方面的影響，全面明確棗樹炭疽病菌最適的營養(yǎng)條件，為今后研究棗樹炭疽病菌的生物學特性、致病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棗樹炭疽病菌菌株采自河南清豐，經(jīng)北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司鑒定為膠孢炭疽病菌Glomerella cingulata（Stoneman）。不同碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉，不同氮源為硝酸鈉、硝酸鉀、谷氨酸、尿素、硫酸銨，均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

振蕩培養(yǎng)箱，ZHP100M 型，揚州三發(fā)科學儀器有限公司；干燥箱，DHG 型，上海善志儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 碳源對棗樹炭疽病菌菌絲生長的影響

參照張寶清等[15]的方法，略有改動。以察氏培養(yǎng)基為基礎，替換其中的蔗糖，配制不同碳源（葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉）的固態(tài)察氏培養(yǎng)基，并設無碳培養(yǎng)基作為空白對照。從培養(yǎng)7 d 的供試菌落邊緣，打取長勢相似的菌碟（直徑6 mm），分別接入不同碳源的固體培養(yǎng)基中央，于25 ℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)，7 d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，同時記錄病菌長勢特征（菌絲密度、邊緣整齊度），每組處理進行3 次重復。

1.3.2 碳源對棗樹炭疽病菌產(chǎn)孢量的影響

1.3.1中不同碳源培養(yǎng)基對菌絲生長的影響記錄完畢后，在固體培養(yǎng)基上滴加蒸餾水，刮取菌絲并用雙層紗布過濾，取濾液1 mL 定容至5 mL，制成孢子懸液。取潔凈的血細胞計數(shù)板一塊，將蓋玻片蓋在計數(shù)區(qū)。使用振蕩培養(yǎng)箱將菌懸液充分搖勻，用滴管吸取少許，滴加于蓋玻片下邊緣。靜置片刻，使細胞沉降到計數(shù)板上，不再隨液體流動。將血球計數(shù)板置于顯微鏡的載物臺上，先在10×10 倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉換至10×40 倍鏡下觀察并計數(shù)，計算孢子數(shù)[12]。計算公式見式（1）。

式中，X為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 碳源對棗樹炭疽病菌菌絲干質(zhì)量的影響

以液態(tài)察氏培養(yǎng)基為基礎，制備不同碳源（葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉）的液體培養(yǎng)基，并設無碳培養(yǎng)基作為空白對照。滅菌后分裝于250 mL 錐形瓶中，每瓶裝入100 mL。從培養(yǎng)7 d 的供試菌落邊緣，打取長勢相似的菌碟（直徑6 mm），分別接入液體培養(yǎng)基中，每個錐形瓶接菌碟兩塊，置于振蕩培養(yǎng)箱中以120 r/min轉速連續(xù)震蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)7 d 后，用已烘干且稱量質(zhì)量的濾紙過濾，將菌絲連同濾紙一起放入干燥箱內(nèi)，90 ℃烘干處理2 h，隨后稱量菌絲的干質(zhì)量，每組處理進行3次重復。

1.3.4 氮源對棗樹炭疽病菌菌絲生長的影響

參照李青等[16]的方法，略有改動。以察氏培養(yǎng)基為基礎，替換其中的硝酸鈉，配制不同氮源（硝酸鈉、硝酸鉀、谷氨酸、尿素、硫酸銨）的固態(tài)察氏培養(yǎng)基，并設無氮培養(yǎng)基作為空白對照。其余同1.3.1。

1.3.5 氮源對棗樹炭疽病菌產(chǎn)孢量的影響

1.3.4中不同氮源培養(yǎng)基對菌絲生長的影響記錄完畢后，按照1.3.2 的方法制備好孢子懸浮液并計數(shù)。

1.3.6 氮源對棗樹炭疽病菌菌絲干質(zhì)量的影響

處理設置同1.3.4，基礎培養(yǎng)基不加瓊脂，制備成不同氮源（硝酸鈉、硝酸鉀、谷氨酸、尿素、硫酸銨）的液體察氏培養(yǎng)基，并設無氮培養(yǎng)基作為空白對照，按照1.3.3 的方法稱量菌絲干質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實驗所收集數(shù)據(jù)均使用SPSS 26.0 軟件進行處理及分析。所測指標使用Shapiro-Wilks 進行正態(tài)分布檢測，發(fā)現(xiàn)均基本符合正態(tài)分布，因此采用一般線性模型（GLM）進行單變量方差分析，利用Duncan 法進行不同處理組間的多重比較。文中圖片均在Excel 2010 中繪制。

2 結果與分析

2.1 碳源對棗樹炭疽病菌的影響

2.1.1 不同碳源對病菌菌絲生長的影響

由表1 可知，不同碳源對棗樹炭疽病菌菌落長勢影響各不相同。菌絲密度由大到小的處理依次為葡萄糖（最濃密）、可溶性淀粉（濃密）、麥芽糖（濃密）、果糖（濃疏）、無碳源（較稀疏）、蔗糖（稀疏）。對于色澤，菌落在不同碳源的培養(yǎng)基上均呈同心輪紋狀，從中央到邊緣顏色由深變淺。對于菌落整齊度，除蔗糖和CK 處理邊緣不規(guī)則外，其他處理菌落均生長整齊。對于菌絲生長速率而言，碳源對其的影響是顯著的（F5,12=36.86，P＜0.001）。除蔗糖外，與CK 組生長速率（8.14±0.14）mm/d 相比，其余碳源的加入均有利于棗樹炭疽病菌的生長，但是利用程度也存在差異。其中葡萄糖為碳源時，利用率最高，菌絲生長速率可達（10.04±0.10）mm/d；可溶性淀粉、麥芽糖次之，菌絲生長速率分別為（9.39±0.30）、（9.27±0.18）mm/d；果糖為碳源時，病菌利用率較差，菌絲生長速率為（8.51±0.11）mm/d。

表1 不同碳源對棗樹炭疽病菌菌絲生長狀況的影響Table 1 Effects of different carbon sources on the mycelium growth of G. cingulata

2.1.2 不同碳源對病菌產(chǎn)孢量的影響

由圖1 可知，不同碳源對棗樹炭疽病菌產(chǎn)孢量有極顯著的影響（F5,12=9.494，P=0.001），且與CK 組產(chǎn)孢量0.58×106個相比，其余碳源的加入均有利于棗樹炭疽病菌孢子的產(chǎn)生，但是產(chǎn)孢量也存在差異。其中，當可溶性淀粉為碳源時，產(chǎn)孢量最多，達5.33×106個；當葡萄糖、果糖、麥芽糖次之，產(chǎn)孢量相當，分別為4.04×106、4.08×106和4.08×106個；蔗糖為碳源時，產(chǎn)孢量最少，僅為3.29×106個。

圖1 不同碳源對棗樹炭疽病菌產(chǎn)孢量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the spore yields of G. cingulata

2.1.3 不同碳源對病菌菌絲干質(zhì)量的影響

由圖2 可知，不同碳源液體培養(yǎng)基對棗樹炭疽病菌菌絲干質(zhì)量均產(chǎn)生了顯著的影響（F5，2=5.106，P=0.010）。與CK 組菌絲平均干質(zhì)量（0.02 g）相比，其余碳源的加入均有利于棗樹炭疽病菌菌絲的生長。其中，病菌在以可溶性淀粉為碳源的液體培養(yǎng)基中，菌絲生長量最大，干質(zhì)量達到了0.41 g；在以蔗糖、葡萄糖、麥芽糖為碳源時，菌絲生長量次之（三者之間無顯著差異），干質(zhì)量分別為0.37、0.23、0.22 g；在以果糖為碳源的液體培養(yǎng)基中菌絲生長量最小，干質(zhì)量為0.19 g。

圖2 不同碳源對棗樹炭疽病菌菌絲干質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the mycelial dry weight of G. cingulata

2.2 氮源對棗樹炭疽病菌的影響

2.2.1 不同氮源對病菌菌絲生長的影響

由表2 可知，不同氮源對棗樹炭疽病菌菌絲生長速率的影響非常顯著（F5,12=75.673，P＜0.001）。以硝酸鈉、谷氨酸為氮源時，病菌菌絲生長良好，生長速率快，分別為（9.29±0.22）mm/d、（9.21±0.10）mm/d；以尿素、硫酸銨為氮源時，生長速率較慢，分別為（6.45±0.05）mm/d 和（6.75±0.02）mm/d，且病菌菌絲較稀疏，菌落邊緣不整齊，整體長勢較差；對于無氮源處理組而言，病菌菌絲生長速率較快，為（9.11±0.06）mm/d，但菌絲稀疏，邊緣不整齊，整體長勢最差。

表2 不同氮源對棗樹炭疽病菌菌絲生長狀況的影響Table 2 Effects of different nitrogen sourceson the mycelium growth of G. cingulata

2.2.2 不同氮源對病菌產(chǎn)孢量的影響

由圖3 可知，不同氮源處理對棗樹炭疽病菌產(chǎn)孢量有極顯著的影響（F512=27.349，P＜0.001），且與CK 組產(chǎn)孢量（0.83×106）個相比，其余氮源的加入均有利于棗樹炭疽病菌孢子的產(chǎn)生，但是產(chǎn)孢量也存在差異。其中，硝酸鉀、硝酸鈉、谷氨酸為碳源時，產(chǎn)孢量較多，分別是8.50×106、8.33×106、7.25×106個；尿素、硫酸銨次之，分別為4.42×106、3.83×106個。

圖3 不同氮源對棗樹炭疽病菌產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the spore yields of G. cingulata

2.2.3 不同氮源對病菌菌絲干質(zhì)量的影響

由圖4 可知，不同氮源液體培養(yǎng)基對棗樹炭疽病菌菌絲干質(zhì)量均產(chǎn)生了顯著的影響（F5,12=26.652，P＜0.001）。與CK 組菌絲平均干質(zhì)量（0.003 g）相比，其余氮源的加入均有利于棗樹炭疽病菌菌絲的生長。其中，病菌在以谷氨酸、尿素為碳源的液體培養(yǎng)基中，菌絲生長量最大，干質(zhì)量分別達到了0.49、0.46 g；在以硝酸鉀、硫酸銨和硝酸鈉為碳源時，菌絲生長量次之（三者之間無顯著差異），干質(zhì)量分別為0.28、0.28、0.24 g。

圖4 不同氮源對棗樹炭疽病菌菌絲干質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the mycelial dry weight of G. cingulata

3 總結

營養(yǎng)元素是病原菌生長不可缺少的條件，碳源和氮源是病菌生長中最基本、最重要的兩大要素[15]，結果表明，棗樹炭疽病菌能利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉5 種供試碳源，但對不同碳源之間的利用程度有差異。從平板菌絲的整體生長狀況而言，最佳碳源是葡萄糖，而蔗糖作為碳源時不利于平板病菌的生長，這與王艷等[17]關于鐵皮石斛炭疽病菌（G.cingulata）和鄧先瓊等[18]關于布朗李炭疽病菌（G.cingulata）研究結果有所不同。這可能與寄主的變化有關。對于病菌產(chǎn)孢量與菌絲干質(zhì)量而言，相較于無碳源環(huán)境，碳源的存在更適合病菌的生長，當碳源是可溶性淀粉時，產(chǎn)孢量最多，菌絲干質(zhì)量也最大，說明這種碳源既適合液體菌絲生長，也適合產(chǎn)孢；當碳源是葡萄糖、果糖、麥芽糖時，產(chǎn)孢量較高，干質(zhì)量較低，說明這三種碳源更適宜病菌孢子的生長；當碳源是蔗糖時，產(chǎn)孢量最少，但干質(zhì)量較高，說明此碳源更適宜液體菌絲的生長。這與陳國平等[19]對梨炭疽病菌（G.gloeosporioides）和唐爽爽等[20]對西瓜炭疽病菌（G.orbiculare）所報道的蔗糖最適宜產(chǎn)孢的結果不同，這可能與種間差異或者寄主植物不同有關。

棗樹炭疽病可利用有機氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮等多種氮源，但是利用程度同樣存在差異，結果顯示，從平板菌絲的整體生長以及產(chǎn)孢量來看，本試驗中供試的5 種氮源（硝酸鈉、尿素、硝酸鉀、硫酸銨、谷氨酸），整體來看，硝酸鈉最適宜作為氮源，硫酸銨作為氮源時利用率最差，尿素次之，該病菌對氮源硝酸鈉的高效利用與張寶清等[15]對海棠炭疽病菌（G.truncatum）和湯吉[21]對棉花炭疽病菌（Colletotrichumsp.）的研究結果相吻合。硫酸銨作為氮源對棗樹炭疽病菌生長的抑制作用，與范昆等[22]對無花果炭疽病菌（G.gloeosporioides）和鐘榮順等[13]對大豆炭疽病菌（G.truncatum）的研究結果相類似。對于菌絲干質(zhì)量而言，尿素作為氮源時液體菌絲生長量較好，硝酸鈉最差。

總之，雖然棗樹炭疽病菌在不同碳氮源培養(yǎng)基中均能生長，但對菌絲生長狀況、產(chǎn)孢量以及菌絲干質(zhì)量的影響有較大差異。因此，僅通過單一指標的比較，不能客觀地反映病菌的生長狀況。本試驗將固體培養(yǎng)基上菌絲生長速率、產(chǎn)孢量與液體培養(yǎng)基菌絲干質(zhì)量等指標綜合考察，有利于真實地反映炭疽菌病菌生長與營養(yǎng)之間的關系，為進一步完善棗樹炭疽病菌的營養(yǎng)生理、生物學特性提供一定的參考。