張濤,岳淵,肖漓

1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,佳木斯 154007;2.中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)部研究所,北京市器官移植與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

急性肺損傷(ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭,是呼吸科常見的危重疾病之一[1]。據(jù)報(bào)道,ALI患者的病死率達(dá)35%～40%[2]。其臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、痰中帶血,部分患者可伴有呼吸困難或胸痛,ALI發(fā)展至嚴(yán)重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)[3]。導(dǎo)致ALI患者的原因有很多,如感染、休克、嚴(yán)重非胸部創(chuàng)傷、重度燒傷、大量輸血、急性胰腺炎及藥物中毒,或吸入煙塵、氧中毒及放射性損傷等[4]。由于ALI患者病死率居高不下,故早期快速診斷以及探索有效的治療方法意義重大。

近年來,越來越多的研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)及其分泌的外泌體可以治療ALI,MSC可以分泌多種細(xì)胞因子,MSC來源的外泌體(MSC-exo)則可以通過所攜帶的miRNA和蛋白質(zhì)作用于靶細(xì)胞,通過不同的機(jī)制來干預(yù)和調(diào)控ALI的發(fā)展[5-6]。MSC釋放的外泌體不僅有類似于干細(xì)胞的趨化作用,而且其免疫原性較弱,具有非常好的發(fā)展前景[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)其他細(xì)胞如肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等分泌的外泌體也對(duì)ALI的修復(fù)發(fā)揮一定作用。

1 外泌體的概念與生物學(xué)特性

外泌體是直徑30～100 nm的囊泡樣小體,屬于一種細(xì)胞外囊泡(EV),由多種細(xì)胞主動(dòng)向胞外分泌,包含復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)。其首次發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代,Trams等[8]觀察到網(wǎng)織紅細(xì)胞在成熟期間會(huì)分泌一種含有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的小囊泡,介導(dǎo)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的清除。在此后的十余年間,外泌體僅被看作是細(xì)胞清除代謝廢物的工具[9]。直到20世紀(jì)90年代末,Zitvogel等[10]研究表明,外泌體可能是細(xì)胞間通訊的重要媒介,這才重新激起了人們對(duì)外泌體研究的興趣。人體中幾乎所有類型的細(xì)胞都能產(chǎn)生外泌體,它可以從多種體液中被分離出來,包括血液、尿液、肺泡灌洗液(BALF)、唾液和腦脊液等。外泌體通過內(nèi)體和質(zhì)膜2種途徑產(chǎn)生,其中研究最多的是內(nèi)體途徑(即先由質(zhì)膜出芽形成早期內(nèi)體,然后早期內(nèi)體萌發(fā)腔內(nèi)囊泡形成囊泡小體,最終囊泡小體與質(zhì)膜融合釋放外泌體),也可以從質(zhì)膜直接出芽形成(即質(zhì)膜途徑)。

外泌體參與多種生理和病理過程,具有促凝和抗凝作用、促炎和抗炎作用、促血管生成等多種生物學(xué)活性。外泌體具有以下特點(diǎn):①結(jié)構(gòu)特殊,特性穩(wěn)定,可以長時(shí)間低溫保存且不改變其活性;②體積小,可避免微循環(huán)阻塞;③外泌體表面有磷脂膜,可保證多種生物活性成分不易被酶降解。相比于細(xì)胞,外泌體在治療方面更具優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力。因此,外泌體的研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域日益受到矚目。

目前研究證實(shí),外泌體是細(xì)胞間的通訊方式之一,可以完成細(xì)胞間遺傳物質(zhì)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的交換[11]。外泌體通過不同的途徑將信息傳遞給靶細(xì)胞,主要包括:①外泌體膜上的蛋白直接與靶細(xì)胞膜上的蛋白接觸,觸發(fā)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián);②外泌體胞膜與靶細(xì)胞胞膜融合,釋放其內(nèi)容物進(jìn)入靶細(xì)胞;③靶細(xì)胞直接吞噬外泌體并將其內(nèi)化為組成部分。

2 外泌體的生物學(xué)功能

細(xì)胞凋亡的調(diào)控異常會(huì)導(dǎo)致多種疾病,ALI是由于細(xì)胞凋亡和肺部炎癥反應(yīng)過度而導(dǎo)致組織損傷加重。其中脂多糖(LPS)誘導(dǎo)肺損傷后的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致ALI的主要途徑之一。Liu等[1]研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)來源的外泌體(BMSC-exo)可有效抑制LPS誘導(dǎo)肺損傷后肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)中的自噬體和自溶酶體斑點(diǎn)的形成,進(jìn)而阻止LPS誘導(dǎo)的AMs凋亡。Mao等[12]研究表明,BMSC-exo在硫芥(SM)導(dǎo)致的ALI中具有抗細(xì)胞凋亡的作用。SM是一種可導(dǎo)致ALI的劇毒化學(xué)試劑。結(jié)果顯示,注射BMSC-exo 24 h后,凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少。

外泌體不僅可以抑制細(xì)胞凋亡,同時(shí)具有促炎或抗炎作用。ALI時(shí)出現(xiàn)肺內(nèi)炎癥反應(yīng)不可控,大量炎癥細(xì)胞和炎癥因子釋放。AMs是駐留在肺組織中的主要免疫細(xì)胞,它通過釋放過量的炎癥細(xì)胞因子,促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤和肺組織損傷,這在ALI發(fā)病機(jī)制中起核心作用。肺泡上皮細(xì)胞(AEC)是一種具有較大表面積的肺部結(jié)構(gòu)細(xì)胞,在肺損傷過程中AEC通常最先被破壞。而外泌體在AMs和AEC之間的信息傳遞中發(fā)揮重要作用。Sui等[13]研究表明,巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液用LPS處理后,分離純化出外泌體,檢測(cè)到外泌體中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6的水平顯著升高,說明用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后,該細(xì)胞分泌的外泌體具有促炎作用。Liu等[14]研究證實(shí),AECs來源的外泌體(AECs-exo)可能是造成膿毒癥急性肺損傷炎癥加重的原因之一。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AECs分泌的外泌體中的miRNAs可以將炎癥信號(hào)傳遞給活化的巨噬細(xì)胞,進(jìn)而引發(fā)肺內(nèi)炎癥,這表明AEC-exo在膿毒癥急性肺損傷中具有促炎作用。

Li等[15]使用LPS和MSC-exo處理Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(MLE-12),觀察炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-10)的表達(dá)。結(jié)果顯示,與LPS處理組相比,經(jīng)MSC-exo處理的細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)顯著下調(diào),提示MSC-exo具有抗炎作用。Liu等[1]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS刺激后的血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高,隨后在靜脈或氣管內(nèi)注射BMSC-exo,TNF-α、IL-1β和IL-6的水平可顯著受到抑制。上述表明BMSC-exo可以有效減輕LPS引起的炎癥反應(yīng)。

3 外泌體治療ALI可能的作用機(jī)制

3.1 外泌體通過調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用 PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控多種生理過程,包括細(xì)胞凋亡、增殖和分化。Mizuta等[16]研究證實(shí),在組蛋白導(dǎo)致的ALI中,使用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)外泌體的抑制劑GW4869后,Akt磷酸化水平下調(diào),這說明Akt磷酸化是由ADSCs來源的外泌體(ADSCs-exo)誘導(dǎo)的。ADSCs-exo在上調(diào)Akt磷酸化水平的同時(shí),也激活了PI3K/ Akt信號(hào)通路,從而減輕組蛋白導(dǎo)致的ALI。上述結(jié)果證明了ADSCs-exo通過PI3K/Akt信號(hào)通路減輕肺損傷程度。已知機(jī)體在受到感染后,炎癥反應(yīng)需要啟動(dòng)NF-κB信號(hào)通路。Li等[15]選取了Ho-1、GPX-1、Nrf-2、NF-κb和GR等5個(gè)與NF-κb信號(hào)通路相關(guān)的基因,探討MSC-exo能否通過NF-κb信號(hào)通路改善LPS誘導(dǎo)的ALI。結(jié)果顯示,輸注MSC-exo后,上述5個(gè)基因的表達(dá)受到顯著調(diào)控,并且炎癥反應(yīng)程度減輕,證明了MSC-exo可通過NF-κB信號(hào)通路改善LPS誘導(dǎo)的ALI。

3.2 外泌體通過miRNA發(fā)揮作用 近幾年的研究表明,外泌體中的miRNA在細(xì)胞間微通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用,外泌體通過促進(jìn)miRNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞而成為細(xì)胞間通訊的重要使者[17-18]。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)可參與損傷血管的修復(fù),減輕血管滲漏和炎癥反應(yīng),并增強(qiáng)細(xì)菌清除[19-20]。Zhou等[21]研究指出EPC來源的外泌體(EPC-exo)在膿毒癥中可以預(yù)防內(nèi)皮功能障礙和肺損傷,原因之一是它們攜帶了miRNA-126。miRNA-126是一種重要的血管生成信號(hào)調(diào)節(jié)因子,可以維持血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁的完整性。實(shí)驗(yàn)表明EPC-exo能夠?qū)iRNA-126轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞中,從而降低與ARDS發(fā)展相關(guān)的基因表達(dá)。此外,靜脈注射EPC-exo可減輕小鼠膿毒癥急性肺損傷,其原因也是依賴于miRNA-126的存在。

Yi等[22]為了證明MSC-exo分泌miRNA-30b-3p對(duì)LPS處理的MLE-12細(xì)胞的影響,將過表達(dá)miRNA-30b-3p的MSC-exo注射入ALI小鼠中,檢測(cè)MLE-12 細(xì)胞的增殖、凋亡情況。結(jié)果顯示,攜帶miRNA-30b-3p的MSC-exo可通過促進(jìn)MLE-12增殖和抑制其凋亡對(duì)LPS導(dǎo)致的ALI發(fā)揮治療作用,緩解ALI小鼠肺損傷。

Xu等[23]使用光氣誘導(dǎo)大鼠ALI后,從大鼠BALF中分離出外泌體,發(fā)現(xiàn)外泌體促進(jìn)了MSC增殖和IL-10釋放。通過miRNA譜分析,發(fā)現(xiàn)miRNA-28-5p在促進(jìn)MSC增殖中發(fā)揮作用,且miRNA-28-5p可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路。

Li等[18]從大鼠的MSC中提純出外泌體,發(fā)現(xiàn)miRNA-124-3p在MSC-exo中大量表達(dá)。將MSC-exo 注射入ALI大鼠中,發(fā)現(xiàn)MSC-exo miRNA-124-3p可提高ALI大鼠存活率,并增強(qiáng)其肺組織中谷胱甘肽/超氧化物歧化酶活性。經(jīng)miRNA-124-3p處理的大鼠BALF中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。上述結(jié)果表明,MSC-exo攜帶的miRNA-124-3p可改善ALI應(yīng)激損傷。

3.3 外泌體通過調(diào)控自噬發(fā)揮作用 自噬是指細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡,與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其包裹內(nèi)容物,借此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝和某些細(xì)胞器更新。自噬在生理和病理過程中都可發(fā)生,其在ALI中所起的作用尚未完全闡明。Liu等[1]研究表明BMSC-exo在LPS刺激后的肺泡巨噬細(xì)胞中顯著降低了Beclin-1表達(dá)。Beclin-1基因是一種自噬相關(guān)基因,與Bcl-2基因相互拮抗而調(diào)控自噬。BMSC-exo通過抑制肺泡巨噬細(xì)胞自噬而減輕LPS導(dǎo)致的ALI。而Wei等[2]研究表明,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hucMSCs)釋放的外泌體通過增強(qiáng)自噬和抑制炎癥因子表達(dá)而緩解LPS誘導(dǎo)的ALI。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在新冠肺炎治療中發(fā)揮作用

2020年，由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎在全球爆發(fā)。新冠肺炎患者死亡的主要原因是低氧性呼吸衰竭,最終導(dǎo)致ARDS[24]。新冠肺炎的大流行給全球公共衛(wèi)生和國際經(jīng)濟(jì)帶來巨大的負(fù)面影響[25]。外泌體含有與其來源細(xì)胞相似的成分,如MSC-exo與MSC在功能上一致,而MSC-exo有更多的優(yōu)勢(shì),如穿透血液屏障、有較低的免疫原性、無腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、可以大規(guī)模制造等,而且MSC-exo成本更加低廉,因此MSC-exo成為治療新冠肺炎潛在治療方案之一[26-27]。

Sengupta等[28]對(duì)24例新冠肺炎患者進(jìn)行了臨床試驗(yàn)研究以評(píng)估BMSC-exo的安全性和有效性。BMSC-exo經(jīng)靜脈注射后,細(xì)胞因子風(fēng)暴顯著減輕,患者缺氧情況顯著改善,且72 h內(nèi)無不良反應(yīng)。Zhang等[29]表明表達(dá)hACE2的外泌體可以與細(xì)胞上的hACE2競(jìng)爭性結(jié)合SARS-CoV-2的刺突蛋白,從而阻斷病毒侵入宿主細(xì)胞。Khalaj等[30]認(rèn)為外泌體作為一種新冠肺炎的新型治療方法具有巨大的潛力,外泌體可降低肺炎癥反應(yīng),使受損肺泡上皮和內(nèi)皮細(xì)胞再生修復(fù),防止肺纖維化。

在新冠肺炎大流行期間,我們一直在探尋關(guān)于外泌體治療新冠肺炎合理有效的方法,并在臨床試驗(yàn)方案中評(píng)估其安全性和有效性,這些研究成果對(duì)于SARS-CoV-2來說是非常有價(jià)值的。

5 總結(jié)與展望

不同細(xì)胞來源的外泌體作用差別很大。如MSC-exo可以預(yù)防早期缺氧引起的肺部炎癥,修復(fù)內(nèi)皮屏障,減輕肺水腫,恢復(fù)肺泡清除率,改善急性肺損傷患者的呼吸功能;而BALF中巨噬細(xì)胞的外泌體則會(huì)分泌促炎因子,促進(jìn)肺部發(fā)生炎癥反應(yīng);肺泡上皮細(xì)胞釋放的外泌體可將炎癥信號(hào)傳遞給活化的巨噬細(xì)胞而引發(fā)肺內(nèi)炎癥;EPC-exo則可以通過miR-126減輕ALI。

與藥物治療相比,外泌體治療方法有很大的優(yōu)勢(shì):①外泌體免疫原性較低,可以避免免疫應(yīng)答激活;②外泌體作為一種新型療法,其尺寸小可深入到大多數(shù)組織內(nèi)部;③外泌體有良好的生物穩(wěn)定性,可裝載藥物;④外泌體可保持良好的生物相容性,能攜帶多種類型的生物分子;⑤外泌體可對(duì)其表面特異性受體進(jìn)行加工,以實(shí)現(xiàn)將治療性分子作用于靶細(xì)胞等。這都使得其在治療ALI中存在良好的應(yīng)用前景。