摘要：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與代謝組學(xué)探討枳實-厚樸藥對治療慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）的潛在作用機制。使用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺篩選枳實與厚樸的化學(xué)成分及作用靶點，通過GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫搜集STC的疾病預(yù)測靶點，運用維恩圖獲得成分與疾病的交集靶點，采用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，運用Cytoscape 3.8.0軟件計算并篩選關(guān)鍵靶點，同時繪制中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，利用Metascape數(shù)據(jù)庫對交集靶點進(jìn)行GO（gene ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析。采用洛哌丁胺誘導(dǎo)法構(gòu)建STC小鼠模型，給予枳實+厚樸灌胃給藥后，對小鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行基于氣相色譜聯(lián)合飛行時間質(zhì)譜（GC/TOF-MS）的非靶向代謝組學(xué)檢測，分析差異性代謝物。結(jié)果獲得枳實-厚樸藥對活性成分共24種，與STC疾病相關(guān)的交集靶點共106個，其中度值排名靠前的關(guān)鍵靶點包括AKT1、TNF、TP53、IL6、CASP3、JUN。GO分析發(fā)現(xiàn)可能涉及的生物學(xué)過程包括細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、蛋白磷酸化的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、離子傳輸?shù)恼{(diào)節(jié)等。KEGG分析可能涉及的通路包括癌癥通路、PI3K-AKT信號通路、鈣信號通路、5-羥色胺能突觸信號通路等。非靶向代謝組學(xué)檢測共發(fā)現(xiàn)21種差異性代謝物，包括Akt相關(guān)性代謝物煙酸、果糖、原兒茶酸。本研究揭示枳實-厚樸藥對通過多成分、多靶點、多通路對STC發(fā)揮治療作用，其活性成分柚皮素和木犀草素，關(guān)鍵靶點Akt及相關(guān)性代謝物值得特別關(guān)注，這為后續(xù)基礎(chǔ)研究提供了思路與理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：枳實；厚樸；慢傳輸型便秘；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；代謝組學(xué)

中圖分類號：R285文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-4026（2023）03-0018-09

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

Abstract∶The potential action mechanism of aurantii fructus immaturus and magnoliae officinalis cortex in the treatment of slow transit constipation （STC） was investigated via network pharmacology and metabolomics.The chemical ingredients and targets of aurantii fructus immaturus and magnoliae officinalis cortex were obtained using the traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform. The disease prediction targets of STC were collected through the GeneCards， OMIM， and DisGeNET databases. The intersection targets of ingredients and diseases were obtained using Venn diagrams. The STRING database was used to construct the protein-protein interaction network. The Cytoscape 3.8.0 software was used to calculate and screen the key targets， and then the network diagram of TCM-ingredient targets was plotted. The gene ontology（GO） functional enrichment analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of the intersection targets were performed using the Metascape database. A loperamide-induced STC mouse model was used in the study. After intragastric administration of aurantii fructus immaturus and magnoliae officinalis cortex， GC/TOF-MS-based untargeted metabolomics of cecal contents was performed to analyze differential metabolites. A total of 24 active ingredients and 106 intersection targets were obtained. The key targets with higher degree values included AKT1， TNF， TP53， IL6， CASP3， and JUN. GO analysis revealed that the possible processes were cellular response to nitrogen compound， cellular response to lipid， positive regulation of protein phosphorylation， regulation of inflammatory response， regulation of ion transport， etc. KEGG analysis revealed the pathways involved in cancer， the PI3K-Akt signaling pathway， the calcium signaling pathway， serotonergic synapse， etc. In addition， 21 differential metabolites were found via untargeted metabolomics， including the Akt-associated metabolites nicotinic acid， fructose， and protocatechuic acid. The results suggested that aurantii fructus immaturus and magnoliae officinalis cortex exerted therapeutic effects on STC via multi-ingredient， multi-target and multi-pathway mechanisms， thereby providing ideas and a theoretical basis for future basic research. The active ingredients naringenin and lignan， as well as the key target Akt and its related metabolites， deserves special attention.

Key words∶Aurantii Fructus Immaturus; Magnoliae Officinalis Cortex; slow transit constipation; network pharmacology; metabolomics

慢傳輸型便秘（slow transit constipation， STC）是由于結(jié)腸運輸能力減弱，以腸道內(nèi)容物傳輸緩慢為特征的一類頑固性便秘，約占功能性便秘的45.5%[1]。STC的臨床表現(xiàn)為長期便次減少，便意缺失，排便時間延長，糞便干結(jié)，呈羊糞狀或球狀，部分患者伴有腹脹、左下腹隱痛等不適癥狀。中醫(yī)學(xué)上將便秘歸為“便秘” “脾約” “后不利”等范疇。《金匱翼·便秘》指出“氣內(nèi)滯，而物不行也”，大腸傳導(dǎo)失司，氣機郁滯，通降失職，糟粕內(nèi)停為本病基本病機，即如《丹溪心法》所云“當(dāng)升者不得升，當(dāng)降者不得降，當(dāng)變化者不得變化也，傳化失常”[2]。

對于STC病機的認(rèn)識，目前普遍認(rèn)為應(yīng)當(dāng)屬于中醫(yī)學(xué)“虛秘”范疇，為本虛標(biāo)實之證。究其本源，多為中焦脾胃虛弱，納運失職，氣機升降失常，氣虛則大腸傳導(dǎo)無力，不能推動腸內(nèi)糟粕運行[3]。歸納總結(jié)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院曹永清教授561首治療便秘中藥內(nèi)服處方，共涉及中藥113味，按選用頻次高低排序，排名前5的中藥依次為枳實、厚樸、黨參、茯苓、川楝子[4]；河北省中醫(yī)院李佃貴教授治療便秘90首處方中，最為常用的前5位中藥分別是枳實、大黃、厚樸、當(dāng)歸、川芎[5]；廣東省中醫(yī)院黃穗平教授治療便秘176首處方中，使用頻率最高的5味中藥依次為枳實、炙甘草、黃芪、厚樸、火麻仁[6]。分析當(dāng)代醫(yī)家治療便秘的組方特點及用藥規(guī)律，我們可以發(fā)現(xiàn)“枳實”與“厚樸”兩味中藥在臨床治療便秘組方配伍中的選用頻率排名前列。

枳實與厚樸皆屬苦泄辛散性溫，“辛”能行，能散，引氣上行，“苦”能降，能瀉，苦瀉下行，苦辛通降，調(diào)理脾胃氣機，具有較強的行氣消積作用，同為消除脹滿的要藥。枳實-厚樸藥對出自張仲景《傷寒論》，此兩藥之配伍自古至今被認(rèn)為具有協(xié)同增效的作用。因此，本研究以枳實-厚樸藥對作為研究對象，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選枳實與厚樸的有效成分及作用靶點，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時結(jié)合非靶向代謝組學(xué)研究，探索其治療STC的潛在作用機制，為下一步研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1枳實、厚樸活性成分及作用靶點的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）中分別檢索枳實、厚樸的化學(xué)成分，選擇口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為參考標(biāo)準(zhǔn)篩選出活性成分，而后獲得活性成分的靶點信息。此時得到的靶點信息為蛋白名稱，利用Unitprot數(shù)據(jù)庫（http：// uniprot.org/）進(jìn)行檢索轉(zhuǎn)化為基因名稱。

1.2STC疾病相關(guān)靶點篩選

以“slow transit constipation”為關(guān)鍵詞在OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）中檢索STC疾病相關(guān)靶點，將上述3個數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點信息刪除重復(fù)項后，得到本次研究的疾病預(yù)測靶點庫。

1.3藥物-疾病交集靶點獲取

利用Venny 2.1在線工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將枳實、厚樸活性成分的作用靶點同STC疾病預(yù)測靶點庫進(jìn)行交集，從而得到枳實-厚樸藥對在STC治療中的潛在作用靶點。

1.4構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

將1.3節(jié)得到的交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），選擇Mutiple proteins分析，選擇Organisms為Homo Sapiens，設(shè)置minimumrequired interaction score為medium confidence（0.400），得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）信息，以STV 格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5拓?fù)浞治黾瓣P(guān)鍵靶點篩選

利用Cytoscape軟件中的Centiscape 2.2插件計算每個靶點的連接度（degree），按照度值由高到低進(jìn)行排列，排位越靠前代表此成分靶點越關(guān)鍵。同時利用Cytoscape軟件繪制中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6GO富集分析與KEGG通路富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/gp/index.html）對1.3節(jié)得到的交集靶點數(shù)據(jù)進(jìn)行基因本體（gene ontology， GO）功能富集分析和京都基因和基因組大百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路富集分析，預(yù)測枳實-厚樸藥對治療STC的潛在機制。

1.7實驗動物及分組

6～8周齡，18～22 g，清潔級，雄性，C57BL/6小鼠，共18只，購于常州卡文斯實驗動物有限公司（SCXK（蘇）2021-0010），飼養(yǎng)于無錫市人民醫(yī)院實驗動物中心屏障級環(huán)境設(shè)施中。飼養(yǎng)溫度為24～26 ℃，濕度為50％～70％，12 h/12 h固定明暗周期。本項目通過無錫市中醫(yī)醫(yī)院動物倫理審查（倫理審批號SSB2022011001）。所有小鼠適養(yǎng)一周后隨機分為3組，即正常組（NC組）、便秘模型組（STC組）和枳實+厚樸治療組（ZS+HP 組），每組各6只。STC組和ZS+HP組小鼠利用洛哌丁胺灌胃法構(gòu)建便秘模型，方法為按10 mg/kg體重劑量給予洛哌丁胺（西安楊森制藥，批號：LGJ0448）灌胃，1次/d；NC組小鼠給予0.2 mL生理鹽水灌胃，1次/d。ZS+HP組小鼠按12.0 g/kg劑量給予枳實+厚樸水提液（V（枳實）：V（厚樸）=1：1）灌胃，1次/d。NC組和STC組小鼠則給予相同劑量的生理鹽水灌胃。

1.8樣本采集及處理

造模后第8 d，所有小鼠禁食12 h后頸椎脫臼處死，取小鼠盲腸內(nèi)容物，速凍后置于-80 ℃冰箱保存。稱取5 mg凍干糞便樣品放置在離心管中，然后與10 μL內(nèi)標(biāo)混合，每份樣品再加入50 μL預(yù)冷后的50%甲醇，14 000 g，4 ℃離心20 min（Microfuge 20R， Beckman， USA），將上清轉(zhuǎn)移到自動取樣瓶（Agilent Technologies， USA）。將175 μL預(yù)冷后的甲醇/氯仿（體積比為3：1）加入殘渣中進(jìn)行二次萃取。14 000 g，4 ℃離心20 min，取100 μL上清轉(zhuǎn)移到自動取樣瓶，剩余上清液匯集在一起，制成質(zhì)量控制樣品。使用真空濃縮器（Labconco， USA）對自動取樣瓶中的所有樣品進(jìn)行短暫蒸發(fā)以去除氯仿，并使用冷凍干燥機（Labconco， USA）進(jìn)一步凍干。干燥的樣品加入50 μL甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液（20 mg/mL）在30 ℃衍生2 h，然后用樣品制備頭在37.5 ℃下加入50 μL MSTFA （1% TMCS）再衍生1 h。

1.9基于GC-TOF/MS的非靶向代謝組學(xué)分析

小鼠盲腸內(nèi)容物的非靶向代謝組學(xué)分析通過氣相色譜聯(lián)合飛行時間質(zhì)譜（GC/TOF-MS）系統(tǒng)（Pegasus HT， Leco， USA）進(jìn)行檢測，測序分析委托麥特繪譜生物科技（上海）有限公司實施。通過Rxi-5ms毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm， Restek， USA）進(jìn)行分離。載氣為氦氣（≥99.999%），恒定流速1.0 mL/min。注入和轉(zhuǎn)移溫度為270 ℃。質(zhì)譜參數(shù)如下：EI 離子源模式，70 eV電離能量，離子源溫度220 ℃，采集速率25 spectra/s，掃描范圍：50～500 Da。使用ChromaTOF v4.71（Leco， USA）軟件處理和識別獲得的原始數(shù)據(jù)?；衔锏蔫b定參考麥特繪譜（上海）構(gòu)建的JiaLib代謝物數(shù)據(jù)庫。運用主成分分析法和正交偏最小二乘判別分析法對各組代謝物譜進(jìn)行分析。代謝物VIP（variable importance in projection）gt;1和Plt;0.05（Student′s t-test）被認(rèn)為存在顯著差異。

2結(jié)果

2.1枳實、厚樸的活性成分及作用靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到枳實活性成分22種，作用靶點124個；厚樸活性成分2種，作用靶點28個。刪除重復(fù)項后得到枳實-厚樸藥對的活性成分共24種（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1），主要活性成分見表1。作用靶點共134個，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表2 。

以“slow transit constipation”作為關(guān)鍵詞在OMIM 數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫中分別檢索到STC疾病相關(guān)靶點604個和3 801個，由于在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中無法以“slow transit constipation”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，遂改用“constipation”作為關(guān)鍵詞，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索到疾病相關(guān)靶點424個。綜合3個數(shù)據(jù)庫結(jié)果，刪除重復(fù)項后，最終得到STC疾病相關(guān)靶點合計4 380個。

2.3藥物-疾病交集靶點及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Venny 2.1在線工具得到枳實-厚樸藥對與STC的藥物-疾病交集靶點共106個， 見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。將獲得的106個交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到蛋白質(zhì)間的相互作用信息，借助Cytoscape 3.8.0軟件重新布局交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2，度值越大則節(jié)點圖標(biāo)越大，顏色越深，相互作用越強則節(jié)點連線越粗。

2.4關(guān)鍵靶點分析

在Cytoscape 3.8.0軟件中對交集靶點度值進(jìn)行分析，度值排名前10的關(guān)鍵靶點包括AKT1、TNF、TP53、IL6、CASP3、JUN、VEGFA、MAPK3、PPARG、EGFR，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3。同時繪制中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4。

2.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對藥物與疾病交集靶點進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO分析發(fā)現(xiàn)枳實-厚樸藥對治療STC的潛在生物過程可能涉及細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、對肽的反應(yīng)、對異種刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、腺體發(fā)育、蛋白磷酸化的正調(diào)控、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、離子傳輸?shù)恼{(diào)節(jié)、對氧氣水平降低的反應(yīng)等，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖5。KEGG分析結(jié)果顯示枳實-厚樸藥對可能參與的通路為癌癥通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號通路、鉑類藥物耐藥性、化學(xué)致癌-受體激活、結(jié)直腸癌、非酒精性脂肪肝、鈣信號通路、5-羥色胺能突觸信號通路、AMPK信號通路，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖6。

2.6非靶向代謝組學(xué)分析

PCA（principal component analysis，主成分分析）和OPLS-DA（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，正交偏最小二乘法判別分析）分析結(jié)果顯示NC組和STC組小鼠盲腸內(nèi)容物中的代謝物聚類性較好，兩組間代謝水平存在明顯差異（圖1（a），1（c）），STC組和ZS+HP組比較同樣顯示兩組間代謝水平存在明顯差異（圖1（b），1（d））。篩選NC組和STC 組兩組間的差異性代謝物（圖 1（e）），根據(jù)VIPgt;1的標(biāo)準(zhǔn)鑒定出79 種差異性代謝物，根據(jù)Plt; 0.05的標(biāo)準(zhǔn)鑒定出43種差異性代謝物，同時滿足上述兩種篩選標(biāo)準(zhǔn)的差異性代謝物共有43 種。相同方法篩選STC組和ZS+HP組兩組間的差異性代謝物共43 種（圖1（f））。對上述兩兩比較得到的組間差異性代謝物進(jìn)行綜合分析，最終發(fā)現(xiàn)相較于NC組，SCT組小鼠盲腸內(nèi)容物中有16種代謝物出現(xiàn)明顯減少，但在給予枳實+厚樸灌胃給藥后上述代謝物顯著增加，包括乙醇胺、N-甲基丙氨酸、煙酸、脯氨酸、尿嘧啶、氫化肉桂酸、核糖、果糖、焦谷氨酸、赤酮酸、谷氨酸、木酮糖、甘露糖、1-單硬脂精、1-單肉豆蔻精和3-羥基苯乙酸。此外，有5種代謝物在SCT組小鼠盲腸內(nèi)容物中較NC組顯著升高，但在枳實+厚樸給藥后出現(xiàn)明顯下降，包括腐胺、纖維二糖、N-乙酰腐胺、原兒茶酸和麥芽糖（表2）。

3討論

通過研究PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，枳實-厚樸藥對治療STC的關(guān)鍵靶點有AKT1、TNF、TP53、IL-6、CASP3、JUN等。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT1信號通路的重要作用節(jié)點，主要參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、代謝等生物學(xué)過程，研究發(fā)現(xiàn)AKT1磷酸化激活對于維持 Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal， ICC）的功能具有重要作用[7]。ICC是一種廣泛分布于胃腸道肌層的間質(zhì)細(xì)胞，是胃腸道平滑肌慢波的發(fā)起者和傳播者，被視為胃腸動力的起搏細(xì)胞[8]。ICC在全結(jié)腸的分布相對均勻，STC患者各段結(jié)腸中ICC的數(shù)量與體積較正常人均明顯減少[9]。TNF和IL-6屬于炎癥性細(xì)胞因子，腸道微生物介導(dǎo)的炎癥性細(xì)胞因子分泌異常可能是導(dǎo)致便秘的原因之一，研究報道慢性便秘患者血清中IL-6和TNF-α的濃度均出現(xiàn)明顯升高[10]。TP53和JUN是癌癥相關(guān)基因，一項針對便秘患者罹患癌癥的風(fēng)險追蹤隨訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，便秘會導(dǎo)致短期內(nèi)患發(fā)癌癥的風(fēng)險升高[11]。CASP3是一種蛋白酶，屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn)STC相關(guān)的反應(yīng)性人腸膠質(zhì)細(xì)胞（reactive human enteric glial cell，rhEGC）表型會引起CASP3的mRNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)，提示CASP3可能通過影響腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞從而對胃腸動力發(fā)揮調(diào)節(jié)效應(yīng)[12]。

本研究KEGG分析結(jié)果顯示枳實-厚樸藥對治療STC的潛在通路包括PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路、5-羥色胺能突觸信號通路等。PI3K-Akt信號通路除了涉及調(diào)控ICC細(xì)胞功能外，還能夠通過調(diào)控下游內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表達(dá)從而參與便秘疾病過程。研究發(fā)現(xiàn)p-Akt的表達(dá)降低，會導(dǎo)致結(jié)腸組織eNOS的表達(dá)升高，使得NO釋放增加，NO是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可以作用于胃腸道平滑肌，抑制其收縮，減少胃腸道蠕動[13-14]。本研究中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析顯示，關(guān)鍵靶點Akt對應(yīng)的活性成分為柚皮素和木犀草素。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有多種藥理學(xué)活性，如抗炎、抗過敏、降尿酸 、抗腫瘤、抗病毒等，多項研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可以通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路發(fā)揮治療作用[15-16]。柚皮素是柚皮甙的甙元，屬于二氫黃酮類化合物，研究同樣發(fā)現(xiàn)柚皮素可以通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、抗血小板凝集等生物學(xué)作用[17-19]。此外，Yin等[20]報道柚皮素能夠通過上調(diào)Cajal間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物干細(xì)胞因子（stem cell factor， SCF）及其受體c-kit的表達(dá)，以及調(diào)控水通道蛋白3（Aquaporin3，AQP3）的表達(dá)從而對洛哌丁胺誘導(dǎo)的STC小鼠發(fā)揮治療作用。

鈣信號通路與胃腸道平滑肌收縮關(guān)聯(lián)緊密，平滑肌的收縮伴隨有鈣信號的改變，表現(xiàn)為收縮時細(xì)胞外液中Ca2+內(nèi)流或細(xì)胞內(nèi)貯存的Ca2+釋放使得平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度升高，而在舒張時游離Ca2+被質(zhì)膜鈣泵或Na+、Ca2+交換排出胞外使得平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度降至靜息水平[21]。李東鑫等[22]研究發(fā)現(xiàn)枳實含藥血清可以提高胃竇平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，增強肌細(xì)胞的收縮。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是腸神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT可以刺激腸道平滑肌收縮，一般認(rèn)為便秘患者通常伴隨5-HT水平降低以及5-HT受體活性的改變[23]。研究表明5-HT3受體表達(dá)下降會影響腸道感覺向大腦中樞的傳遞使得便意減少，另一方面又會使胃腸道蠕動減弱，延緩胃腸道內(nèi)容物的運輸[24]。此外，結(jié)腸5-HT4受體表達(dá)降低同樣會引起腸蠕動減弱，腸道分泌反射異常，導(dǎo)致便秘[25]。

本研究還通過非靶向代謝組學(xué)方法檢測了枳實-厚樸藥對灌胃對STC小鼠腸道代謝物的影響，最終共檢測出21種差異性代謝物，其中值得注意的是枳實-厚樸給藥增加了STC小鼠腸道內(nèi)容物中煙酸和果糖的含量，降低了原兒茶酸的含量，而這3種差異性代謝物均與Akt信號通路存在關(guān)聯(lián)。煙酸是一種多功能物質(zhì)，對機體神經(jīng)系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)以及脂肪代謝等具有調(diào)節(jié)作用[26]。林福全等[27]報道煙酸可以增強人永生化表皮細(xì)胞（HaCaT）中Akt活性。果糖是與葡萄糖同分異構(gòu)的單糖，李穎霞等[28]研究發(fā)現(xiàn)果糖能夠顯著激活A(yù)kt信號通路中的關(guān)鍵分子Akt的磷酸化水平。Sato等[29]同樣報道果糖給藥可以增強小鼠肝臟中Akt的磷酸化。原兒茶酸被證實具有抗氧化和抗炎等作用。Nam等[30]報道原兒茶酸可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的Akt信號通路的激活。Wu等[31]同樣發(fā)現(xiàn)原兒茶酸可以顯著降低成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLSs）中Akt和mTOR的磷酸化水平。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法結(jié)合非靶向代謝組學(xué)檢測，分析枳實-厚樸藥對治療STC的活性成分、關(guān)鍵靶點、相關(guān)通路之間的相互聯(lián)系，探討其潛在作用機制，結(jié)果表明枳實-厚樸藥對針對STC存在多成分、多靶點、多通路的作用特點，其中引起我們特別關(guān)注的是活性成分柚皮素和木犀草素，以及關(guān)鍵靶點Akt及其相關(guān)性代謝物煙酸、果糖和原兒茶酸。本研究結(jié)果為臨床選用枳實-厚樸藥對治療慢傳輸型便秘補充了理論依據(jù)，同時為后續(xù)基礎(chǔ)實驗提供了研究思路。

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