李雪松， 謝方圓， 農(nóng)秋蓮， 張勁松， 王 群， 吳 昊， 阮祥春*

(1.安徽省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，安徽 合肥 230001； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036；3.安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽 合肥 230091)

腎臟對蛋白質(zhì)代謝起著多方面作用，包括低分子量蛋白質(zhì)降解和氨基酸合成。腎功能衰竭患者隨著時間的推移會繼續(xù)失去腎功能，最終進展至終末期腎病。急性腎功能衰竭(ARF)是臨床常見的并發(fā)癥，并且能引起較高的死亡率[1]。ARF產(chǎn)生可由嚴重的創(chuàng)傷、休克、敗血癥等引起，同時與臨床治療方式也有密切的關(guān)系。另外過量接觸有毒性的重金屬(例如鉛、汞或鉻等)也能引起急性腎衰。臨床上常測定血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Cr)作為判斷腎衰的主要指標。氯化汞誘導的腎臟毒性是一種復(fù)雜的現(xiàn)象，其特征是血清Cr和BUN濃度升高，嚴重的近端腎小管壞死，繼而惡化和腎功能衰竭[2]。

正常成人或腎功能衰竭患者口服某些氨基酸增加腎小球濾過率[3]，可緩解腎衰對機體造成的危害。此外，少量必需氨基酸導致氮平衡增加，尿素氮的血清水平降低[4]。 Naylor發(fā)現(xiàn)對急性腎衰的病人使用必需氨基酸，病人的存活率高于未使用氨基酸24%的存活率[5]，得出了必需氨基酸是急性腎衰患者營養(yǎng)需要中重要組分的結(jié)論。這些發(fā)現(xiàn)指出了氨基酸對ARF的重要性，特別是對于正常蛋白質(zhì)合成和避免氨基酸不平衡[6-7]。

本研究目的是利用氯化汞誘導的ARF，使用響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化氨基酸溶液組方。響應(yīng)面法(RSM)是一種有價值的數(shù)學理論和統(tǒng)計技術(shù)，可以通過復(fù)雜的相互作用建立可變參數(shù)優(yōu)化模型。應(yīng)用RSM分析自變量對效應(yīng)的影響，優(yōu)化當前Box-Behnken中的兩個BUN和Cr單獨參數(shù)，通過氯化汞誘導性腎衰竭模型以獲得對小鼠急性腎衰竭具保護作用氨基酸溶液的最佳組方。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗動物 18～22 g昆明種小鼠，雌雄各半，購于安徽醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.1.2 試驗試劑 氯化汞(上海國藥集團試劑有限公司)；亮氨酸(Leu)、蘇氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)和谷氨酰胺(Gln)均購于合肥欣得生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基酸溶液的制備 通過部分因子試驗從12個氨基酸[2, 6-7]中選擇Leu、Thr、Met、Ile、Val、Arg、His和Gln 8個氨基酸。然后，依據(jù)部分因子試驗結(jié)果，選擇Leu、Thr和Met通過RSM的優(yōu)化。其中A為Leu(低水平：10.00 g，高水平：20.00 g)，B為Thr(低水平：1.00 g，高水平：9.00 g)和C為Met(低水平：1.00 g， 高水平：10.00 g)。對三因素2水平利用Design Expert 8.06軟件中的Box-Behnken設(shè)計15個氨基酸組方的試驗組，在中心點設(shè)置有3個重復(fù)(表1)。氨基酸溶液組成中除了含有Leu、Thr和Met外，同時還含有部分因子試驗得出的Ile、Val、Arg、His和Gln組分，均以相同比例與Leu、Thr和Met混合。按照15個組方的氨基酸比例，稱取一定質(zhì)量的氨基酸，加入適量水，用高速組織勻漿機20 000 rpm進行處理，制備不同組方的氨基酸溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗動物的分組及給藥 將體重為18～22 g的昆明種小鼠136只，雌雄各半，分成17個組，每組8只。小鼠在室溫為25±2 ℃環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，喂飼清潔飼料，自由飲水。試驗分為陰性對照組，陽性對照組，氨基酸1～15組。除對照組外，根據(jù)預(yù)試驗劑量，配制1 mg/mL 氯化汞按照5 mg/kg對小鼠進行腹腔注射；陰性對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。在注射之前，老鼠需要禁食12 h。在氯化汞腹腔注射24 h后，氨基酸組口服0.2 mL的按照1～15組制備的氨基酸溶液，陰性、陽性對照組口服同等體積的生理鹽水。

1.2.3 樣品采集 口服氨基酸試驗持續(xù)5 d，在最后一次口服氨基酸12 h后，將小鼠用乙醚麻醉，斷頭取血。將采集的血液，3 500 rpm離心10 min，吸取血清，冷凍保存，待測。

1.3 測定項目及分析方法

血清樣品的BUN和Cr由安徽農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)院進行檢測。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 18.0軟件。數(shù)據(jù)參數(shù)的分析采用單因素方差分析，然后利用最小顯著性差異法比較結(jié)果，P<0.05被認為是統(tǒng)計上的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Box-Behnken設(shè)計與血清中BUN和Cr結(jié)果

陰性對照組的小鼠血清中的BUN和Cr分別為5.57±0.51 μmol/L和37.38±4.47 mmol/L；陽性對照組的小鼠血清中的BUN和Cr分別為58.61±4.45 μmol/L和60.25±2.75 mmol/L。按照3因素Box-Behnken設(shè)計的15個氨基酸組方，分析對氯化汞誘導的急性腎衰模型中的BUN和Cr有不同程度的影響。具體氨基酸組方及相應(yīng)的血清生化結(jié)果(表1)。

表1 Box-Behnken 設(shè)計和相應(yīng)響應(yīng)值

*注：運行的順序在試驗期間是隨機的，以降低誤差。

*Note：The order of the runs was randomized during experiment to minimize selection error.

2.2 響應(yīng)面模型的分析

依據(jù)Box-Behnken設(shè)計中的血清BUN和Cr結(jié)果，對響應(yīng)面的模型進行分析。在模型的方差分析中，3種氨基酸對BUN的P<0.01,對Cr的P<0.05,說明3種氨基酸的響應(yīng)面篩選的方法是有效的。在BUN和Cr模型中的失擬項的參數(shù)F的值分別為0.22和0.41，均不顯著(P>0.05)，說明該試驗獲得的數(shù)據(jù)是有效的，數(shù)據(jù)差異在有效范圍內(nèi)。試驗結(jié)果表明亮氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸對小鼠血清中的BUN和Cr均有一定的影響。其中因素B、C、AC、A2、B2和C2對小鼠血清中的BUN產(chǎn)生極顯著的影響(P<0.01)(表2)。因素A2和C2對小鼠血清中的Cr有著極顯著的影響(P<0.01)，而因素AC、BC和B2對小鼠血清中的Cr有著顯著的影響(P<0.05)(表3)。

表2 響應(yīng)面二次模型的方差分析 (BUN)

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析(Cr)

2.3 氨基酸組方優(yōu)化

RSM成功地優(yōu)化了與血清BUN和Cr水平相關(guān)的氨基酸組成。為了提供更好的可視化，三維圖和等高線圖顯示了ARF小鼠血清BUN和Cr水平與Leu、Thr和Met的相互關(guān)系(圖1)。響應(yīng)面優(yōu)化的最佳氨基酸組合物是：Leu 19.94 g、Thr 1.03 g和Met 6.53 g。 在此條件下，預(yù)測急性腎功能衰竭血清的BUN和Cr分別為5.93 μmol/L和34.00 mmol/L(表4)。

圖1 不同因素變量對響應(yīng)變量(3D響應(yīng)面)相互作用的影響

圖2 不同因素變量對響應(yīng)變量(等高線圖)相互作用影響

效應(yīng)Response預(yù)測Prediction標準差Std Dev標準誤SE95%置信區(qū)間95% Confidence95%低區(qū)間95%高區(qū)間BUN5.928 335.213 326.884 71-11.769 423.626Cr34.0019.386 5212.395 82.136 5265.865 5

3 結(jié)論與討論

最近，RSM被普遍應(yīng)用與各種領(lǐng)域，如納米技術(shù)，化學和醫(yī)學[8-12]。 RSM可用于通過復(fù)雜的相互作用建立優(yōu)化模型[13-15]。事實上，血清中Cr和BUN的濃度主要是評估臨床中腎臟疾病的指標。RSM闡明了不同的氨基酸及其相互作用對血清中BUN和Cr濃度的影響，利用RSM優(yōu)化了氨基酸組成對氯化汞誘導急性腎衰模型小鼠具有一定的作用。許多實驗?zāi)Ｐ捅砻?，氨基酸可改善進行性腎損害[16]。在本研究中，氨基酸溶液給小鼠口服后降低氯化汞模型中小鼠的血清Cr和BUN水平。 氨基酸對Cr和BUN濃度的作用可歸因于改善腎小球的濾過率。ARF引起的死亡率可以高達50%，在這項研究中，氨基酸組的小鼠未見死亡，而陽性對照組死亡率則為25%?？诜被崛芤耗芙档托∈髮β然鸬募毙阅I衰的死亡率。在5 mg/kg的劑量下腹腔注射氯化汞，小鼠血清中的BUN和Cr分別為58.61±4.45 μmol/L和60.25±2.75 mmol/L。與對照組的的BUN和Cr分別為5.57±0.51 μmol/L和37.38±4.47 mmol/L相比，可以成功對小鼠進行急性腎衰的病理造模。亮氨酸,蘇氨酸,甲硫氨酸均對血清的肌酐和尿素氮具有不同程度的影響，利用響應(yīng)面法獲得的最佳組方為亮氨酸19.94 g，蘇氨酸1.03 g，甲硫氨酸6.53 g。

本試驗通過氯化汞對小鼠誘導急性腎衰模型，以小鼠血清中的BUN和Cr為主要考察指標，通過響應(yīng)面法優(yōu)化氨基酸的最佳組方。從目前的血清生化指標來看，氨基酸組合物能降低氯化汞誘導急性腎衰小鼠的血清中的BUN和Cr，至于優(yōu)化后的氨基酸組方對氯化汞誘導的急性腎衰保護作用的大小，需要通過組織病理學來進行進一步的研究。