李品青，徐春陽，薛晨祺，丁凱，姚煜，邱潔

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌最常見類型，2020年我國肝癌新發(fā)和死亡病例分別為41.0萬例、39.1萬例，占全球肝癌新發(fā)和死亡病例的45.3%、47.1%[1-2]。近年來早期HCC的檢出率雖有所提升，但大多數(shù)患者預(yù)后仍然較差[3]，亟需進(jìn)一步了解HCC發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動因素。研究表明，非編碼RNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[4-5]。SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2重疊轉(zhuǎn)錄本(SRY-box transcription factor 2 overlapping transcript，SOX2OT)是新近發(fā)現(xiàn)的一種長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，研究報道lncRNA-SOX2OT參與鼻咽癌、胰腺癌等惡性腫瘤進(jìn)展[6-7]。微小RNA-122-5p(microRNA-122-5p，miR-122-5p)是miRNA家族的一種高度保守成員，研究報道m(xù)iR-122-5p參與卵巢癌、食管癌等惡性腫瘤進(jìn)展[8-9]。目前關(guān)于HCC組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達(dá)與病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系報道較少，基于此進(jìn)行研究，以期為評估HCC患者進(jìn)展和預(yù)后提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年9月—2018年12月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第二醫(yī)院腫瘤和血管疾病介入一科收治HCC患者112例，男68例，女44例，年齡36～82(60.68±6.54)歲；腫瘤直徑：≥3 cm 64例、<3 cm 48例；Child-Pugh分級：A級38例，B級42例，C級32例；乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)：陽性68例，陰性44例；AFP：≥400 μg/L 30例、<400 μg/L 82例；分化程度：低分化22例,中高分化90例；巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC)分期：極早期29例,早期27例,中期18例,晚期38例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2017-02-45)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理確診為HCC，符合“原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版)”[10]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診，入院前未接受抗腫瘤治療；③接受姑息性或根治性手術(shù)；④病理參數(shù)和隨訪資料完整；⑤年齡≥18歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤；②全身感染性疾?。虎奂韧尾渴中g(shù)史；④合并嚴(yán)重心、腎功能損害。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達(dá)：收集術(shù)中切除部分癌組織和距離>5 cm的癌旁組織，液氮冷凍中研磨成末，Trizol試劑盒(上海冠泰生物科技有限公司)提取組織總RNA，Nano-300微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)驗證純度、濃度合格，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa Bio公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體積10 μl：5×PrimeScript RT Master Mix 2.0 μl、RNA 2.0 μl、RNase Free H2O 6.0 μl；反應(yīng)條件：37℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃反應(yīng)至結(jié)束后保存于-20℃冰箱中。以cDNA為模板按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa Bio公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列由上海新貝生物科技有限公司設(shè)計和合成：lncRNA-SOX2OT 上游 5′-GTTCATGGCCTGGACTCTCC-3′、下游5′-ATTGCTAGCCCTCACACCTC-3′，內(nèi)參GAPDH 上游5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′、下游5′-CCAAATTCGTTGTCATACCAGGAAATG-3′；miR-122-5p上游5′-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3′、下游5′-GCAAATATGAAGGAATCATGG-3′，內(nèi)參U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)體積20 μl：SYBR?Premix Ex Taq 10 μl、正反向引物各0.8 μl、cDNA模板2.0 μl、ROX Reference Dye (50×)0.4 μl、RNase Free H2O 6.0 μl；反應(yīng)條件：95℃ 90 s、95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s，循環(huán)40次后收集Ct值，2-ΔΔCt法計算組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達(dá)。

1.3.2 隨訪：患者出院后通過門診或電話方式隨訪3年，隨訪截至2022年1月，根據(jù)HCC組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達(dá)的均值分為lncRNA-SOX2OT高表達(dá)組(≥3.53，n=59)、低表達(dá)組(<3.53，n=53)，miR-122-5p高表達(dá)組(≥1.71，n=62)、低表達(dá)組(<1.71，n=50)，統(tǒng)計不同組別HCC患者總生存率。

2 結(jié) 果

2.1 HCC組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達(dá)比較 HCC組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT表達(dá)量為(3.53±0.82)，高于癌旁組織的(1.72±0.36)(t=21.258，P<0.001)；miR-122-5p表達(dá)量為(1.71±0.50)，低于癌旁組織的(2.98±0.43)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=20.475，P<0.001)。

2.2 HCC組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT與miR-122-5p表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，HCC組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT與miR-122-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.771，P<0.001)。

2.3 HCC組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達(dá)在不同臨床/病理參數(shù)中比較 HCC組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT表達(dá)在Child-Pugh分級B～C級、BCLC分期晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中高于Child-Pugh分級A級、BCLC分期極早期～中期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，而miR-122-5p表達(dá)低于Child-Pugh分級A級、BCLC分期極早期～中期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P均<0.05)，見表1。

表1 HCC組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達(dá)在不同臨床/病理參數(shù)中比較

2.4 HCC組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 隨訪3年，112例HCC患者死亡36例，總生存率為67.86%(76/112)，無病例失訪。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，lncRNA-SOX2OT高表達(dá)組總生存率54.24%(32/59)，低于lncRNA-SOX2OT低表達(dá)組的83.02%(44/53)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.176，P<0.001)；miR-122-5p高表達(dá)組總生存率80.65%(50/62)高于miR-122-5p低表達(dá)組的52.00%(26/50)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.744，P<0.001)。見圖1、2。

圖1 不同lncRNA-SOX2OT表達(dá)HCC患者Kaplan-Meier生存曲線

圖2 不同miR-122-5p表達(dá)HCC患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

HCC是起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，我國超過80%的HCC患者合并有HBV感染，由于HCC起病隱匿，39.0%～53.6%的HCC患者初診處于晚期，中位生存期僅3.0～5.7個月，1年生存率僅12.0%～38.3%[11]。盡管近年來免疫檢查點(diǎn)抑制劑為中晚期HCC提供了新的方向，但目前基于免疫檢查點(diǎn)抑制劑的HCC免疫聯(lián)合多學(xué)科治療對晚期HCC的療效仍然較差[12]。還需進(jìn)一步研究HCC的分子機(jī)制，對判斷HCC進(jìn)展、評估預(yù)后、延長生存期具有重要意義。

HCC是多因素和多步驟的復(fù)雜過程，表觀遺傳學(xué)涉及的非編碼RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13-15]。lncRNA是一類新興的表觀遺傳學(xué)調(diào)控分子，能通過競爭性占有胞內(nèi)miRNA海綿樣干涉miRNA活性，間接調(diào)控靶mRNA表達(dá)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[5]。lncRNA-SOX2OT位于人3號染色體26.33，由10個外顯子和2個以上的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)組成，這些位點(diǎn)表現(xiàn)出復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄特征，與癌癥和干細(xì)胞相關(guān)途徑密切相關(guān)[16-17]?；趌ncRNA-SOX2OT與癌癥和干細(xì)胞的復(fù)雜關(guān)系，多項研究也指出lncRNA-SOX2OT與惡性腫瘤的關(guān)系，如lncRNA-SOX2OT能海綿miR-194-5p降低SRY盒轉(zhuǎn)錄因子5抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[18-19]，lncRNA-SOX2OT能海綿miR-942-5p上調(diào)纖溶酶原激活物抑制劑-1促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[20]。這些研究提示lncRNA-SOX2OT在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用。本研究結(jié)果顯示，HCC中l(wèi)ncRNA-SOX2OT表達(dá)上調(diào)，提示lncRNA-SOX2OT可能在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，其表達(dá)上調(diào)可能與lncRNA-SOX2OT被癌基因激活有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，HCC中l(wèi)ncRNA-SOX2OT表達(dá)上調(diào)與Child-Pugh分級、BCLC分期增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示lncRNA-SOX2OT在HCC中發(fā)揮促癌基因作用，其高表達(dá)能促進(jìn)HCC進(jìn)展，其機(jī)制可能與lncRNA-SOX2OT能促進(jìn)HCC上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化能賦予HCC細(xì)胞更強(qiáng)的運(yùn)動性和侵襲性，促進(jìn)HCC細(xì)胞從原發(fā)部位逃逸，進(jìn)而促進(jìn)HCC侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。Sun等[22]通過細(xì)胞侵襲試驗證實，小干擾RNA敲低lncRNA-SOX2OT能抑制HCC上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制HCC侵襲。

miRNA也是一類新興的表觀遺傳學(xué)調(diào)控分子，能通過降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控mRNA表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展[6]。miR-122-5p位于人18號染色體26.31，是一個與肝損傷密切相關(guān)的miRNA，在非酒精性脂肪性肝病中，miR-122-5p能靶向叉頭框O3抑制非酒精性脂肪性肝病炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷[23]。在HBV相關(guān)肝纖維化中，miR-122-5p能靶向白介素-17受體抑制HBV相關(guān)肝纖維化進(jìn)展[24]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p也參與惡性腫瘤進(jìn)展，如miR-122-5p能靶向原癌基因c-Fos抑制胃癌血管生成[25]。另有研究指出，miR-122-5p DNA甲基化與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移有關(guān)[26]。本研究結(jié)果顯示，HCC中miR-122-5p表達(dá)下調(diào)，提示miR-122-5p可能在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，其表達(dá)下調(diào)可能與miR-122-5p DNA甲基化有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，HCC中miR-122-5p表達(dá)下調(diào)與Child-Pugh分級、BCLC分期增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-122-5p在HCC中發(fā)揮抑癌基因作用，miR-122-5p低表達(dá)能促進(jìn)HCC進(jìn)展，其機(jī)制可能與miR-122-5p抑制叉頭框K2(forkhead box K2，F(xiàn)OXK2)有關(guān)。FOXK2是一種翼—螺旋DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子，能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡程序促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展[27]。Zhao等[28]研究證實，miR-122-5p能靶向下調(diào)FOXK2抑制HCC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。本研究通過繪制不同lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p表達(dá)HCC患者生存曲線發(fā)現(xiàn)，lncRNA-SOX2OT高表達(dá)HCC患者總生存率低于lncRNA-SOX2OT低表達(dá)患者，miR-122-5p高表達(dá)HCC患者總生存率高于miR-122-5p低表達(dá)患者，說明lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p可能成為HCC患者預(yù)后評估指標(biāo)。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HCC中l(wèi)ncRNA-SOX2OT與miR-122-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能共同參與HCC發(fā)生發(fā)展。近期Liang等[29]通過雙熒光素酶實驗也證實，上調(diào)lncRNA-SOX2OT能靶向下調(diào)miR-122-5p表達(dá)，促進(jìn)HCC侵襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步佐證了本研究結(jié)果。

綜上所述，HCC組織中l(wèi)ncRNA-SOX2OT表達(dá)上調(diào)和miR-122-5p表達(dá)下調(diào)，二者可能共同參與HCC進(jìn)展，與Child-Pugh分級、BCLC分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。但本研究樣本量較少，隨訪時間較短，關(guān)于lncRNA-SOX2OT、miR-122-5p參與HCC的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李品青：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;徐春陽：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;薛晨祺：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;丁凱：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;姚煜：課題設(shè)計，論文撰寫；邱潔：論文審核