范華，易亭伍，馬聞，楊茜，田靜

食管癌是全球常見的惡性腫瘤，全世界每年新發(fā)約50萬例，占所有腫瘤相關(guān)死亡的5.3%[1]。其以鱗癌為主，占病理類型90%以上。目前治療包括手術(shù)、放療及聯(lián)合治療等，但由于腫瘤異質(zhì)性，部分患者治療后仍可出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致不良預(yù)后[2]。微小RNA-452-5p(microRNA-452-5p，miR-452-5p)基因位于Xq28，是一種長度為20～24個核苷酸的微小RNA。近年來發(fā)現(xiàn)，miR-452-5p在結(jié)直腸癌、肝細胞癌等惡性腫瘤中異常表達[3-4]，其通過促進絲裂原活化蛋白激酶途徑，促進腫瘤的惡性增殖。SRY盒相關(guān)基因7 (SRY-box containing，SOX7)編碼蛋白屬于SRY相關(guān)HMG盒轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與胚胎發(fā)育及細胞死亡的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，SOX7能夠通過調(diào)節(jié)Wnt/β連環(huán)蛋白途徑，影響肝癌、口腔鱗癌等惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及血管擬態(tài)等生物學(xué)行為[5-6]，在腫瘤惡性進展中發(fā)揮重要功能?，F(xiàn)分析食管癌miR-452-5p、SOX7 mRNA表達及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年1月四川省樂山市人民醫(yī)院腫瘤血液科診治的食管癌患者103例為研究對象，男65例，女38例，年齡34～78(56.1±6.3)歲；腫瘤分化程度：高中分化58例，低分化45例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期69例，Ⅲ期34例；腫瘤位置：上胸段19例，中胸段55例，下胸段29例；腫瘤直徑：≤5 cm 47例，>5 cm 56例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，均無明顯誘因及家族遺傳史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準通過(2018-025)，患者及家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①經(jīng)活檢或術(shù)后組織病理學(xué)檢查明確診斷為食管鱗癌；②首次診治；③患者能夠配合相關(guān)診治及隨訪。(2)排除標準：①合并其他器官惡性腫瘤；②合并嚴重肝、腎等臟器功能障礙；③合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 miR-452-5p與SOX7 mRNA的表達檢測：應(yīng)用熒光定量PCR檢測組織中miR-452-5p與SOX7 mRNA的表達。術(shù)中獲取癌灶及癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)，應(yīng)用Trizol法提取組織中總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，試劑盒購自日本TAKARA公司。反轉(zhuǎn)錄條件為42℃ 120 min，90℃ 5 min。然后進行熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列由上海生工公司設(shè)計合成。miR-452-5p引物序列：上游5’-GCCGAGAACTGTTTGCAGA-3’，下游 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAG-3’；內(nèi)參U6上游5’-AGTAAGCCCTTGCTGTCAGTG-3’，下游5’-CCTGGGTCTGATAATGCTGGG-3’；SOX7上游5’-AGCCGGAGCAGACCTTCTT-3’，下游5’-GCCGGGGAGTAATAGGCAG-3’；內(nèi)參GAPDH上游5’-TCGACGCCCTGGATCAACT-3’，下游5’-CTGGGAGACCGGAACATGC-3’。 miR-452-5p反應(yīng)條件為：95℃ 30 s、95℃ 5 s、62℃ 30 s、70℃ 30 s，共35個循環(huán); SOX7 mRNA反應(yīng)條件為：94℃ 5 min、94℃ 30 s、62℃ 30 s、70℃ 30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)體系：SYBR Green premix 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 模板1 μl和ddH2O 7 μl(miR-452-5p)；SYBR Green premix 10 μl ，上下游引物各1.2 μl ，cDNA 模板2 μl 和ddH2O 5.6 μl(SOX7 mRNA)。miR-452-5p表達以U6為內(nèi)參，SOX7 mRNA以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法表示miR-452-5p、SOX7 mRNA的相對表達量。分別以miR-452-5p、SOX7 mRNA相對表達量的平均值3.04、1.27作為閾值, 分為miR-452-5p高表達組53例和低表達組50例；SOX7 mRNA高表達組52例和低表達組51例。

1.3.2 隨訪情況：患者自出院起開始隨訪，以門診復(fù)查或電話方式回訪，每3個月隨訪1次，連續(xù)隨訪3年，統(tǒng)計患者生存情況。隨訪截止至2022年2月1日，隨訪終點為患者死亡或隨訪時間結(jié)束。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織與癌旁組織miR-452-5p、SOX7 mRNA表達比較 癌組織中miR-452-5p的表達明顯高于癌旁組織，SOX7 mRNA的表達明顯低于癌旁組織，見表1。

表1 癌組織與癌旁組織miR-452-5p、SOX7 mRNA表達比較

2.2 食管癌組織miR-452-5p與SOX7 mRNA表達的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-452-5p與SOX7 mRNA表達呈顯著負相關(guān)(r=-0.504，P<0.001)。

2.3 miR-452-5p與SOX7 mRNA表達在不同食管癌臨床/病理特征中比較 腫瘤分期Ⅲ期、低分化、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中miR-452-5p表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、高中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，而SOX7 mRNA表達低于腫瘤Ⅰ～Ⅱ期、高中分化及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P均<0.01)；不同性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置間miR-452-5p、SOX7 mRNA表達比較，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表2。

表2 103例食道癌患者miR-452-5p、SOX7 mRNA表達在不同臨床/病理特征中比較

2.4 miR-452-5p、SOX7 mRNA表達與食管癌臨床預(yù)后的關(guān)系 103例食管癌患者隨訪5～36個月，中位隨訪時間28個月，隨訪期間死亡60例，無失訪。miR-452-5p高表達組患者中位生存時間明顯低于低表達組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(26.15 vs. 31.22個月,χ2=3.967,P=0.046)。miR-452-5p高表達組患者3年總體生存率為24.53% (13/53)，明顯低于低表達組患者的60.00% (30/50)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.093，P=0.024)，見圖1。

圖1 不同miR-452-5p表達食管癌患者Kaplan-Meier生存曲線

SOX7 mRNA低表達組患者中位生存時間明顯低于高表達組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(27.47 vs. 32.40個月,χ2=3.941,P=0.047)。SOX7 mRNA低表達組患者術(shù)后3年總體生存率為23.53% (12/51)，明顯低于高表達組患者的59.62% (31/52)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.285,P=0.022)，見圖2。

圖2 不同SOX7 mRNA表達食管癌患者Kaplan-Meier生存曲線

2.5 食管癌臨床預(yù)后的影響因素分析 以食管癌患者的生存預(yù)后為因變量(1=死亡，0=存活，t=生存時間)，納入年齡(1=≥60歲，0=<60歲)、性別(1=男，0=女)、腫瘤大小(1=>5 cm，0=≤5 cm)、腫瘤位置(1=上胸段，0=中下胸段)、腫瘤分期(1=Ⅲ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、分化程度(1=低分化，0=高中分化)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(1=有，0=無)、miR-452-5p(1=高表達，0=低表達)、SOX7 mRNA(1=高表達，0=低表達)為自變量納入單因素COX比例風(fēng)險回歸模型，結(jié)果顯示腫瘤TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-452-5p、SOX7 mRNA是影響食管癌預(yù)后的因素。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期Ⅲ期、分化程度低、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-452-5p高表達及SOX7 mRNA低表達是影響食管癌預(yù)后的獨立危險因素，見表3、4。

表3 食管癌臨床預(yù)后的單因素COX比例風(fēng)險回歸模型分析

表4 食管癌臨床預(yù)后的多因素COX比例風(fēng)險回歸模型分析

3 討 論

我國食管癌每年發(fā)病例數(shù)達24.6萬，死亡達18.8萬例，占全世界發(fā)病和死亡人數(shù)的50%以上，嚴重威脅我國人民健康[7]。目前食管癌的臨床治療是以外科治療為主的綜合治療，但對于中晚期患者，喪失最佳手術(shù)治療時機，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，遠期生存預(yù)后較差[8]。因此，深入研究食管癌的病因和發(fā)病機制，尋找預(yù)后相關(guān)分子標志物，有助于食管癌的臨床診治及預(yù)后判斷。

miR-452-5p屬于非編碼RNA，參與構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，通過不完全堿基配對來識別靶基因mRNA，導(dǎo)致靶基因mRNA的穩(wěn)定性降低及翻譯抑制[9]。近年來發(fā)現(xiàn)，miR-452-5p在前列腺癌[10]、結(jié)直腸癌[11]等腫瘤中表達上調(diào)或下調(diào)，其通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路，促進腫瘤的惡性進展。本研究中，食管癌組織中miR-452-5p表達上調(diào)，提示miR-452-5p可能參與食管癌的發(fā)生過程。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA CCDC66能夠作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-452-5p的表達，環(huán)狀RNA CCDC66的表達下調(diào)促進miR-452-5p的表達，進而導(dǎo)致腫瘤進展[11-13]。本研究中，miR-452-5p表達與腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-452-5p的表達升高參與促進食管癌惡性進展。研究報道，miR-452-5p表達上調(diào)通過磷酸化Rho相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，激活細胞外調(diào)節(jié)MAP激酶/絲裂原活化蛋白激酶信號通路，促進腫瘤細胞周期的進行，導(dǎo)致腫瘤的過度增殖[3]。此外，尚有研究發(fā)現(xiàn)，miR-452-5p的表達能夠激活轉(zhuǎn)化生長因子β通路，促進肌動蛋白細胞骨架組裝進而促進腫瘤細胞的侵襲、遷移和黏附能力，導(dǎo)致腫瘤的局部侵犯和遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生[10]。因此，食管癌中miR-452-5p可能作為一種促癌因子，促進食管癌的腫瘤進展。本研究中，miR-452-5p高表達患者生存預(yù)后較差，其原因可能與miR-452-5p能夠促進腫瘤細胞耐藥性的形成有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-452-5p表達升高能夠過度激活SMAD家族蛋白4/7，增強腫瘤細胞對酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼的治療抵抗，降低患者對治療的反應(yīng)性，導(dǎo)致患者不良預(yù)后[14-16]。

SOX7結(jié)構(gòu)上包含DNA結(jié)合的高遷移率基團結(jié)構(gòu)域，其在胚胎干細胞分化、血管形成及個體發(fā)育過程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[17]。近年來發(fā)現(xiàn)，SOX7在宮頸癌、腎癌等惡性腫瘤中表達明顯下調(diào)[18-19]，其作為一種腫瘤抑制基因，能夠負調(diào)控Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)，抑制癌細胞中的細胞增殖。本研究中，食管癌組織中SOX7表達降低，可能與miRNA的表達調(diào)控有關(guān)。有研究報道，miR-492能夠結(jié)合SOX7 mRNA的3'端非編碼區(qū)，降低SOX7 mRNA的穩(wěn)定性，抑制SOX7的蛋白表達，進而促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細胞的遷移和侵襲[20-21]。本研究中，癌組織中SOX7 mRNA的表達與腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明SOX7 mRNA表達降低促進食管癌的腫瘤發(fā)展。其機制可能與SOX7對下游多種靶基因的表達調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，SOX7能夠與β-連環(huán)蛋白相互作用，促進β-連環(huán)蛋白的降解，抑制β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄共激活因子BCL9的表達，而SOX7的表達下調(diào)激活β-連環(huán)蛋白/BCL-9通路，導(dǎo)致腫瘤細胞的過度增殖及轉(zhuǎn)移[22]。此外，尚有研究發(fā)現(xiàn)，SOX7能夠轉(zhuǎn)錄激活層粘連蛋白α1的表達，增強細胞之間的黏附性，而腫瘤中SOX7的表達降低導(dǎo)致腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強，促進腫瘤的惡性進展[23]。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，食管癌中SOX7 mRNA低表達患者預(yù)后較差，并且是患者不良預(yù)后的獨立危險因素。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SOX7的表達下調(diào)能夠促進B細胞淋巴瘤-2和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶磷酸化，增強腫瘤細胞對紫杉醇類化療藥物抵抗性，導(dǎo)致患者不良預(yù)后[24]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中miR-452-5p與SOX7 mRNA表達呈顯著負相關(guān)，提示兩者可能存在相互調(diào)控的關(guān)系。實驗研究表明，食管癌細胞KYSE-150中miR-452-5p表達顯著上調(diào)，其通過結(jié)合SOX7 mRNA 3’非編碼區(qū)，降低SOX7 mRNA穩(wěn)定性，抑制SOX7 mRNA的表達，并激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換[25]。因此，食管癌中miR-452-5p可能通過抑制SOX7 mRNA的表達，發(fā)揮促進腫瘤惡性進展的功能。

綜上所述，食管癌組織中miR-452-5p表達升高，SOX7 mRNA表達降低，二者與腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是新的食管癌預(yù)后相關(guān)腫瘤標志物。但本研究樣本量有限，有待今后擴大樣本含量，并設(shè)計前瞻性臨床試驗進一步研究miR-452-5p、SOX7 mRNA表達在食管癌中的臨床應(yīng)用價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

范華：研究構(gòu)思、數(shù)據(jù)獲取、論文撰寫、統(tǒng)計分析、論文修改；易亭伍：選擇課題、論文修改；馬聞、楊茜:數(shù)據(jù)獲??；田靜：數(shù)據(jù)獲取、統(tǒng)計分析、論文終審