李共國(guó)，何禮濤，孫志棟

（1 浙江萬(wàn)里學(xué)院 浙江寧波315100 2 寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 浙江寧波 315040）

芥菜（Brassica juncea）又名苦菜、辣菜、春菜，是十字花科蕓薹屬芥菜品種[1]。它生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高，是我國(guó)南方地區(qū)普遍栽培的腌制加工用蔬菜。它的類型和品種很多，有大葉芥菜、花葉芥菜、瘤柄芥菜、包心芥菜和分蘗芥菜（雪里蕻）等多種芥菜類型。芥菜含有許多天然的植物化學(xué)物質(zhì)[2]，可以預(yù)防并抑制多種疾病，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為芥菜具有一定的食補(bǔ)功效，具有溫胃散熱以及治療腹脹氣滯、預(yù)防便秘的作用[3]。葉用芥菜因有辛辣味，作為新鮮蔬菜的消耗量很小，通常以腌制加工的方式得以保藏。目前，腌制菜大多經(jīng)脫鹽與壓榨、調(diào)味與裝袋、封口與殺菌等熱加工工序后流通[4]，加熱殺菌會(huì)不同程度地破壞食品的質(zhì)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)成分，改變其顏色和口味，導(dǎo)致其品質(zhì)的劣變[5]。腌制菜非熱加工產(chǎn)品的鮮度更好、口感更脆，然而，其在貯藏過(guò)程中存在易氧化褐變、細(xì)菌數(shù)量大的問(wèn)題，從而影響產(chǎn)品的貨架期。一般在腌制蔬菜中添加山梨酸鉀、焦亞硫酸鈉等食品添加劑或其它食品抑菌劑可抑制微生物生長(zhǎng)繁殖。臭氧是一種強(qiáng)氧化性氣體，分解后沒(méi)有殘留，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的殺滅作用比氯氣更強(qiáng)，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）列入安全綠色保鮮氣體，并對(duì)多種果蔬有較好的保鮮作用[6]。本文嘗試通過(guò)正交試驗(yàn)的方法，考察臭氧殺菌，添加防腐劑、抗褐變劑和酸味調(diào)節(jié)劑等非熱加工因素對(duì)腌制芥菜貯藏品質(zhì)的影響，特別關(guān)注非熱因素影響腌制芥菜細(xì)菌總數(shù)和亞硝酸鹽含量的變化路徑，開(kāi)發(fā)一種腌制芥菜的非熱加工技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

1.1.1.1 材料 包心芥（酸菜）菜坯，取于寧波某腌制蔬菜廠的周轉(zhuǎn)池。

1.1.1.2 試劑 焦亞硫酸鈉，湖南岳陽(yáng)三湘化工有限公司（食品級(jí)）；檸檬酸，濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司（食品級(jí)）；山梨酸鉀，寧波王龍科技股份有限公司（食品級(jí)）；氯化鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、鄰苯二甲酸氫鉀、鹽酸、酚酞均為分析純級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 SW-CJ-2D 雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LD2F-50L-Ⅱ立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；H1850R離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ST-756P 紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；PHS-3CpH計(jì)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；YP30002 電子天平，上海佑科儀器有限公司；臭氧生成器（水中臭氧氣體質(zhì)量濃度可達(dá)0.8 mg/L），臺(tái)州市龍昌農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 腌制芥菜加工流程見(jiàn)圖1。

圖1 加工工藝流程圖Fig.1 Processing technology flow chart

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)對(duì)生產(chǎn)酸菜工廠的實(shí)地考察，酸菜坯經(jīng)過(guò)清洗、漂淡工藝流程，最后進(jìn)入O3水殺菌池。根據(jù)工廠生產(chǎn)所用的O3殺菌條件，設(shè)置本試驗(yàn)的O3水殺菌條件，即0.8 mg/L O3水殺菌時(shí)間設(shè)置為3，5 min 和7 min。保鮮劑包括防腐劑山梨酸鉀、防褐變劑焦亞硫酸鈉和酸味調(diào)節(jié)劑檸檬酸。根據(jù)胡秀虹等[7]的研究結(jié)果，當(dāng)山梨酸鉀的質(zhì)量濃度到達(dá)0.3 mg/mL 時(shí)，對(duì)腐敗菌的抑制率可達(dá)89%；吳金松等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，腌制液中添加0.3 mg/mL 的焦亞硫酸鈉可以有效延長(zhǎng)鮮紅辣椒的貨架期，并且SO2的殘留量符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；方子鋮等[9]用2.0 mg/mL 的檸檬酸處理竹筍取得較好的護(hù)色效果。表1 為四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表。

表1 因素水平表L9（34）Table 1 Factors and levels table of L9（34）

1.2.3 樣品處理及指標(biāo)測(cè)定 取正交試驗(yàn)各組和對(duì)照組芥菜各1 包，各試驗(yàn)組先留出一小部分用于測(cè)定芥菜的色澤變化，其余樣品用食品勻漿機(jī)將其打碎，備用。細(xì)菌總數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法[10]，將試樣經(jīng)過(guò)梯度稀釋后在PCA 平板上（37±1）℃培養(yǎng)48 h，肉眼觀察記錄相應(yīng)的菌落數(shù)量。酸度（總酸含量）采用酸堿滴定法測(cè)定，根據(jù)酸堿中和的原理，用堿液滴定以酚酞為指示劑，根據(jù)堿液的消耗量計(jì)算食品中的總酸含量[11]。氨基態(tài)氮含量采用甲醛法測(cè)定，加入甲醛固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定后定量，以pH 計(jì)測(cè)定終點(diǎn)[12]。亞硝酸鹽含量采用鹽酸奈乙二胺法測(cè)定[13]。芥菜的色澤采用色差儀測(cè)定，得到的色澤參數(shù)為L(zhǎng) 值、a 值和b 值，其中L 代表亮度軸，0 表示黑色，100 表示白色；a 代表紅綠軸，正值表示紅，負(fù)值表示綠；b 代表黃藍(lán)軸，正值表示黃，負(fù)值表示藍(lán)[14]。

1.2.4 綜合評(píng)分 對(duì)總酸含量、氨基態(tài)氮含量、亮度L 賦值5 分，數(shù)值越大分值越高；亞硝酸鹽含量、菌落總數(shù)賦值各5 分，數(shù)值越大分值越小，然后給與綜合評(píng)分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別以腌制芥菜細(xì)菌總數(shù)、亞硝酸鹽含量和芥菜亮度為因變量（y），以臭氧殺菌時(shí)間（x1）、山梨酸鉀含量（x2）、焦亞硫酸鈉含量（x3）、總酸含量（x4）、氨基態(tài)氮含量（x5）、芥菜亮度L 值（x6）和黃色程度（x7）等為自變量，分析非熱加工因素對(duì)腌制芥菜貯藏品質(zhì)的影響。應(yīng)用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，首先進(jìn)行多元逐步回歸分析[15]；其次，對(duì)進(jìn)入回歸方程的因子，作進(jìn)一步的通徑分析，分析軟件直接將自變量與因變量之間的相關(guān)系數(shù)分解為直接通徑系數(shù)和間接通徑系數(shù)。通徑系數(shù)絕對(duì)值大的自變量因子，其對(duì)因變量的影響也大，否則對(duì)因變量的影響就小[16]。最后，計(jì)算各自變量對(duì)應(yīng)變量綜合作用的決定系數(shù)，如某自變量的決定系數(shù)值最大，且為正值，則該自變量成為影響因變量大小的決定因素；如某自變量的決定系數(shù)值最小，且為負(fù)值，則該自變量構(gòu)成影響因變量波動(dòng)的限制因素[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫貯藏試驗(yàn)1 周

2.1.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析 芥菜包在37℃貯藏1 周后，正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析見(jiàn)表2。所有芥菜貯藏品質(zhì)指標(biāo)在各試驗(yàn)號(hào)之間均無(wú)顯著差異。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

從表2 的極差值可見(jiàn)，影響芥菜氨基態(tài)氮含量、細(xì)菌總數(shù)的主要因子均為焦亞硫酸鈉含量（C），影響芥菜酸度、亞硝酸鹽含量的主要因素均為臭氧殺菌時(shí)間（A），影響芥菜亮度和黃色程度的主要因素分別為檸檬酸含量（D）和山梨酸鉀含量（B）。綜合評(píng)分以7 號(hào)處理（A3B1C3D2）為最高17.0，其次是5 號(hào)處理和9 號(hào)處理，6 號(hào)處理綜合評(píng)分最低12.5。

2.1.2 非熱加工因素與腌制芥菜細(xì)菌總數(shù)、亞硝酸鹽含量之間的關(guān)系 非熱加工因素與細(xì)菌總數(shù)、亞硝酸鹽含量之間的逐步多元回歸方程見(jiàn)表3（P≤0.0322）。由表3 中決定系數(shù)的數(shù)值可見(jiàn)，總酸含量是影響酸芥菜細(xì)菌總數(shù)的決定因素，而氨基態(tài)氮含量是影響芥菜細(xì)菌總數(shù)波動(dòng)的限制因素。影響腌制芥菜亞硝酸鹽含量的決定因素是O3處理，總酸含量是影響芥菜亞硝酸鹽含量波動(dòng)的限制因素。

表3 非熱加工因素與芥菜細(xì)菌總數(shù)、亞硝酸鹽含量之間的關(guān)系Table 3 Relationships between processing factors and total bacterial count，nitrite content of mustard

為探究加工因子影響芥菜細(xì)菌總數(shù)和亞硝酸鹽含量的機(jī)制，作以下通徑分析：焦亞硫酸鈉影響芥菜細(xì)菌總數(shù)的直接作用效果最大（表4），作用系數(shù)達(dá)-1.093（絕對(duì)值最大），而其通過(guò)氨基態(tài)氮對(duì)細(xì)菌總數(shù)產(chǎn)生較大的間接正向作用（作用系數(shù)0.525），致使焦亞硫酸鈉對(duì)芥菜細(xì)菌總數(shù)的綜合作用并非最大，它們之間的相關(guān)系數(shù)小于總酸含量與細(xì)菌總數(shù)間的相關(guān)系數(shù)；氨基態(tài)氮含量對(duì)芥菜細(xì)菌總數(shù)的直接作用系數(shù)絕對(duì)值僅次于焦亞硫酸鈉，為0.742，而其通過(guò)焦亞硫酸鈉對(duì)細(xì)菌總數(shù)產(chǎn)生的間接負(fù)向作用（-0.773）較大，致使氨基態(tài)氮含量對(duì)芥菜細(xì)菌總數(shù)的綜合作用由正向變?yōu)樨?fù)向，它們之間的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值最小?？偹岷繉?duì)芥菜細(xì)菌總數(shù)的綜合作用效果最大，由于總酸含量對(duì)芥菜細(xì)菌總數(shù)的決定系數(shù)為最大正值（0.409），且與細(xì)菌總數(shù)之間的偏相關(guān)系數(shù)【r（y，X總酸含量）=0.9817，P=0.0005】 達(dá)到極顯著水平?？梢?jiàn)，總酸含量是影響細(xì)菌總數(shù)的決定因素；氨基態(tài)氮含量對(duì)細(xì)菌總數(shù)的決定系數(shù)最小，且為負(fù)值-0.729，并與細(xì)菌總數(shù)之間的偏相關(guān)系數(shù)【r（y，X氨基態(tài)氮）】=-0.9864（P <0.01）達(dá)到極顯著水平。由此，氨基態(tài)氮含量是細(xì)菌總數(shù)變化的限制因素，主要通過(guò)焦亞硫酸鈉抑菌效應(yīng)對(duì)細(xì)菌總數(shù)產(chǎn)生較大的間接負(fù)向作用。

表4 非熱加工因子對(duì)芥菜細(xì)菌總數(shù)的通徑分析Table 4 Path analysis of non-thermal processing factors on total bacterial count in mustard

影響芥菜亞硝酸鹽含量最大的直接作用因子為O3處理（表5），作用系數(shù)（絕對(duì)值最大）達(dá)-1.075；其次為總酸，作用系數(shù)為-0.600，而總酸通過(guò)O3殺菌處理對(duì)亞硝酸鹽含量產(chǎn)生較大的間接正向作用（作用系數(shù)0.921），致使總酸對(duì)芥菜亞硝酸鹽含量的綜合作用由負(fù)向變?yōu)檎?。從相關(guān)系數(shù)值可見(jiàn)，O3處理對(duì)芥菜亞硝酸鹽含量的綜合作用效果排序第一，總酸含量排序第二。因O3處理對(duì)芥菜亞硝酸鹽含量的決定系數(shù)最大，且為正值0.491，并與亞硝酸鹽含量之間的偏相關(guān)系數(shù)【r（y，XO3處理）】=-0.8482（P<0.05）達(dá)到顯著水平。因此，O3處理成為芥菜亞硝酸鹽含量（下降）的決定因素；總酸含量對(duì)亞硝酸鹽含量的決定系數(shù)雖最小，也為負(fù)值-0.937，但與亞硝酸鹽含量之間的偏相關(guān)系數(shù)【r（y，X總酸含量】=-0.6658（P＞0.05）未達(dá)到顯著水平，未構(gòu)成亞硝酸鹽含量變化的限制因子。

表5 非熱因子對(duì)芥菜亞硝酸鹽含量的通徑分析Table 5 Path analysis of non-thermal processing factors on nitrite content in mustard

2.2 高溫貯藏試驗(yàn)2 周

芥菜37 ℃高溫貯藏試驗(yàn)2 周后，綜合評(píng)分也以7 號(hào)處理最高21.5，其次是6 號(hào)處理和8 號(hào)處理，3 號(hào)處理的綜合評(píng)分最低10.0。

非熱加工因素（x）與腌制芥菜L 值（y）之間的逐步多元回歸方程通過(guò)了顯著性檢驗(yàn)，y=39.80-0.47x1+15.47x2-1.61x4+47.27x5（n=9，r=0.972，P=0.0091）。其中，y 為芥菜L 值；x1為臭氧處理時(shí)間；x2為山梨酸鉀含量；x4為總酸含量；x5為氨基態(tài)氮含量。影響酸菜L 值的最大直接作用因素為氨基態(tài)氮（表6），作用系數(shù)達(dá)0.824，而其通過(guò)山梨酸鉀對(duì)芥菜L 值產(chǎn)生較大的間接負(fù)向作用（作用系數(shù)-0.356），致使氨基態(tài)氮對(duì)芥菜L 值的綜合作用并非最大；O3處理對(duì)芥菜L 值的直接作用系數(shù)絕對(duì)值雖然最小，作用系數(shù)為-0.282，而其通過(guò)氨基態(tài)氮對(duì)芥菜L 值產(chǎn)生較大的間接負(fù)向作用（作用系數(shù)-0.304），致使O3處理對(duì)芥菜L 值的綜合作用排序第一，它們兩者之間的相關(guān)系數(shù)為-0.557。值得注意的是，山梨酸鉀對(duì)芥菜L 值的直接作用系數(shù)為0.694，而其通過(guò)（抑制腐敗菌分解芥菜產(chǎn)生）氨基態(tài)氮對(duì)芥菜L 值產(chǎn)生較大的間接負(fù)向作用-0.422，從而使山梨酸鉀與芥菜L 值之間的相關(guān)系數(shù)最小。由于山梨酸鉀對(duì)芥菜L 值的決定系數(shù)最小，且為負(fù)值-0.267，并與L 值之間的偏相關(guān)系數(shù)【r（y，X山梨酸鉀）=0.9190，P=0.0098】達(dá)到極顯著水平。因此，山梨酸鉀是影響芥菜L 值變化的限制因素，主要通過(guò)（抑菌抑制芥菜降解產(chǎn)生）氨基態(tài)氮對(duì)芥菜L 值產(chǎn)生較大的間接負(fù)向作用。而O3處理對(duì)芥菜L 值的決定系數(shù)雖為最大正值（0.235），但其與芥菜L 值之間的偏相關(guān)系數(shù)【r（y，）=-0.7316，P=0.0984】未達(dá)到顯著水平，不構(gòu)成影響芥菜L 值的決定因素。另外，酸菜黃色程度與細(xì)菌總數(shù)（r=0.858，P=0.003）和亞硝酸鹽含量（r=0.851，P=0.004）之間均呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，可作為外觀品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表6 非熱加工因素對(duì)酸菜亮度（L 值）的通徑分析Table 6 Path analysis of non-thermal processing factors on the brightness（L value）of mustard

3 討論

一般認(rèn)為，腌制蔬菜中的乳酸菌是通過(guò)產(chǎn)酸達(dá)到抑制腐敗菌的目的[18]，本試驗(yàn)研究表明，非熱加工酸芥菜的細(xì)菌總數(shù)隨著酸度的增大而顯著增加（n=9，r=0.687，P=0.041，表4），可見(jiàn)，這里的細(xì)菌總數(shù)主要是指乳酸菌，乳酸菌產(chǎn)酸使芥菜的酸度增大。氨基態(tài)氮含量主要來(lái)自芥菜的腐敗解體，酸芥菜中的乳酸菌有助于菜體蛋白質(zhì)降解，使氨基態(tài)氮含量升高[19]。王日思等[20]研究發(fā)現(xiàn)，焦亞硫酸鈉和山梨酸鉀對(duì)南酸棗皮均有抑菌作用，焦亞硫酸鈉不僅可以起到護(hù)色作用且抑菌效果要好于山梨酸鉀。這是氨基態(tài)氮含量對(duì)芥菜細(xì)菌總數(shù)既有較大的直接正向作用系數(shù)，又能通過(guò)焦亞硫酸鈉的抑菌作用對(duì)細(xì)菌總數(shù)產(chǎn)生較大的間接負(fù)向作用的緣故（表4）。由于腌制芥菜中的亞硝酸鹽產(chǎn)生自腌制過(guò)程中細(xì)菌分泌的硝酸還原酶對(duì)蔬菜中累積的硝酸鹽的轉(zhuǎn)化[21]，所以可通過(guò)減少細(xì)菌總數(shù)來(lái)降低腌制芥菜亞硝酸鹽含量。試驗(yàn)表明，臭氧處理抑制了芥菜亞硝酸鹽的產(chǎn)生，提示O3處理是促使芥菜亞硝酸鹽含量下降的最大直接作用因子（表5），而總酸含量可通過(guò)O3殺菌處理（減少乳酸菌）間接促進(jìn)了亞硝酸鹽含量的上升，這是因?yàn)槿樗峋幸种苼喯跛猁}產(chǎn)生的作用[19]。綜上，O3對(duì)酸芥菜殺菌處理不宜過(guò)度。

貯藏后期，芥菜隨著不斷被降解產(chǎn)生氨基態(tài)氮，芥菜中的色素物質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，其中葉綠素和花青素不穩(wěn)定、易褪色，而胡蘿卜素和葉黃素在貯藏過(guò)程中比較穩(wěn)定、不易變色，使蔬菜的外觀變黃[22]，這使腌制芥菜的色澤變得淡而白，并使氨基態(tài)氮含量成為影響芥菜L 值最大的直接作用因子（表6）。然而，山梨酸鉀可通過(guò)抑菌抑制芥菜的降解，阻斷色素的分解，減緩腌制芥菜顏色變淡的進(jìn)程。另外，山梨酸鉀還有保持腌制芥菜黃色程度的作用（表2）。

4 結(jié)論

高溫貯藏試驗(yàn)1 周后，總酸含量是酸芥菜（乳酸菌）細(xì)菌總數(shù)的決定因素，氨基態(tài)氮含量是影響細(xì)菌總數(shù)變化的限制因素，主要通過(guò)焦亞硫酸鈉抑菌效應(yīng)對(duì)細(xì)菌總數(shù)產(chǎn)生較大的間接負(fù)向作用。O3處理是酸芥菜亞硝酸鹽含量下降的決定因素。高溫試驗(yàn)2 周后，山梨酸鉀是芥菜L 值變化的限制因素，主要通過(guò)抑菌抑制芥菜的色素分解對(duì)芥菜L 值產(chǎn)生較大的間接負(fù)向作用。酸菜細(xì)菌總數(shù)和亞硝酸鹽含量隨著酸菜黃色程度的加深而極顯著增大，外觀品質(zhì)黃色程度可作為酸菜品質(zhì)評(píng)價(jià)的指標(biāo)。綜合第1 周、第2 周貯藏試驗(yàn)的酸菜品質(zhì)評(píng)分，處理7 號(hào)A3B1C3D2（0.8 mg/L O3臭氧處理3 min，焦亞硫酸鈉含量0.3 mg/mL 和檸檬酸含量1.0 mg/mL）為酸芥菜非熱加工最佳工藝。