付永霞，劉振宇，張 凡，沈 群

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 植物蛋白與谷物加工北京市重點實驗室國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京 100083）

肝損傷可由多種因素引起，例如病毒感染、藥物使用不當(dāng)和攝入有毒食物[1-3]。在這些因素中，藥物使用不當(dāng)引起的急性肝衰竭占到10%～52%，被稱為藥物性肝損傷?？紤]到藥物治療的副作用，肝損傷患者在日常生活中更愿意通過選擇攝入功能性食品來確保肝臟健康[4-5]。

迄今為止，谷物蛋白及其衍生水解物已被證實可有效緩解肝損傷。例如，研究表明黍米蛋白具有預(yù)防肝損傷的功能[6]。此外，攝入大米蛋白可以降低肝損傷大鼠的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate transaminase,AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase,ALT）水平[7]。此外，大米衍生肽通過增加谷胱甘肽水平，從而對乙酰氨基酚引起的小鼠肝損傷起到保護作用[8]。由玉米蛋白制備的兩種玉米蛋白肽也被證明可通過抑制肝細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)Bcl-2 家族蛋白、細(xì)胞表面受體Fas和核因子kappa-B（NF-κB）發(fā)揮預(yù)防急性酒精性肝損傷的作用[9-10]。谷子主要在亞洲和非洲地區(qū)種植，是植物蛋白的重要來源。谷子脫皮后即小米，多項研究已證明小米蛋白及其衍生水解物的潛在生理功能。Chen 等[11]發(fā)現(xiàn)攝入蒸煮前小米和擠壓小米的蛋白水解物可改善自發(fā)性高血壓大鼠的血壓情況。脯氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸（PFLF）和異亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸（IALLIPF）是由小米醇溶蛋白制備的兩種具有較強抗氧化作用的多肽[12]。此外，來自小米醇溶蛋白肽具有很強的胰脂肪酶和脂肪氧化酶抑制活性[13]。然而，目前有關(guān)于小米蛋白對肝損傷的保護作用鮮有報道。此外，蒸煮會影響食物的營養(yǎng)價值，從而影響其生理功能。例如，經(jīng)常攝入反復(fù)加熱的植物油會導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[14]。攝入煮熟的豬肉蛋白會加重谷氧還蛋白1 缺陷小鼠的肝臟炎癥和脂質(zhì)積累[15]。然而，攝入煮熟和發(fā)酵的綠豆均可降低血漿膽固醇濃度并保護肝臟免受損傷[16]。造成上述這些差異的原因可能是蒸煮方法及試驗材料的不同。綜上所述，有必要研究小米蛋白對D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠是否具有保肝作用以及蒸煮對小米蛋白功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗采用的小米品種為東方亮，由山西東方亮生命科技股份有限公司提供。D-半乳糖胺，Sigma-Aldrich 公司；ALT、AST、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-B 水浴恒溫振蕩器，上海龍躍有限公司；FD-1A-50 冷凍干燥機，北京博醫(yī)康有限公司；ACCULAB ALC-110.4 分析天平，德國Sartorius公司。

1.3 蒸煮前、后小米粗蛋白的制備

根據(jù)Molla 等[17]的方法提取蒸煮前小米蛋白。將脫脂處理后的小米粉與水按料液比1∶5 的比例混合，磁力攪拌15 min 使其混合均勻，調(diào)節(jié)pH 值為7.0，加入7%的α-淀粉酶后在50 ℃的水浴中振蕩36 h。在振蕩過程中，每隔3 h 檢查一次pH值并將其調(diào)整為7.0。振蕩結(jié)束后，將混合物在室溫下以11 000 r/min 的速度離心15 min 收集沉淀，凍干得到小米蛋白。小米蛋白質(zhì)含量為44.07%，提取率為7.17%。然后在100 ℃下煮沸30 min 制備蒸煮后小米蛋白并在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蒸煮前、后小米蛋白的氨基酸組成

采用酸水解法對小米蛋白的氨基酸組成進行分析。將約18 mg 小米蛋白樣品（相當(dāng)于8 mg 純蛋白）放入安瓿瓶中，加入含0.1%苯酚的6 mol/L鹽酸溶液溶解小米蛋白樣品，然后將安瓿瓶放入烘箱中，在110 ℃下水解24 h，用氮氣吹干鹽酸。隨后，將干燥的小米蛋白樣品加水復(fù)溶，然后配置兩種衍生試劑溶液（異硫氰酸苯酯和三乙胺），加入200 μL 上述小米蛋白樣品溶液，搖勻，室溫反應(yīng)60 min。隨后，在上述反應(yīng)液中加入400 μL 正己烷，振蕩5～10 s，室溫下分層后收集約200 μL下層溶液與800 μL 水混合。隨后繼續(xù)取200 μL上述上述混合液與800 μL 水混合，過膜過濾，得到最終待測樣品溶液。隨后采用高效液相色譜法進行氨基酸分析。對含硫氨基酸（甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸）、支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、L-纈氨酸）和疏水性氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、色氨酸、丙氨酸）的含量均進行了計算。此外，還計算了必需氨基酸與總氨基酸和必需氨基酸與非必需氨基酸的比率。此外，氨基酸評分計算如下：

1.5 動物實驗

雄性昆明小鼠（6 周齡，平均體重39.69 g），購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。飼養(yǎng)條件嚴(yán)格按照《實驗動物管理條件》進行，實驗方案得到中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物福利與動物實驗倫理審查委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號為：AW03401202-4-1。所有小鼠自由進食和飲水。動物飼料參考Nishizawa等[6]的設(shè)計并作了適當(dāng)修改。正常飼料中的酪蛋白分別被蒸煮前、后小米蛋白所取代。制備動物飼料所用的酪蛋白和小米蛋白營養(yǎng)成分見表1。動物飼料組成及飼料中蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的能量百分比見表2 和表3。

表1 酪蛋白和小米蛋白的營養(yǎng)成分Table 1 Nutritional composition of casein and foxtail millet protein

表2 動物飼料組成Table 2 Composition of animal diets

表3 動物飼料中蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物成分和能量的百分比Table 3 The percentage of composition and energy of protein，fat and carbohydrate in animal feeds

動物實驗設(shè)計見圖1。所有小鼠適應(yīng)性培養(yǎng)3 d 后隨機分為4 組：1）正常組：喂食正常飼料而不注射D-半乳糖胺（每組6 只）；2）模型組：喂食正常飼料并注射D-半乳糖胺（每組6 只）；3）蒸煮前小米蛋白組：喂食蒸煮前小米蛋白飼料并注射D-半乳糖胺（每組6 只）：4）蒸煮后小米蛋白組：喂食蒸煮后小米蛋白飼料并注射D-半乳糖胺（每組6 只）。干預(yù)15 d 后，所有小鼠禁食10 h 后腹腔注射D-半乳糖胺（400 mg/kg）。注射D-半乳糖胺24 h 后，處死所有小鼠并采集血液和肝臟樣本。

圖1 實驗設(shè)計Fig.1 Experimental design

1.6 生化分析

使用全自動生化分析儀測定血清中酶活性，包括AST、ALT、LDH 和總膽固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein,HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein,LDL-C）的水平。除此之外，還測定了肝臟中TC 和TG 以及MDA 的水平。為了計算MDA，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白質(zhì)含量。

1.7 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用軟件SPSS 17.0 進行單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用Duncan 法，P<0.05 為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸煮前、后小米蛋白中氨基酸的測定

蒸煮前、后小米蛋白質(zhì)的氨基酸含量如表4所示，結(jié)果表明蒸煮前小米蛋白中必需氨基酸和非必需氨基酸分別為24.80 mg/g 和42.44 mg/g 小米蛋白，而蒸煮后小米蛋白中的分別為12.95 mg/g和28.07 mg/g 小米蛋白。蒸煮后小米蛋白中氨基酸含量的降低是由蒸煮所引起的。值得注意的是，蒸煮還降低了含硫氨基酸、支鏈氨基酸和疏水性氨基酸的含量。此外，蒸煮前小米蛋白的必需氨基酸與總氨基酸和必需氨基酸與非必需氨基酸的比率（0.35 和0.58）接 近WHO 推 薦 值（0.36 和0.60），根據(jù)世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)[18]，蒸煮前小米蛋白可以被認(rèn)為具有足夠的營養(yǎng)。氨基酸評分是食品蛋白質(zhì)營養(yǎng)評價的指標(biāo)，也稱為蛋白質(zhì)化學(xué)評分。蒸煮前小米蛋白的氨基酸評分高于蒸煮后小米蛋白，說明蒸煮前小米蛋白的營養(yǎng)價值優(yōu)于蒸煮后小米蛋白。然而，蒸煮前、后小米蛋白的氨基酸評分都符合世界衛(wèi)生組織提出的優(yōu)質(zhì)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 蒸煮前、后小米蛋白對小鼠攝食量，血清中AST、ALT、LDH 和肝臟中MDA 水平的影響

蒸煮前、后小米蛋白對小鼠攝食量，血清AST、ALT 和LDH 以及肝臟MDA 影響如圖2 所示。在所有組中均未觀察到食物攝入量之間有顯著差異，表明攝入小米蛋白并不會影響小鼠的食物攝入量。此外，AST、ALT 和LDH 是評估肝功能的重要生物標(biāo)志物。MDA 是脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物，具有較強的生物毒性，可加重生物膜損傷。因此，MDA 常用于測定膜脂過氧化程度。在本實驗中，模型組AST、LDH 水平明顯高于正常組。與模型組相比，小米蛋白干預(yù)顯著降低了血清中AST、ALT、LDH 和肝臟MDA 水平，說明小米蛋白對預(yù)防小鼠急性肝損傷有一定的有益作用。值得注意的是，喂食蒸煮前小米蛋白的小鼠血清AST、ALT和肝臟MDA 水平顯著低于喂食蒸煮后小米蛋白的小鼠，這表明蒸煮減弱了小米蛋白對急性肝損傷的保護作用。這是由于蒸煮降低了小米蛋白質(zhì)中含硫氨基酸、支鏈氨基酸等氨基酸的含量。先前的研究也表明，3 種中國本土豆科植物種子的氨基酸含量會隨著烹飪時間的增加而降低[19]。此外，非洲面包樹種子種皮中的部分氨基酸（賴氨酸、蛋氨酸和甘氨酸）含量在蒸煮處理中也減少了[20]。這與本研究中蒸煮后小米蛋白的氨基酸含量明顯低于蒸煮前小米蛋白相一致（表4）。蛋白質(zhì)中較高的氨基酸含量有助于體內(nèi)肽和氨基酸的轉(zhuǎn)運，從而對機體產(chǎn)生積極影響[21]。例如，在含有10%大豆蛋白的飲食中補充足量的蛋氨酸和半胱氨酸可以減輕N-亞硝基二甲胺對大鼠造成的氧化損傷[22]。一項有關(guān)于含硫氨基酸對大鼠肝纖維化和星狀細(xì)胞功能影響的研究表明包括L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸在內(nèi)的含硫氨基酸延緩了星狀細(xì)胞的活化并抑制了肝纖維化的進展[23]，提示蒸煮前小米蛋白中較高的含硫氨基酸含量有利于其對急性肝損傷的預(yù)保護作用。除此之外，口服支鏈氨基酸可減輕缺血再灌注引起的肝損傷[24]。支鏈氨基酸還可有效降低肝臟MDA 水平并逆轉(zhuǎn)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化[25]。補充支鏈氨基酸還可改善肝硬化患者的胰島素和葡萄糖耐量[26]，其中的亮氨酸具有治療代謝綜合征的功能。富含亮氨酸的玉米肽在一定劑量下可以緩解四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[27]。在本研究中，蒸煮前小米蛋白組的支鏈氨基酸高于蒸煮后小米蛋白組。此外，蒸煮前小米蛋白中的丙氨酸和谷氨酸水平也高于蒸煮后小米蛋白（表4）。值得注意的是，蒸煮后小米蛋白仍然可以發(fā)揮其對急性肝損傷的保護作用?？偟膩碚f，小米蛋白的攝入可以改善小鼠的肝損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)，其中蒸煮前小米蛋白可以更好地預(yù)防小鼠的急性肝損傷，而蒸煮會降低蛋白中氨基酸含量導(dǎo)致小米蛋白對急性肝損傷的保護功能被削弱。

圖2 蒸煮前、后小米蛋白對小鼠攝食量和血清中AST、ALT 和LDH 水平的影響Fig.2 Effects of foxtail millet proteins before and after cooking on food intake，AST，ALT and LDH levels in mice

表4 小米蛋白的氨基酸組成和氨基酸評分Table 4 Amino acid composition and amino acid scores of foxtail millet protein

圖3 蒸煮前、后小米蛋白對小鼠肝臟MDA 水平的影響Fig.3 Effects of foxtail millet proteins before and after cooking on liver MDA in mice

2.3 蒸煮前、后小米蛋白對小鼠血清和肝臟中脂質(zhì)水平的影響

報道稱脂質(zhì)代謝與ABCB4 基因敲除小鼠的肝損傷有關(guān)。在酒精性肝病的早期階段也觀察到甘油三酯在肝細(xì)胞中的積累[19]，提示脂質(zhì)代謝水平與肝損傷之間關(guān)系密切。蒸煮前、后小米蛋白對小鼠血清和肝臟中脂質(zhì)水平的影響結(jié)果見表5。當(dāng)給患有肝損傷的大鼠喂食大米蛋白飲食時，也觀察到了相同的趨勢[7]。對照組和模型組之間除血清TC 和HDL-C 外，其它血清指標(biāo)和肝臟脂質(zhì)水平之間沒有顯著性差異。飼喂小米蛋白15 d 后，小米蛋白組血清TG、TC 和LDL-C 水平顯著低于模型組。此外，蒸煮前小米蛋白組肝臟TG 水平低于模型組（P<0.05）。值得注意的是，蒸煮前小米蛋白組TC、TG、LDL-C 等血清脂質(zhì)水平顯著低于蒸煮后小米蛋白組，說明攝入蒸煮前小米蛋白可以更好地改善急性肝損傷小鼠的血脂紊亂?？傮w而言，小米蛋白干預(yù)可以改變小鼠血清和肝臟中的脂質(zhì)水平，從而預(yù)防D-半乳糖誘導(dǎo)的急性肝損傷，而該預(yù)防保護作用會因蒸煮而減弱。這是由于蒸煮降低了小米蛋白質(zhì)中含硫氨基酸、支鏈氨基酸等氨基酸的含量。含硫氨基酸的膳食補充劑有利于脂質(zhì)代謝[28]。蛋氨酸的抗氧化特性可能有助于抑制肝損傷小鼠或大鼠的脂質(zhì)氧化[29]。除此之外，膳食補充支鏈氨基酸可以減少低白蛋白血癥患者骨骼肌中的脂肪堆積[30]。綜上，蒸煮前小米蛋白中較高的含硫氨基酸和支鏈氨基酸含量有利于其對急性肝損傷的預(yù)保護作用。

表5 蒸煮前、后小米蛋白干預(yù)對小鼠血清和肝臟中脂質(zhì)水平的影響（mmol/L）Table 5 Lipids in serum and liver of mice fed with foxtail millet protein before and after cooking（mmol/L）

3 結(jié)論

本文研究了小米蛋白對急性肝損傷小鼠的保護作用，以及蒸煮是否影響了小米蛋白的功能。結(jié)果表明，蒸煮前、后小米蛋白的攝入都可以通過降低血清和肝臟中AST、ALT、LDH、MDA 和脂質(zhì)的水平來減輕急性肝損傷。蒸煮會減少小米蛋白中對改善急性肝損傷有益的氨基酸含量，包括含硫氨基酸、支鏈氨基酸、丙氨酸、谷氨酸等削弱了其護肝功能。因此蒸煮前小米蛋白對肝損傷的保護作用優(yōu)于蒸煮后小米蛋白。然而，人們在日常生活中通常會食用蒸煮后的食物，應(yīng)更加重視通過添加功能性氨基酸來增強蒸煮后小米蛋白的營養(yǎng)。