馮翠嬌，張唯勤，彭傳濤，張和平*

（1 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 呼和浩特010018 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特010018 3 內(nèi)蒙古乳品生物技術(shù)與工程重點實驗室 呼和浩特010018 4 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266109）

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是一種涉及回腸、直腸和結(jié)腸的慢性、非特異性免疫介導(dǎo)的胃腸道疾病[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及飲食的西方化，中國IBD 發(fā)病率的增長速度已成為亞洲地區(qū)最快的國家[2]，呈逐年上升的趨勢。雖然IBD 病因尚未闡明，但是目前認(rèn)為，腸道微生物群失衡和免疫系統(tǒng)功能障礙在IBD 發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3]。IBD 患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著區(qū)別于健康對照，主要表現(xiàn)為微生物多樣性下降，微生物群落穩(wěn)定性改變[4]。

目前，IBD 的治療以緩解和預(yù)防疾病復(fù)發(fā)為主。雖然仍無法了解腸道菌群失調(diào)與腸道炎癥的因果關(guān)系[5]，但是以腸道菌群為導(dǎo)向的各種治療方法，包括飲食、益生菌、糞菌移植、益生元等，通過恢復(fù)腸道共生菌的多樣性和組成，成為IBD 在內(nèi)的胃腸道疾病的新型干預(yù)措施[6]。國際益生菌和益生元科學(xué)協(xié)會（International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics，ISAPP）于2021 年對后生元的定義和范圍發(fā)表共識聲明，指出后生元是對宿主健康有益的無生命微生物和/或其成分的制劑[7]。作為新起之秀，后生元引領(lǐng)了新一輪的研究熱潮。相較于益生菌，后生元具有保質(zhì)期長以及化學(xué)結(jié)構(gòu)明確等優(yōu)點。重要的是后生元發(fā)揮益生功能無需依賴于活細(xì)胞，可避免活菌所引起的潛在風(fēng)險[8]。本研究通過建立葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的IBD 大鼠模型，探究含有后生元Probio-Eco?的奶粉的抗炎特性，以及對腸道菌群和機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制，以期加深對后生元的認(rèn)知，并為相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7 周齡SPF 級Wistar 雄性大鼠購自中國北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（SCXK（京）2019-0008），體重為200～220 g。在實驗期間，所有動物保持在12 h/12 h 晝夜明暗交替的SPF 級屏障環(huán)境中【溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%）】。動物自由采食和飲水。實驗經(jīng)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 材料、試劑與儀器

市售奶粉，中國內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司；大豆粉，上海麥克林生化科技股份有限公司；脫脂乳，新西蘭恒天然集團(tuán)；檸檬酸鈉，蘇州如日化工科技有限公司；甲醇，上海麥克林生化科技股份有限公司；葡聚糖硫酸鈉（分子質(zhì)量：36 000～50 000 u），美國MP生物醫(yī)療公司；ELISA試劑盒，美國R&D公司；QIAamp Fast DNA Stool Mini-Kit 試劑盒，德國凱杰生物公司；0.22 μm 微孔濾膜過濾器，中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。

SRH60-70 型高壓均質(zhì)機(jī)，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；7890B GC-5977A MSD 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；-80 ℃超低溫冰箱，青島海爾集團(tuán)；高速臺式離心機(jī)，德國Eppendorf公司；分析天平，瑞士Mettler 公司；5 mL 注射器，美國BD 公司；12 號灌胃針，北京江晨源遠(yuǎn)生物科技有限責(zé)任公司；微量紫外分光光度計，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 后生元Probio-Eco?制備

將大豆粉、脫脂乳和檸檬酸鈉與水充分混合15 min，并預(yù)熱至55～60 ℃。在18～20 MPa 下均質(zhì)后于95 ℃殺菌60 min。冷卻至35 ℃后分別接種3種益生菌菌株（干酪乳酪桿菌Zhang、植物乳植桿菌P-8、動物雙歧桿菌乳亞種V9），恒溫（35 ℃）攪拌發(fā)酵，pH 值至4.50～4.60 時終止發(fā)酵過程。然后加入麥芽糊精，并將發(fā)酵液在75 ℃滅菌15 min，隨后進(jìn)行無菌均質(zhì)（25～30 MPa）。以進(jìn)風(fēng)溫度210℃、出風(fēng)溫度88 ℃的條件對發(fā)酵液進(jìn)行噴霧干燥后得到后生元Probio-Eco?。經(jīng)檢測符合關(guān)于污染物、真菌毒素以及微生物限量標(biāo)準(zhǔn)。同時按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.157-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品有機(jī)酸的測定》[9]和GB 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》[10]分別檢測后生元Probio-Eco?中有機(jī)酸和氨基酸的含量。

將后生元Probio-Eco?以1‰添加量與市售奶粉混合均勻，即得到后生元奶粉。對照奶粉組不加后生元Probio-Eco?。

1.4 IBD 模型構(gòu)建

大鼠屏障環(huán)境適應(yīng)性飼喂7 d 后，連續(xù)飲用添加3%（3 g/100 mL）DSS 的無菌水溶液7 d，完成IBD 模型的構(gòu)建。第8 天開始飲用無菌水。

1.5 動物分組與樣本收集

實驗設(shè)計如圖1 所示，分為模型組、對照奶粉組、后生元奶粉組，每組8 只。模型組大鼠每天灌胃2 mL 生理鹽水，對照奶粉組和后生元奶粉組每天灌胃等量體積相應(yīng)奶粉（800 mg/2 mL），每天一次，連續(xù)14 d。每7 d 記錄一次大鼠體重，觀察大鼠精神狀態(tài)、糞便性狀。第21 天時，收集大鼠糞便，用于宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)分析。大鼠經(jīng)異氟烷麻醉后處死，收集血液用于細(xì)胞因子檢測，取結(jié)腸組織用于病理學(xué)分析。

上述三大類標(biāo)記方法在中學(xué)生物學(xué)教材中均有涉及。例如，探究光合作用有機(jī)物生成路徑的實驗中，卡爾文即是利用“植物營養(yǎng)室”培養(yǎng)法，在密閉的小室中，向小球藻供以14CO2進(jìn)行光合作用；探究分泌蛋白合成與運輸路徑的實驗中，詹姆森等通過注射法，向豚鼠的胰腺腺泡細(xì)胞注射3H標(biāo)記的亮氨酸；探究生物體遺傳物質(zhì)的實驗中，赫爾希與蔡斯則是利用含32P與35S的大腸桿菌作為活體培養(yǎng)基，實現(xiàn)對噬菌體DNA及蛋白質(zhì)外殼的標(biāo)記。

圖1 實驗設(shè)計Fig.1 Experimental design

1.6 蘇木素-伊紅（H &E）染色

大鼠腹部消毒后，解剖并分離結(jié)腸組織。選取PBS 沖洗后的結(jié)腸末端，將其固定于4%多聚甲醛溶液中。固定后，取4 μm 厚組織切片進(jìn)行H &E染色，在不同倍數(shù)下詳細(xì)觀察組織切片情況，并記錄切片中基本病理變化，如水腫、變性、壞死、增生、纖維化、炎性變化等。組織病變程度采用五級分法，無病變或極少量病變計分為0；有輕度病變或少量病變計分為1；有中度病變或中等量病變計分為2；有重度病變或多量病變計分為3；有極重度病變或大量病變計分為4。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

大鼠血液于3 000 r/min，離心10 min 獲得血清。使用ELISA 試劑盒，按照制造商說明測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 含量。

1.8 糞便代謝組學(xué)測定

將貯藏于-80 ℃的糞便樣本置于室溫下自然解凍；稱取0.06 g 樣品于含有1 mL 預(yù)冷（冰?。┑募状?水溶液（體積比4∶1）的無菌離心管中，高速震蕩30 s 后超聲30 min。4 ℃下4 000×g 離心10 min，吸取上清液于新的2 mL 離心管中，吸取盡可能多的上清液再次重復(fù)以上甲醇提取步驟。將兩次離心收集的上清液于4 ℃下10 000×g 離心5 min，得到的上清液通過0.22 μm 微孔濾膜過濾器以進(jìn)行進(jìn)一步分析。質(zhì)控（QC）樣品通過從每個上樣瓶（1.5 mL）中吸取一定量樣品混合至同一樣品瓶中（約1 mL）制備，用于評估LC-MS 平臺的重復(fù)性和穩(wěn)定性。研究采用UPLC-Q-TOF 系統(tǒng)，按照Li 等[11]的研究進(jìn)行系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置。用Progenesis QI 對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰值提取、峰值對齊、去卷積和歸一化處理后，進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析并通過KEGG 數(shù)據(jù)庫對不同代謝產(chǎn)物注釋以篩選差異代謝通路。

1.9 腸道菌群宏基因組測序及生物信息學(xué)分析

將第21 天收集到的各組大鼠的新鮮糞便存放于滅菌的2 mL EP 管中，存入-80 ℃冰箱備用。提取全部糞便樣品的DNA，并用微量紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法測定提取的DNA 濃度和純度。全基因組測序在Illumina-HiSeq 2500 PE150 測序平臺上進(jìn)行。每個樣品產(chǎn)生約5 Gb 下機(jī)數(shù)據(jù)。將下機(jī)得到的原始數(shù)據(jù)利用HUMAnN2軟件進(jìn)行質(zhì)控及物種注釋。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用IBM SPSS 21.0 軟件和R 編程語言（v 4.1.1）進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析以及Tukey 多重比較檢驗三組數(shù)據(jù)之間的差異性。Wilcoxon 檢驗用于兩組數(shù)據(jù)之間的差異分析，P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用R 軟件包（http：//www.Rproject.org/）處理宏基因組數(shù)據(jù)。圖形由Origin 2017 和R 軟件包生成。

2 結(jié)果

2.1 后生元Probio-Eco?中的有機(jī)酸和氨基酸含量

后生元Probio-Eco?中檢測到的有機(jī)酸和氨基酸含量如圖2 所示。共檢測到26 種有機(jī)酸，包含12 種長不飽和脂肪酸和14 種飽和脂肪酸，其中順-9-十八碳一烯酸含量最高。共檢測到12 種氨基酸，包含3 種成人必需氨基酸（蘇氨酸、亮氨酸、賴氨酸）以及嬰幼兒所需的組氨酸。此外，含有的精氨酸和胱氨酸為早產(chǎn)兒所必需。

圖2 后生元Probio-Eco?中有機(jī)酸和氨基酸含量Fig.2 Organic acid and amino acid content in postbiotics Probio-Eco?

2.2 含后生元的奶粉對大鼠體重的影響

整個實驗期間，模型組、對照奶粉組和后生元奶粉組大鼠體重均呈現(xiàn)上升趨勢。0～7 d，各組大鼠體重?zé)o明顯差異。飲用DSS 后大鼠出現(xiàn)糞便不成形，便血等情況。與模型組比較，在實驗終點第21 天時后生元奶粉可顯著提高大鼠體重（P<0.01），且整體生長情況良好，腹瀉等癥狀得到有效緩解。

2.3 含后生元的奶粉對大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

圖3 實驗過程中大鼠體重的變化Fig.3 Body weight changes of rats during the experiment

圖4 大鼠結(jié)腸組織H &E 染色及組織學(xué)損傷評分Fig.4 H &E staining and histological damage scores of rat colon tissue

2.4 含后生元的奶粉對大鼠血清IL-1β、TNFα、IL-6 和IL-10 水平的影響

由圖5 可知，與對照奶粉組相比，后生元奶粉干預(yù)可有效降低TNF-α 和IL-1β 水平，尤其是TNF-α 水平（P<0.05）。IL-6 和IL-10 的水平在三組之間無顯著差異。以上結(jié)果表明后生元奶粉可以通過降低血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)進(jìn)而緩解DSS 誘導(dǎo)的腸道炎癥。

圖5 大鼠血清中細(xì)胞因子的變化Fig.5 Serum cytokines changes in rat

2.5 含后生元的奶粉對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成的影響

炎癥性腸病與腸道微生物群的改變密切相關(guān)?；贐ray-Curtis 距離分析不同處理組大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化。PCoA 圖反映出后生元奶粉組有遠(yuǎn)離其它組的趨勢，可能代表了不同的菌群結(jié)構(gòu)。此外，后生元奶粉組的組內(nèi)Bray-Curtis 距離顯著低于模型組和對照奶粉組（P<0.001），表明灌胃后生元奶粉縮小了個體之間腸道微生物群的異質(zhì)性，可有效恢復(fù)DSS 誘導(dǎo)引起的腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)。

進(jìn)一步篩選對照奶粉組和后生元奶粉組之間的差異細(xì)菌，共注釋到6 個差異物種。其中，舍氏小螺菌和腸擬桿菌在后生元奶粉組中的相對豐度顯著低于對照奶粉組，而糞便擬桿菌、鼠乳桿菌、狄氏副擬桿菌和陰道乳桿菌則在后生元奶粉組中高表達(dá)。

圖6 大鼠腸道菌群的變化Fig.6 Intestinal microbiota changes in rats

2.6 含后生元的奶粉對大鼠糞便代謝物的影響

使用Metabo Analyst 在線工具分析各組大鼠的糞便代謝組特征。PCA 得分圖指出，與模型組相比，對照奶粉組和后生元奶粉組呈現(xiàn)顯著不同的聚類模式，表明IBD 大鼠飲食奶粉后對其糞便代謝影響較大，可明顯改變其代謝特征。此外，利用火山圖共篩選出對照奶粉組和后生元奶粉組的差異代謝物181 個（VIP＞1，|fold-change|<2，P<0.05）。與對照奶粉相比，后生元奶粉上調(diào)代謝物113 個，下調(diào)代謝物68 個。進(jìn)一步利用KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行后生元奶粉組的代謝通路富集分析。預(yù)測到的通路包括維生素E 合成、膽汁酸合成、丁酸代謝、脂肪酸合成、TCA 循環(huán)以及色氨酸代謝，推測后生元奶粉可能通過調(diào)節(jié)上述代謝途徑，從而達(dá)到緩解大鼠IBD 的效果。

3 討論

炎癥性腸病臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便血等，且常反復(fù)發(fā)作，難以治愈，甚至?xí)鸾Y(jié)腸癌、血栓等嚴(yán)重疾病。近年來該病在我國發(fā)病率不斷升高，已成為一種社會公共性健康問題。作為一種飲食成分，后生元的攝入會影響機(jī)體腸道菌群的組成。本研究采用3% DSS 誘導(dǎo)的大鼠IBD模型，以普通奶粉作為對照，用添加了后生元Probio-Eco?的奶粉進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)后生元奶粉可通過調(diào)節(jié)腸道菌群及代謝物的產(chǎn)生，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，有效緩解大鼠IBD 癥狀。

經(jīng)測定，后生元Probio-Eco?中富含多種長鏈不飽和脂肪酸，其對于嬰兒大腦和身體發(fā)育具有重要作用[12]。此外，檢測到的眾多氨基酸是構(gòu)成人體免疫系統(tǒng)的基本原料，并影響其功能。補充全面均衡的氨基酸，將有助于提高機(jī)體免疫力。因此，后生元Probio-Eco?可以作為一種生物活性成分，添加至奶粉中賦予其良好的營養(yǎng)特性。

本研究發(fā)現(xiàn)，DSS 組大鼠在整個生長過程中仍表現(xiàn)為體重增加，后生元奶粉干預(yù)后可顯著增加大鼠體重增長速度。追朔相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在IBD嚙齒動物模型中確實報告了對體重增加/減少的不同影響。例如，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在DSS 誘導(dǎo)后基本上會表現(xiàn)為體重減輕。然而相比之下，大鼠在DSS 誘導(dǎo)期間可能表現(xiàn)為體重下降亦或上升。例如，關(guān)于β-胡蘿卜素和羊奶中分離的低聚糖減輕DSS 誘導(dǎo)的IBD 大鼠腸道炎癥的研究中均發(fā)現(xiàn)DSS 誘導(dǎo)后，大鼠體重減輕[13-14]。然而，在JAK2 抑制劑AG490 緩解IBD 的研究中指出DSS 誘導(dǎo)大鼠IBD 期間，盡管大鼠體重在第7 天體重增重減小，但是始終表現(xiàn)為增長趨勢[15]。Mahoro 等[16]的研究也得到了類似的結(jié)果。Ritchie 等[17]利用新型高粱麩日糧改善DSS 誘導(dǎo)的大鼠IBD 時發(fā)現(xiàn)，無論是在DSS 誘導(dǎo)前或后進(jìn)行膳食干預(yù)，在整個過程中大鼠體重一直處于增長狀態(tài)，這與本文的研究結(jié)果一致。體重變化在一定程度上反映了大鼠的健康狀況[18]，雖然以上研究中體重對DSS 誘導(dǎo)表現(xiàn)出不同的響應(yīng)，但其共性均表明DSS 處理會影響動物的正常生長。

圖7 大鼠糞便代謝物的變化Fig.7 Fecal metabolites changes in rats

炎癥性腸炎與腸道菌群紊亂密切相關(guān)。正常情況下，腸道菌群處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)從而維持機(jī)體健康狀況[19]。宏基因組研究揭示攝入DSS后會破壞腸道微生態(tài)的結(jié)構(gòu)和功能[20]。益生菌廣泛應(yīng)用于腸道菌群的調(diào)節(jié)，并已在臨床上用來改善某些腸道炎癥損傷[21-23]。然而，益生菌干預(yù)并不總是對這些腸道疾病有效，甚至在疾病過程中存在加重疾病的風(fēng)險。后生元具有包括腸道、口腔以及皮膚等在內(nèi)的眾多作用靶點，其中腸道仍然是發(fā)揮健康作用的主要場所。研究發(fā)現(xiàn)熱滅活的短乳桿菌SBC8803 通過調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β 和IL-12 的表達(dá)，改善氧化應(yīng)激下腸上皮的屏障功能從而提高結(jié)腸炎小鼠的存活率[24]。唾液乳桿菌Ls33的裂解物作為一種有效的治療策略，通過誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子IL-10 的產(chǎn)生而發(fā)揮保護(hù)結(jié)腸炎小鼠的作用[25]。此外，后生元能有效治療克羅恩病引起的腸道菌群紊亂[26]。本研究確定了6 種響應(yīng)后生元奶粉干預(yù)的細(xì)菌。與對照奶粉組相比，灌胃后生元奶粉14 d 后顯著降低了舍氏小螺菌和腸擬桿菌的平均相對豐度。舍氏小螺菌已被證實與腸道炎癥呈正相關(guān)關(guān)系，相較于緩解期，在小鼠結(jié)腸炎活躍期糞便中豐度較高，而特異性移植腸擬桿菌則會導(dǎo)致腸道內(nèi)IL-1β 水平顯著升高，腸道損傷加重[27]。反之，糞便擬桿菌和狄氏副擬桿菌的豐度顯著增加。糞便擬桿菌作為一種短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌能夠有效緩解腸道炎癥[28]。Treg 細(xì)胞主要參與調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)。狄氏副擬桿菌可刺激人CD4+CD25+T 細(xì)胞及小鼠的IL-10+FoxP3+Treg產(chǎn)生抑炎因子IL-10 從而降低炎癥水平[29]。同時顯著富集了兩種重要的乳酸菌鼠乳桿菌和陰道乳桿菌，對于改善大鼠IBD 癥狀具有重要作用。綜上，后生元奶粉可能通過增加大鼠腸道有益微生物群的豐度，同時抑制一些有害微生物的生長因而緩解大鼠IBD。

后生元奶粉組的糞便代謝物表現(xiàn)出顯著變化。以上顯著富集的代謝途徑對于腸道穩(wěn)態(tài)均具有重要意義。研究證實IBD 患者腸道中存在高豐度的變形桿菌[30]，而維生素E 對變形桿菌有顯著的抑制作用[31]。此外，丁酸和膽汁酸是重要的腸道菌群代謝物，具有抗炎作用，可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡并恢復(fù)腸道功能[32-33]。脂肪酸生物合成和TCA循環(huán)均是腸道菌群的基礎(chǔ)代謝，在細(xì)菌功能中占據(jù)重要位置。色氨酸作為人體的必需氨基酸，其代謝水平降低與IBD 腸上皮屏障受損密切有關(guān)[20]。因而以上功能通路的調(diào)節(jié)可能是后生元奶粉改善IBD 的另一種機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究選擇DSS 誘導(dǎo)的IBD 動物模型，探究后生元奶粉對大鼠腸道菌群和機(jī)體免疫的調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制。

1）與模型組相比，后生元奶粉干預(yù)可顯著提高大鼠體重；降低組織學(xué)損傷評分，以及促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β 水平。

2）宏基因組測序結(jié)果表明，后生元奶粉降低大鼠腸道中舍氏小螺菌和腸擬桿菌的相對豐度，而增加糞便擬桿菌、鼠乳桿菌、狄氏副擬桿菌以及陰道乳桿菌的相對豐度。

3）基于非靶向代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，后生元奶粉改變了大鼠糞便代謝特征。顯著上調(diào)113 個代謝物，下調(diào)68 個代謝物。同時后生元奶粉組共預(yù)測到6 條顯著富集的代謝通路，包括維生素E 合成、膽汁酸合成、丁酸代謝、脂肪酸合成、TCA 循環(huán)以及色氨酸代謝。

綜上所述，后生元奶粉可能通過降低血清促炎細(xì)胞因子水平，調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群以及糞便代謝物，從而緩解大鼠IBD 腸道炎癥。本研究為后生元的開發(fā)利用以及奶粉制品的品質(zhì)提升提供了科學(xué)依據(jù)，并為IBD 的防治提供新的思路。