陳楚玲，鄧寧華，羅 梅，林全全，韓劍眾

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 浙江省食品安全重點實驗室 杭州 310018）

蛋白質(zhì)是人體日?；顒铀匦璧臓I養(yǎng)物質(zhì)，目前可體外攝入的蛋白質(zhì)主要有動物蛋白和植物蛋白。動物蛋白主要從動物肉中獲取，其較植物蛋白含有更為完整和豐富的人類必需氨基酸并擁有更高的營養(yǎng)價值，是優(yōu)質(zhì)蛋白的主要來源。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和生活水平的提高，人們對肉類食品的需求呈爆炸性增長。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織預(yù)計，2050年肉類消費將會增加1 倍[1]。目前，全球肉類生產(chǎn)能力已接近其最大值[2]，傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)的供給側(cè)面臨嚴峻考驗。此外，動物蛋白所含有的大量脂肪可能會給人類健康帶來極大威脅。為應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，必須要開發(fā)新產(chǎn)品來替代動物肉[3]。在此背景下，植物基人造肉（簡稱植物肉）應(yīng)運而生。組織化植物蛋白是植物肉最主要的配料，它是以植物蛋白為主要原料，以淀粉、油脂、纖維素等為主要輔料，采用熱凝固法、纖維紡絲法、擠壓等方法制得的類似動物肉纖維狀結(jié)構(gòu)和口感的蛋白產(chǎn)品[4]。

在未來5～20 年間，植物肉市場份額預(yù)計將逐漸增長至全球肉類市場的10%～25%。這意味著在不遠的將來，植物肉可能成為動物肉的重要替代品。因此，有必要對其蛋白質(zhì)進行消化營養(yǎng)評價研究。大量研究表明，食品結(jié)構(gòu)與其消化特性有極為突出且重要的相關(guān)性[5]。纖維結(jié)構(gòu)是組織化植物蛋白最重要的結(jié)構(gòu)屬性[6]，而目前并未明確纖維結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)消化特性之間的聯(lián)系，因而加強此方面的研究就顯得尤為關(guān)鍵。本項目擬以組織化大豆蛋白作為植物肉，通過分析植物肉與豬肉的纖維結(jié)構(gòu)特性的差異，以及體外消化過程中蛋白質(zhì)、可溶性氮等含量和粒徑的變化，分析植物肉的纖維結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)消化特性的相關(guān)性；同時，探究纖維化對蛋白消化特性的影響機制，為開發(fā)更接近豬肉蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的植物肉提供參考具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物肉（組織化大豆蛋白）和大豆分離蛋白（SPI）由山東萬得福實業(yè)集團有限公司提供。豬肉（豬大排），購于杭州永輝超市。唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶、過硫酸銨、L-絲氨酸和十二烷基硫酸鈉，Sigma 試劑公司。牛膽鹽，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。30% Acr-Bis，上海雙螺旋生物有限公司。低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（D530S），TakaRa 公司。

MS3000 型激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；NE910 型熒光正置顯微鏡，寧波永新光學(xué)股份有限公司；纖檢KDN-816 型定氮儀和HYP-320 型消化爐，上海纖檢儀器有限公司；TAXT Plus 型組織分析儀，英國Stable Micro Systems 公司；UV2100 型紫外-可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 制備植物肉 取約40 g 組織化大豆蛋白，使其完全浸泡在200 mL 蒸餾水中30 min，取出并瀝干表面水分，備用。

1.2.1.2 制備熟豬肉 參考Chiang 等[7]和林全全等[8]的方法，將豬大排裝進密封袋中，放入沸水浴中約5～7 min，煮至內(nèi)部溫度達75～80 ℃后取出，瀝干表面水分，冷卻至室溫，備用。

1.2.2 水分、pH 值、蛋白質(zhì)含量的測定 利用烘干法（GB/T 5009.3-2010）測定樣品中的水分含量。

參考林全全等[8]方法，采用高速剪切機以24 000 r/min 將質(zhì)量分數(shù)20%樣品與超純水混合1 min 后，用pH 計測定樣品pH 值。

稱取適量粉碎樣品，通過消化爐和定氮儀測定樣品中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 質(zhì)構(gòu)特性分析 參考林全全等[8]的方法，利用物性測定儀測定植物肉和豬肉的質(zhì)構(gòu)特性。具體方法如下：將1.5 cm×1.5 cm×1 cm 的樣品置于物性儀中央測試臺上；在TPA 模式下使用P50 探頭，測試速度為1 mm/s，下壓程度為50%，時間間隔為3 s，往復(fù)2 次。每個樣品最少測定12 次。

1.2.4 組織化度測定 參考林全全等[8]的方法，于物性儀測試臺中央放置1.5 cm×1.5 cm×1 cm 的樣品塊，用A/CKB 探頭對樣品進行剪切（剪切速度為1 mm/s，剪切程度為樣品厚度的75%），每個樣品均進行橫向和縱向剪切，每個樣品至少測定12次。

組織化度（kg/kg）=橫向剪切力（kg）/縱向剪切力（kg）

1.2.5 微觀結(jié)構(gòu)觀察 將復(fù)水后的樣品切成1 cm×1 cm×1 cm 的正方體，用OCT 包埋，用液氮速凍后經(jīng)冷凍切片機切成18 μm 厚度薄片，然后利用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.6 體外消化試驗 參考林全全等[8]和Brodkorb 等[9]的方法配制模擬消化液的儲備液，進行口腔-胃-小腸體外消化試驗。

1）口腔消化 將樣品置于粉碎機打碎，模擬口腔咀嚼。稱取一定量樣品于50 mL 三角瓶中，使各組樣品中蛋白質(zhì)含量均為（0.85±0.01）g，添加適量水至5 g。加入3.5 mL 模擬唾液（SSF）儲備液，加入25 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液和唾液淀粉酶（在最終口腔混合物中的活性為75 U/mL），補充適量蒸餾水至總體積為10 mL，調(diào)整pH 至7.0。置樣品于37 ℃搖床中100 r/min 振搖2 min。

2）胃消化 口腔消化完成后，將食團與8 mL模擬胃液（SGF）儲備液混勻，調(diào)整pH 值為3.0。加入5 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液和胃蛋白酶（最終胃混合物中活性為2 000 U/mL），補充蒸餾水至體積為20 mL，于37 ℃搖床中100 r/min 模擬胃消化2 h。

3）小腸消化 胃消化結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH 值至7.0 使胃蛋白酶失活。將消化物與11 mL 模擬小腸液（SIF）儲備液混合，加入40 μL 0.3 mol/L CaCl2、2.5 mL 0.16 mol/L 膽汁和5 mL 胰酶（最終小腸混合物中的活性為100 U/mL），補充蒸餾水至40 mL。樣品繼續(xù)在37 ℃搖床中100 r/min 模擬小腸消化2 h。結(jié)束后，將樣品放入沸水浴中5 min 使酶失活。

1.2.7 粒徑測定 模擬消化過程中，取適量各階段消化后產(chǎn)物，馬上用激光粒度儀測定其粒度大小和分布情況。

1.2.8 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 參考林全全等[8]和Tian 等[10]的方法，按體積比1∶1 混合消化產(chǎn)物與上樣緩沖液，用磁力攪拌器攪拌3 h，接著在超聲水浴和95 ℃水浴中各處理5 min。隨后以10 000 r/min 離心15 min。取上清液（10 μL）加到凝膠上，在恒壓125 V 下跑膠約4 h。本試驗采用12%分離膠和5%濃縮膠進行分析，考馬斯亮藍進行染色。

1.2.9 可溶性氮含量測定 按照質(zhì)量比1∶1 比例將打碎的未消化樣品與水混合攪拌60 min，以10 000 r/min 離心20 min，得到上清液。同時，將各階段消化產(chǎn)物以10 000 r/min 離心20 min，得到上清液。采用凱氏定氮儀測定各上清液中的可溶性氮含量。

1.2.10 游離氨基酸組成測定 參考林全全等[8]的方法，處理原始樣品和消化產(chǎn)物，并采用全自動氨基酸分析儀測定樣品的氨基酸組成。樣品平行測定2 次，結(jié)果采用平均值表示。

1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 除特殊說明外，所有試驗數(shù)據(jù)至少進行3 次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，用Excel 中單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)中的顯著性差異進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 基本成分和纖維結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 SPI、植物肉及豬肉的水分、蛋白質(zhì)含量和pH 值 SPI、植物肉以及豬肉的水分、pH 值及蛋白質(zhì)含量結(jié)果如表1 所示。其中，植物肉的水分含量最高，豬肉在煮制過程中，可能會損失掉一部分水分，故其水分低于一般生豬肉的水分含量（>70%）。3 種樣品的蛋白含量與水分含量直接相關(guān)，即水分越多，蛋白含量越低。植物肉和豬肉的pH值都接近中性，而SPI 的pH 值呈堿性，這可能與其制備工藝有關(guān)。

表1 樣品的水分、pH 值及蛋白質(zhì)含量Table 1 Moisture，pH value and protein content of samples

2.1.2 植物肉及豬肉的纖維結(jié)構(gòu) 通過測定質(zhì)構(gòu)特性、組織化度和微觀結(jié)構(gòu)來表征植物肉和豬肉的纖維化結(jié)構(gòu)。由表2 可知，豬肉的硬度和咀嚼性均大大高于植物肉，而彈性和內(nèi)聚性則是植物肉高于豬肉，這可能和植物肉的加工工藝有關(guān)。此外，兩者的回復(fù)性相近。

表2 植物肉和豬肉的質(zhì)構(gòu)特性Table 2 Textural characteristics of the plant-based meat and pork

組織化度是纖維結(jié)構(gòu)形成的指標(biāo)。由表3 可知，植物肉的橫向剪切力和縱向剪切力均顯著小于豬肉（P<0.05）；而兩者的組織化度沒有顯著性差異（P>0.05）。這表明盡管它們的組織化度較為接近，但切斷它們所需的橫、縱向力有明顯的強弱之分，即二者的纖維狀結(jié)構(gòu)存在很大差異。

表3 植物肉和豬肉的橫、縱向剪切力及組織化度Table 3 Crosswise strength，lengthwise strength，and degree of texturization of the plant-based meat and pork

由圖1 可以看出，植物肉和豬肉都具有網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)。其中，豬肉的纖維比較粗，纖維之間的連接較為稀疏，相比之下，植物肉的纖維較細，連接較為致密。

圖1 植物肉和豬肉的光學(xué)顯微圖Fig.1 Light micrographs of the plant-based meat and pork

綜上，盡管植物肉與豬肉的組織化度較為接近，但是它們的纖維在剪切力大小、纖維粗細、排列和分布特性方面具有明顯差異。由此推測，兩者纖維結(jié)構(gòu)的差異可能會影響它們在消化過程中與酶的接觸，從而影響它們的蛋白質(zhì)消化特性。

2.2 消化特性研究

2.2.1 粒徑大小與分布 植物肉和豬肉在消化過程中粒徑大小和分布變化分別如表4 和圖2 所示。SPI 的粒徑結(jié)果已經(jīng)顯示在本課題組前期的文章[8]中。可以看出，隨著消化的進行，植物肉、豬肉和SPI 的粒徑都呈減小的趨勢。在模擬口腔消化結(jié)束后，植物肉的粒徑明顯大于豬肉的粒徑。有研究表明，硬度越大的樣品，其粒徑越小[11]。植物肉的硬度小于豬肉，因此，經(jīng)模擬咀嚼后得到的食團粒徑大于豬肉。SPI 是粉末狀顆粒，能夠較好的溶于水，因此SPI 的口腔消化結(jié)束后的粒徑明顯小于植物肉和豬肉的粒徑。

表4 植物肉和豬肉消化過程中粒徑大小Table 4 Particle size of the plant-based meat and pork during digestion

圖2 消化過程中的粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of samples during digestion

在模擬胃消化120 min 后，三者的粒徑均有所減小，這表明樣品中的蛋白質(zhì)在胃蛋白酶的消化作用下開始被水解成氨基酸，導(dǎo)致粒徑變小。在胃中消化120 min 后，三者的粒徑大小排序與口腔消化結(jié)束時的一致。

在模擬小腸消化120 min 后，消化產(chǎn)物的粒徑進一步減小。此時豬肉的粒徑是最小的，SPI 次之，植物肉的最大；與胃消化結(jié)束后的樣品相比，植物肉的粒徑減小幅度最大。

上述結(jié)果表明，在胃和小腸消化過程中，植物肉由于硬度較小，在消化初期的粒徑較大，消化結(jié)束后，其粒徑也最大，提示其在口腔中分解較慢植物肉的粒徑消化結(jié)果與豬肉及SPI 的差別，主要與其組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.2.2 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變化 植物肉和豬肉消化過程中的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）圖譜如圖3 所示，SPI 的SDS-PAGE結(jié)果已經(jīng)發(fā)表在本課題組近期的文章[8]中。根據(jù)SDS-PAGE 圖譜，可以分析消化過程中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的變化情況。植物肉是SPI 加工制成的產(chǎn)品，在圖3a 的泳道1 中，可以觀察到大豆蛋白的β-伴大豆球蛋白（α、α′和β 3 種亞基）、酸性亞基和堿性亞基。在胃液中消化30 min 后，植物肉中的大分子條帶顏色變淺，小分子條帶顏色逐漸加深。盡管如此，在植物肉中仍然能觀察到β-伴大豆球蛋白、酸性和堿性亞基的存在。相比之下，SPI進入胃消化階段后未觀察到β-伴大豆球蛋白條帶，兩者之間的差異可能主要與纖維結(jié)構(gòu)是否存在有關(guān)。進入小腸段消化后，植物肉的大分子條帶消失，小分子條帶顏色也明顯變淺，說明此時無論是大分子蛋白亞基還是小分子的肽段被消化降解。在圖3b 中，可以觀察到豬肉在經(jīng)過胃消化30 min 后，分子質(zhì)量大的條帶（≥97.2 ku）的顏色變淺，同時出現(xiàn)分子質(zhì)量小于14.3 ku 的條帶。此后，所有條帶顏色雖逐漸變淺，但變化不大。這說明在胃部消化中，分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)被大量降解。在小腸段消化中，豬肉中的大分子條帶消失，小分子條帶顏色也明顯變淺。

圖3 樣品消化過程中SDS-PAGE 圖譜Fig.3 SDS-PAGE of samples during digestion

綜上，植物肉、豬肉以及SPI 的大分子蛋白質(zhì)在胃部消化中被降解為小分子肽段和氨基酸，其中植物肉的蛋白質(zhì)水解程度小于SPI。在小腸消化階段，三者的大分子肽段在消化前期均已消失，消化結(jié)束后，三者中均還殘留少量分子質(zhì)量小于14.3 ku 的肽段，說明蛋白質(zhì)沒有完全被水解成氨基酸。

2.2.3 可溶性氮含量變化 結(jié)合圖4 和先前的報道結(jié)果[8]，未消化樣品中植物肉的可溶性氮含量明顯小于豬肉，SPI 粉末最大。植物肉的可溶性氮含量低于SPI 粉末，這可能是由于植物肉中的大豆蛋白在擠壓過程中發(fā)生變性，溶解性降低，這與許多研究結(jié)果相一致[8，12-13]。進入胃消化階段后，蛋白質(zhì)在胃蛋白酶的作用下分解成多肽和氨基酸，三者的可溶性氮含量均大大增加，且它們的大小順序與未消化樣品相同。植物肉由于擠壓形成纖維結(jié)構(gòu)，纖維與纖維之間緊密連接，蛋白質(zhì)與酶的接觸減少，導(dǎo)致水解生成的可溶性氮最少。相比之下，豬肉在胃消化階段可溶性氮含量的增幅是最大的，說明豬肉在胃階段的消化情況比較好。由胃消化30 min 到胃消化120 min 階段中，可以看出SPI 和豬肉可溶性氮含量增長不是很明顯，這與SDS-PAGE 結(jié)果相對應(yīng)。到了小腸消化的階段，蛋白質(zhì)被胰酶分解，可溶性氮含量進一步增加。其中，豬肉的可溶性氮含量最高，植物肉與SPI 的可溶性氮含量相近。從胃階段進入小腸消化階段的過程中，與SPI 和豬肉相比，植物肉可溶性氮的增長較大，這說明植物肉在小腸階段的消化較快。

圖4 消化過程中植物肉及豬肉的可溶性氮含量Fig.4 Soluble nitrogen content of the plant-based meat and pork during digestion

2.2.4 游離氨基酸組成分析 表5 為樣品經(jīng)胃部和小腸消化120 min 后的游離氨基酸組成。結(jié)合先前的報道結(jié)果[8]，發(fā)現(xiàn)17 種主要游離氨基酸總量為：豬肉＞SPI＞植物肉，這與3 組樣品可溶性氮含量結(jié)果相似，說明豬肉蛋白的消化程度最高。植物肉消化生成的可溶性氮含量和游離氨基酸較SPI 的低，說明其纖維結(jié)構(gòu)及其它物質(zhì)（淀粉、油脂等）阻礙了蛋白的消化，這與先前的研究結(jié)果相一致[9]。

表5 樣品消化后游離氨基酸組成Table 5 The free amino acids of the digested samples

3 結(jié)論

從結(jié)構(gòu)上看，基于大豆蛋白的植物肉能在一定程度上模擬豬肉的纖維結(jié)構(gòu)，具有相近的組織化度。然而，兩者的質(zhì)構(gòu)特性和纖維結(jié)構(gòu)存在較大差異，如植物肉的硬度和咀嚼度均顯著低于豬肉，而彈性和內(nèi)聚性高于后者；與豬肉相比，植物肉的纖維比較細，纖維之間的連接較為致密。模擬消化結(jié)果表明，植物肉蛋白質(zhì)消化程度低于豬肉，這可能是由其纖維之間較為致密，且大豆蛋白的酶親和力較小有關(guān)；同時，與SPI 相比，植物肉中存在的纖維結(jié)構(gòu)和淀粉油脂等物質(zhì)也抑制了大豆蛋白的消化。

綜上，植物肉雖能一定程度模擬豬肉，但其結(jié)構(gòu)特性和蛋白質(zhì)消化程度與豬肉仍有較大差距，仍需不斷改進植物肉的制備工藝，提高植物肉的營養(yǎng)價值。