陳渝，夏曉夢

（中南大學湘雅二醫(yī)院，湖南長沙410011）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis， EMT）是一種以子宮腔外存在子宮內(nèi)膜（覆蓋子宮腔的黏膜）樣組織為特征的疾病[1]。其能夠引起慢性炎癥反應，導致盆腔內(nèi)或其他部位形成瘢痕樣組織[2]。最新研究統(tǒng)計，EMT 影響著全球大約10%的育齡女性[3]。該病為慢性疾病，常伴有嚴重的痛經(jīng)、性交痛、排便痛、排尿痛和慢性盆腔疼痛等臨床癥狀，嚴重降低了患者生活質(zhì)量[4]。EMT 的癥狀多樣、發(fā)病部位廣泛，很多患者對病情的認知也十分有限，往往在臨床癥狀出現(xiàn)較長時間后才做出診斷。目前，EMT 尚無有效的治愈方法，治療手段通常旨在去除病灶，控制癥狀[5]。因此，EMT 的早期診斷對疾病的后續(xù)治療非常關鍵。

診斷EMT 的金標準為探查性腹腔鏡，這是一種侵入性檢查方法[6]。因此，找到非侵入性或無創(chuàng)的診斷方法，實現(xiàn)EMT 的早期診斷非常必要。學者們逐漸認識到非編碼RNA 分子在人類健康和疾病病理生理過程中發(fā)揮關鍵作用。在這些非編碼RNA 中，MicroRNA（miRNA）是真核生物中廣泛存在的一種由21～23 個核苷酸組成的RNA 分子，可調(diào)節(jié)其他基因表達[7]。miRNA 從DNA 轉(zhuǎn)錄而來，但無法進一步翻譯成蛋白質(zhì)。miRNA 通過與目標mRNA 結(jié)合，進而抑制轉(zhuǎn)錄后的基因表達，在調(diào)控基因表達和細胞周期方面起著重要作用。miRNA被認為是一種廣泛的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)分子[8]。每個單獨的miRNA 分子都可能影響細胞途徑中的多種mRNA靶點，目前已經(jīng)有超過2 600 個成熟的miRNA 被研究[9]。大多數(shù)細胞和體液中都發(fā)現(xiàn)了miRNA，其具有意想不到的高穩(wěn)定性。健康人群與患者循環(huán)中的miRNA 表達譜有明顯差異。在各種疾病如腫瘤、炎癥、心血管疾病、代謝和生殖系統(tǒng)疾病中，都觀察到特定的miRNA 表達水平差異[10]。目前，miRNA 被提議作為臨床診斷工具，用于識別和監(jiān)測各種惡性腫瘤，并有可能為其他疾病提供無創(chuàng)診斷。在女性生殖系統(tǒng)疾病中，如婦科惡性腫瘤（如宮頸癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌）、妊娠期相關疾?。ㄈ缦日鬃影B、早產(chǎn)等）、子宮肌瘤及EMT，都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了miRNA 表達失調(diào)[11-13]。

1 早期診斷EMT的困境

根據(jù)病變部位的不同，EMT 主要分為4 種病理類型：淺表型、卵巢型、深部浸潤型及其他部位EMT，其臨床癥狀多種多樣，且隨著病灶對盆腔、卵巢、輸卵管或子宮的作用還會導致不孕。此外，子宮內(nèi)膜異位病變的程度與癥狀的嚴重性或持續(xù)時間幾乎沒有相關性。一些病灶明顯的患者，癥狀反而較輕；而病灶很小的患者，卻可能出現(xiàn)嚴重癥狀[14]。通常EMT 引起的疼痛會在絕經(jīng)后得到改善，但在某些情況下，慢性疼痛在絕經(jīng)后仍長時間持續(xù)存在。對患者和醫(yī)生來說，EMT 最大的挑戰(zhàn)之一是早期診斷。據(jù)報道，EMT 確診時間一般延遲6～12年[15]，這種延遲是由社會和臨床因素造成的。例如，患者即使出現(xiàn)EMT 的癥狀，考慮到隱私問題，往往推遲就醫(yī)。目前25%～50%不孕癥由EMT 引起[16]，一些女性盡管已經(jīng)有多年的慢性盆腔疼痛和不適，但是只有在妊娠失敗時，才首次確診為EMT。因為EMT 的癥狀可能是非特異性，可以與其他盆腔疾病重疊，對臨床醫(yī)生鑒別診斷經(jīng)驗要求更高。值得注意的是，由于臨床專業(yè)知識，以及適合篩查、簡便的無創(chuàng)性診斷方法缺乏，在貧困及醫(yī)療條件較差的地區(qū)，EMT 的診斷時間往往會更長。

在腹腔鏡檢查明確診斷前，臨床醫(yī)生會根據(jù)患者癥狀進行經(jīng)驗性治療。EMT 的一線藥物包括非甾體抗炎藥，口服避孕藥、地諾孕素、促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone agonist， GnRH-a）[17]。然而，這些藥物都不能根除EMT，服藥期間還會產(chǎn)生一定的副作用。當治療停止后，EMT 相關癥狀還會重現(xiàn)，即使進行手術，EMT 復發(fā)也很常見，50%患者在5年后需要再次手術[18]。

2 miRNA在EMT中的生物學作用

miRNA 可以通過抑制翻譯或刺激mRNA 降解來下調(diào)基因表達。在某些情況下，miRNA 還可以上調(diào)靶基因的表達。miRNA 影響從發(fā)育到致癌的多種細胞途徑。miRNA 參與多種人類疾病，使其成為潛在的診斷和預后生物標志物。與腫瘤轉(zhuǎn)移類似，異位子宮內(nèi)膜具有黏附、增殖及浸潤細胞外基質(zhì)的能力。EMT 是一種多因素和多基因疾病，其病理機制涉及血管生成和蛋白水解，miRNA 表達失調(diào)可能與這些過程有關。在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞（endometrial stromal cell， ESC）和上皮細胞中，LOGAN 等[19]發(fā)現(xiàn)與正常樣本比較，異位ESC 和上皮細胞有9 個和16 個差異表達的miRNA。有研究發(fā)現(xiàn)，與EMT 有關的mRNA 靶點是血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A， VEGFA），其受5 種miRNA 的調(diào)節(jié)。這些信號蛋白能夠刺激血管生成，并參與EMT 病灶的血管生成[20]。不同部位病灶中VEGF-A 表達水平有區(qū)別，腹膜和直腸陰道結(jié)節(jié)中表達水平比卵巢高，表明前者血管生成更為活躍。VEGF 受體拮抗劑和其他抗血管生成藥物是治療EMT 的藥物[21]。動物模型證明，抗血管生成藥物可抑制異位內(nèi)膜的生長，減少或縮小異位病灶的數(shù)量和體積?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）也被證實為EMT 相關的miRNA 靶點，而且組織金屬蛋白酶抑制劑也受miRNA 的調(diào)節(jié)[22]。這些蛋白水解酶降解細胞外基質(zhì)，有助于組織重塑和異位內(nèi)膜侵入腹膜。對分離培養(yǎng)的ESC 進行mRNA 的表達分析，發(fā)現(xiàn)在EMT 患者中有幾個相同的mRNA 靶點被改變，即ZEB1、MMP-7 和TGF-β1[19]，后者參與了EMT 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）過程?？傊?，細胞增殖、血管生成、細胞外基質(zhì)重塑、炎癥信號傳導及激素調(diào)節(jié)等過程在EMT 失調(diào)的miRNA 功能研究中均有涉及。

3 子宮內(nèi)膜組織中的miRNA表達差異

miRNA 的全局分析方法可以用來比較組織間所有miRNA 的表達。EMT 中最常見的是比較同一患者的在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜miRNA 的表達差異，但也有研究將異位內(nèi)膜與健康人群子宮內(nèi)膜進行對照分析。通常通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRTPCR）等技術確認候選miRNA 的表達差異，不過即使miRNA 表達差異微小也可能產(chǎn)生不同的生物學的效應。WEI 等[23]對2007年—2013年發(fā)表的12 項miRNA 表達譜研究進行了薈萃分析，發(fā)現(xiàn)了134 個不同調(diào)控功能的miRNA。雖然個例通常只說明實驗中的一組上調(diào)或下調(diào)的miRNA，但在多個研究中發(fā)現(xiàn)的miRNA 分子的數(shù)量正在增加，并逐步形成miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡。miRNA 在EMT 中的表達研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜活檢樣本中miR-200b 的關注度最高[24]。其他有關miR-200 家族的研究也表明，miR-200 在EMT 發(fā)病機制中起著關鍵調(diào)控作用[25]。還有一些研究報道m(xù)iRNA 在子宮內(nèi)膜病灶中上調(diào)或下調(diào)，如miR-1、miR-29c、miR-34c、 miR-100、 miR-141、 miR-145、 miR-183、 miR-196b、 miR-200a、 miR-200b、 miR-200c、 miR-202、 miR-365 和miR-375[26]。 ZHAO等[27]通過高通量測序技術在8 例EMT 患者中確定了異位子宮內(nèi)膜與在位子宮內(nèi)膜中miRNA 的差異，鑒定出107 個差異表達的miRNA 和6 112 個差異表達的mRNA，并確定了一些參與EMT 發(fā)病的關鍵miRNA。RAJA 等[28]總結(jié)發(fā)現(xiàn)，EMT 病灶中一系列功能失調(diào)的miRNA-126、miRNA-210、miRNA-21、miRNA-199a-5p 和miRNA-20A 參與了血管生成、細胞增殖、細胞黏附和侵襲，以及EMT 過程。

為了探究miRNA 調(diào)控細胞的機制，研究者使用生物信息學工具識別每個miRNA 序列的靶標，并將這些目標基因的功能映射到細胞途徑中[23，29]。WEI 等[23]使用4 種miRNA 靶點預測工具（TargetScan、PicTar、miRanda 和miRDB），對幾項研究中一致發(fā)現(xiàn)的miRNA 進行預測，然后通過GeneCodis 網(wǎng)絡工具預測這些基因參與的生物過程和途徑。該研究分析出9 882 個有關的miRNA 靶基因，通過KEGG和Panther 路徑富集分析，得出了主要的EMT 相關路徑、內(nèi)吞作用、Wnt 信號通路和血管生成靶基因[23]。QI 等[29]用Ingenuity Pathway Analysis 和Gene Ontology 等生物信息學軟件分析了EMT 中差異表達的miRNA，共鑒定了17 個顯著差異表達的miRNA和4 343 個參與EMT 的潛在miRNA。這些生物信息學分析為細胞培養(yǎng)的功能研究的實驗設計提供信息，并能幫助EMT 患者確定新的治療方法。

4 循環(huán)miRNA譜系研究

細胞外miRNA 可以從大多數(shù)體液中分離出來。miRNA 參與體內(nèi)細胞與組織的壓力信號傳遞和交流。細胞外miRNA 要么被動釋放，要么通過外泌體或微囊泡主動從細胞中分泌出來，并與脂蛋白或RNA 結(jié)合蛋白結(jié)合。這些脂質(zhì)和蛋白質(zhì)復合物可以保護miRNA 不被內(nèi)源性RNAs 降解[30]。循環(huán)miRNA 可能介導異位內(nèi)膜的基因表達改變，也可能通過介導異位內(nèi)膜與周圍組織的交流來影響EMT 的發(fā)展。最新研究顯示，循環(huán)miRNA，如Let-7 家族的miRNA，與EMT 的炎癥信號改變之間存在關聯(lián)[31-32]。為進一步探索EMT 中循環(huán)miRNA 潛在的作用，迄今已報道6 項有關EMT 患者與不同對照組的血液樣本全局基因表達譜分析結(jié)果；其中3 項研究采用血清miRNA 微陣列，2 項研究采用血漿miRNA 微陣列，另外1 項采用深度測序方法檢測血清miRNA 的差異表達[33]。除了分析來自不同血清與血漿的miRNA，miRNA 表達檢測在實驗設計上有巨大差異，使這些研究結(jié)果的比較變得復雜。這些差異包括miRNA 分析方法、受試者遺傳背景、EMT 所處的臨床階段、EMT 病理類型，以及對照組的設置。由于miRNA 在細胞中有許多靶點，而一個特定的mRNA 轉(zhuǎn)錄會受到各種miRNA 的調(diào)控，同一途徑可能受到不同的miRNA 的調(diào)控，所以沒有檢測到一個特定的分子并不排除其參與EMT 的進展。Solexa測序技術研究報告失調(diào)miRNA有108個候選miRNA，不過這些結(jié)果與其他報告的血清結(jié)果有大量重疊[34]。也有研究對EMT 患者腹腔液中的miRNA、細胞因子及其他蛋白質(zhì)進行分析，確定了126 個不同表達的miRNA，其中6 個通過qRTPCR 驗證?？绐毩?shù)據(jù)集的表達水平變化的交叉驗證結(jié)果表明，這6 個miRNA 與EMT 關系密切[35]。因此推測，這些在血液和子宮內(nèi)膜組織中表達改變的miRNA 有可能作為早期診斷EMT 的生物標志物。

5 循環(huán)miRNA可作為潛在的早期診斷EMT的生物標志物

研究發(fā)現(xiàn)有5 個miRNA 經(jīng)過多次篩選被確定有異常表達，體外實驗也證明了其在EMT 中的作用[33-35]。目前，miR-125b、miR-451 和Let-7 家族被認為最適合作為EMT 潛在的循環(huán)生物標志物，而miR-199a 和miR-145 也有作為早期診斷EMT 的生物標志物的潛力。

5.1 miR-125b

在EMT 中，miRNA 的一個主要功能是參與炎癥反應。Let-7b 和miR-125b 均能調(diào)節(jié)炎癥細胞因子信號，影響TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達水平，這些因子在EMT 患者血液中明顯增加。一項前瞻性研究結(jié)果顯示，IL-1β 升高與EMT 患病風險增加有關；IL-6 在EMT 相關的巨噬細胞中高度表達，影響了EMT 進展時的細胞遷移。伴隨著Let-7 與miRNA-125b 在炎癥信號傳導中的互補作用，這些miRNA 也因其在21 號染色體長臂（21q21.1）上的基因組位置而聚在一起[36]。Let-7、miR-125b 及miR-200 都參與了癌癥進展，其中miR-125b 可以調(diào)控細胞凋亡和增殖。MOUSTAFA 等[37]使用miRNA 測試板作為檢測EMT 的非侵入性診斷方法，發(fā)現(xiàn)miR-125b 在EMT 受試者血清中表達水平顯著升高。據(jù)報道，在GnRH-a（醋酸亮丙瑞林）治療后，EMT 中miR-125b 轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變，表明其有可能成為監(jiān)測療效的生物標志物[38]。

5.2 miR-145

CHENG 等[39]選擇47 例EMT 患者，miR-145 的表達水平高于對照，并且在非妊娠患者子宮內(nèi)膜組織中的表達水平顯著高于妊娠患者，其研究表明miR-145 表達上調(diào)可能在EMT 不孕癥患者中發(fā)揮重要作用。YANG 等[40]報道與在位內(nèi)膜比較，同一患者的異位內(nèi)膜miR-145-5p 表達水平更高，該過程伴隨VEGF-A 上調(diào)和EGFR2、PTEN 和CXCR4 水平下降。有研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ/Ⅱ期EMT 患者的miR-145水平明顯高于Ⅲ/Ⅳ期。陶中娥等[41]通過對122 例EMT 合并不孕患者的研究發(fā)現(xiàn)，術前miR-145 表達水平對術后妊娠結(jié)局有一定的臨床預測價值。BASHTI 等[42]收集了55 例EMT 患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-145 在Ⅰ/Ⅱ期EMT 患者中過度表達。

5.3 Let-7家族

Let-7 是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類miRNA。Let-7 家族的miRNA 由8 個相關序列（Let7a-i）組成，已知其參與人類和其他動物的早期發(fā)育事件。Let-7 調(diào)控細胞分化的許多基本過程，并能抑制細胞的重新編程。由于對Ras 家族致癌基因的負向調(diào)控，其被歸類為腫瘤抑制因子，許多惡性腫瘤中都出現(xiàn)let-7 miRNA 家族表達下調(diào)。最近在EMT 患者中觀察到KRAS 的激活，并與EMT 發(fā)病和孕酮抵抗有關[31]。黃俊花等[43]分析文獻后也發(fā)現(xiàn)EMT 患者血清Let-7表達降低可作為臨床診斷標志物。從切除的EMT樣本中獲取總RNA，分析發(fā)現(xiàn)EMT 患者與正常對照組的Let-7 表達存在顯著差異，表明Let-7 具有最佳的參數(shù)（敏感性、特異性、陽性和陰性結(jié)果的預測值），可用于EMT 的早期診斷[44]。

5.4 miR-199a

與miR-145 相似，miR-199a 過度表達降低了ESC 的黏附性、遷移性和侵襲性。目前學術界提出了一種機制，即在EMT 組織中下調(diào)這種miRNA，通過抑制PAK4、IKK/NF-κB 途徑和下調(diào)IL-8 來減弱細胞侵襲性。ZHU 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a 在人子宮內(nèi)膜異位囊腫基質(zhì)細胞中的表達減弱，進一步使用Transwell 實驗、體外傷口愈合試驗評估轉(zhuǎn)染miR-199a 對ESC 遷移、侵襲和收縮性的影響，結(jié)果表明miR-199a 通過抑制PAK4 mRNA 表達來抑制ESC 的遷移和侵襲，miR-199a 可能在EMT 中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[45]。也有學者發(fā)現(xiàn)，在來自卵巢的en-MSCs 中加入合成類固醇激素時，miR-199a表達上調(diào)，表明miR-199a 的作用與達那唑藥物相似，即破壞雌激素的信號傳導并抑制EMT 進程；進一步研究顯示，在缺氧條件下，miR-199a 能抑制ESC 中VEGF-A 和缺氧誘導因子1α，并減少血管生成[35]。在另一份報告中也發(fā)現(xiàn)，中、重度EMT患者血清miR-199a 表達水平高于輕癥患者。袁琳等[46]研究發(fā)現(xiàn)EMT 患者血清miR-199a 表達顯著升高，提示miR-199a 具有成為診斷EMT 生物標志物的潛力。

5.5 miR-451

WANG 等[47]采用qRT-PCR 檢測EMT 和不孕癥患者血清、組織和細胞系中miR-451 和巨噬細胞抑制因子（macrophage migration inhibitory factor， MIF）表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康人群相比，EMT 合并不孕癥患者組織和細胞系中miR-451 異常低，而MIF異常高；miR-451 表達水平與EMT 患者并發(fā)不孕癥呈負相關。LI 等[48]通過抑制miR-451 治療EMT 小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-451a 抑制劑可減少EMT 病變大小，表明miR-451 抑制劑進行全身治療是一種很有前景的治療方法。采用小鼠進行研究后發(fā)現(xiàn)miR-451 下調(diào)是通過抑制Wnt 信號通路來實現(xiàn)的，表明miR-451 在輔助生殖治療中可作為判斷卵母細胞和胚胎質(zhì)量的新型生物標志物[48]。GAO 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，EMT 患者miR-451 表達水平低于健康對照組，并且miR-451 可誘導細胞凋亡并抑制細胞增殖。石瑾秋等[50]選取54 例EMT 患者，采用qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)EMT 患者血漿miR-451 水平減低，miR-451 可能通過抑制異位內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖和遷移發(fā)揮作用。

6 小結(jié)與展望

miRNA 成為EMT 循環(huán)生物標志物需要符合以下標準：①在體液（血液、唾液等）中表達穩(wěn)定且具有十分明顯的表達差異；②存在于EMT 的不同亞型，并且參與支撐該病所有臨床表現(xiàn)的共同過程；③不受一天中取樣時間或月經(jīng)周期階段性的影響；④在不同種族背景的女性中表現(xiàn)出一致的表達模式。因此，建立這些循環(huán)生物標志物的有效性仍舊需要從大量患者群體中獲得可重復的結(jié)果，并盡可能了解其表達與EMT 進展的關系；同時開展縱向的臨床研究，進一步分析哪些miRNA 與EMT病情進展程度最相符，哪些與療效或復發(fā)明確相關。因此，通過對與EMT 病理生理相關的miRNA進行研究，找到合適的生物標志物作為早期診斷、預測療效的工具，以指導治療仍是臨床醫(yī)生未來努力的方向。