戴希爽，張 忠，畢 陽，William Oyom，張志鵬，謝鵬東

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

番茄（Solanum lycopersicum）是茄科番茄屬的一年生或多年生草本植物，在我國各地廣泛栽培[1]。番茄果實營養(yǎng)豐富，風味獨特，既可鮮食又可用于精深加工。番茄作為呼吸躍變型果實，常溫下采后生理品質(zhì)變化迅速，極易遭受采后病原真菌侵染[2]。其中由粉紅單端孢菌（Trichothecium roseumPers. Link）侵染而引起的番茄紅粉病，主要危害著色后的番茄果實，貯藏期間會造成大量腐爛[3]。目前防治番茄病害最普遍的方法是化學殺菌，但化學藥劑頻繁使用，不僅會導致病原菌產(chǎn)生耐藥性，也不利于食品安全，亟需探索更安全有效可行的替代防治手段[4-5]。

多種植物源揮發(fā)性有機化合物不僅可有效抑菌，還能誘導增強果蔬抗病性[6]。大多數(shù)植物精油作為“一般公認安全”的物質(zhì)，因其環(huán)境友好性和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點而成為化學殺菌劑潛在的替代物[7]。孜然精油的主要活性成分枯茗醛（cuminal，CA）具有較廣譜的抑菌活性和較強的抗氧化活性[8]，但由于疏水性限制了其在果蔬防腐保鮮中的應(yīng)用。植物膠通常能在水中形成凝膠或穩(wěn)定的乳液體系，具有較好的膠凝性、乳化性、熱穩(wěn)定性和成膜性，常作為天然涂層應(yīng)用于果蔬防腐保鮮[9]。沙棗膠是沙棗樹（Elaeagnus angustifoliaL.）莖枝中滲出的雜多糖聚合物，主要由阿拉伯糖、半乳糖、糖醛酸、鼠李糖及甘露糖等組成，相對分子質(zhì)量約為2×105，其理化性質(zhì)與阿拉伯膠、黃芩膠及桃膠等植物膠相似[10]。近年來關(guān)于果蔬涂膜的報道較多，如阿拉伯膠涂膜番茄[11]、番石榴[12]、草莓[13]和藍莓[14]、桃膠涂膜番茄[15]以及黃芩膠涂膜杏果[16]等，均可有效增強果實抵御病原菌侵染的能力，抑制果實腐爛從而延長采后貯藏期[17]。然而關(guān)于沙棗膠與CA復(fù)合涂膜在果蔬采后病害控制及防腐中的應(yīng)用研究尚鮮見報道。

本研究以沙棗膠與CA為原料制備復(fù)合膜液，通過浸漬法對番茄果實表面進行涂膜，探究復(fù)合涂膜對番茄采后紅粉病的抑制作用及其對果實抗性的影響，以期為番茄采后病害控制及防腐提供方法參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料：‘千禧’櫻桃番茄采自甘肅永靖縣劉家峽番茄種植園區(qū)，果實飽滿處于成熟期，顏色、大小基本一致，無機械損傷和病蟲害，于當天運回實驗室；沙棗膠采自新疆和田沙棗樹造林區(qū)，自然干燥后備用。供試菌株T. roseum菌種取自甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院采后生物學實驗室，從典型發(fā)病的番茄果實組織處分離，經(jīng)培養(yǎng)純化后于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基中保存待用。

CA、L-苯丙氨酸、4-香豆酸 上海麥克林生化科技有限公司；聚乙二醇-6000、愈創(chuàng)木酚、β-巰基乙醇、Triton X-100、鄰苯二酚、福林酚 北京索萊寶科技有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-2450型紫外-可見光分光光度計 日本島津醫(yī)療器械有限公司；H-1850R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀檢測設(shè)備有限公司；1510型酶標儀 賽默飛世爾儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸浮液的制備

菌種活化及孢懸液制備參照Ge Yonghong等[18]稍作修改。T. roseum菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，加無菌水洗脫孢子，經(jīng)4 層紗布過濾，調(diào)整孢懸液孢子濃度至1×106個/mL備用。

1.3.2 CA的體外抑菌活性測定

菌絲生長抑制參考Xu Dan等[19]的方法稍作修改。將15～20 mL PDA培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后在中心接種孢懸液，25 ℃培養(yǎng)24 h，分別將吸有0.625、1.25、2.5、5 μL CA的濾紙圓片（d＝8 mm）貼于皿蓋中央，使其在培養(yǎng)皿內(nèi)頂空濃度（通過頂空體積大小確定）分別為0.012 5、0.025、0.05、0.1 μL/mL，無菌水作對照，25 ℃倒置培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測定第3、5、7天的菌落直徑。按公式（1）計算菌絲生長抑制率。

孢子萌發(fā)抑制參考Wei Meilin等[20]的方法稍作修改。制取直徑9 mm的PDA培養(yǎng)基圓餅置于滅菌載玻片上，接種孢懸液，將吸有0.625、1.25、2.5、5 μL CA的濾紙圓片（d＝8 mm）置于皿蓋中央，無菌水作對照，25 ℃孵育后鏡檢統(tǒng)計孢子萌發(fā)情況，當對照組孢子萌發(fā)達到80%以上時開始計數(shù)。每次鏡檢200個真菌孢子。按公式（2）計算孢子萌發(fā)抑制率。

1.3.3 復(fù)合涂膜溶液的制備

將沙棗膠揀除可見雜質(zhì)，參考阿吉艾克拜爾·艾薩等[21]的方法，粉碎過篩（100 目）得到沙棗膠粉末備用。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，制備3 組涂膜液：M1組：僅沙棗膠（OG）；M2組：OG+0.1%（體積分數(shù)，下同）CA；M3組：OG+0.2% CA。具體制備方法如下：取3 g的沙棗膠粉末溶解于100 mL蒸餾水并在45 ℃下磁力攪拌1 h，制得質(zhì)量濃度30 mg/mL的沙棗膠膜基液。添加1.5 mL甘油作為增塑劑，然后在45 ℃下攪拌均勻并冷卻至室溫，即得到M1組。在M1組基礎(chǔ)上加入0.1 mL CA（添加少量Tween-80作為乳化劑協(xié)助分散溶解），45 ℃下攪拌均勻后冷卻至室溫，即得到M2組。M3組涂膜液制備步驟同M2組，但CA添加量為0.2 mL，其余參數(shù)不變。

1.3.4 涂膜和接種

取新鮮番茄果實用蒸餾水洗凈，放入體積分數(shù)為1%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，撈出后自然晾干。每組50個果實，分別用M1、M2、M3組涂膜液處理，對照組為無菌水處理。各組果實均浸漬約30 s后，膜液完全覆蓋果實表面，完成涂膜。待果實自然風干后在其中軸線赤道部位對稱打2個孔（直徑2 mm、深3 mm），接種5 μL的T. roseum孢懸液，靜置使孢子穩(wěn)定附著。用塑料保鮮盒密封于相對濕度90%～95%的室溫（25±1）℃環(huán)境下貯藏。

1.3.5 病斑直徑和發(fā)病率的測定

依次在貯藏第1、3、5、7、9天利用十字交叉法測量病斑直徑并記錄發(fā)病果實孔數(shù)。病斑直徑≥2 mm且孔內(nèi)可見菌體記為發(fā)病孔數(shù)[22]，并按照公式（3）計算果實接種發(fā)病率。

1.3.6 抗氧化指標測定

依次在貯藏第0、1、3、5、7、9天取病健交界組織處（病斑周圍1.5 mm處）的果肉進行各項抗性指標的測定[23]。

1.3.6.1 抗性物質(zhì)含量測定

過氧化氫（H2O2）含量采用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定，H2O2含量單位μmol/gmw?？偡雍亢皖慄S酮含量測定參考Li Zhicheng等[24]的方法，分別測定反應(yīng)體系在波長760 nm和510 nm處的吸光度。用沒食子酸標準曲線計算總酚含量（單位為mg/100 gmw），用兒茶素標準曲線計算類黃酮含量（單位為mg/100 gmw）。

1.3.6.2 抗性酶活力測定

過氧化物酶（peroxldase，POD）活力測定參考曹建康等[25]的方法。以每克果實組織（鮮質(zhì)量）吸光度每分鐘增加1為1個POD活力單位，POD活力以ΔOD470nm/（min·gmw）表示。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）活力和4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate:coenzyme A ligase，4CL）活力測定方法分別參照Han Cong[26]和Takshak[27]等的方法并稍作調(diào)整，分別測定其反應(yīng)體系在波長290 nm和340 nm處的吸光度，以每克果實組織（鮮質(zhì)量）吸光度每小時變化0.01為1個酶活力單位U，結(jié)果以U/gmw表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

上述實驗均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016軟件計算，表示為平均值±標準差，并用SPSS 20.0軟件進行Duncan’s多重差異顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著），采用Origin 2018 Lab軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CA的體外抑菌活性

CA可明顯抑制離體T. roseum的菌落生長。在0.012 5～0.1 μL/mL頂空濃度范圍內(nèi)，濃度越高，抑制效果越明顯。與對照組相比，0.1 μL/mL CA處理的T. roseum菌落生長最為緩慢（圖1A）。在培養(yǎng)第7天，0.0125、0.025、0.05、0.1 μL/mL CA處理的T. roseum菌絲生長抑制率分別為15.3%、35.7%、47.5%、72.9%（圖1B）。CA可有效抑制T. roseum孢子萌發(fā)，其抑制效果呈濃度劑量效應(yīng)（圖1C）。培養(yǎng)至第9小時，不同濃度CA處理的T. roseum孢子萌發(fā)抑制率分別達到38.5%、64.5%、76.3%、83.0%。表明CA對T. roseum生長具有較強的體外抑制活性。

圖1 不同濃度枯茗醛處理對粉紅單端孢菌落形態(tài)（A）、菌絲生長抑制率（B）和孢子萌發(fā)抑制率（C）的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of cuminal on the colony morphology (A), mycelial growth (B) and spore germination (C) of T. roseum in vitro

2.2 復(fù)合涂膜對接種番茄紅粉病的抑制作用

涂膜組番茄果實的病斑面積均不同程度小于對照組（圖2A）。果實經(jīng)損傷接種T. roseum后，病斑直徑隨貯藏時間延長而擴大（圖2B）。OG+0.1% CA、OG+0.2% CA復(fù)合涂膜組果實的病斑直徑均顯著低于對照組（P＜0.05），9 d后分別為對照組的51.9%、36.7%。貯藏期間果實發(fā)病率也逐漸上升（圖2C）。OG+0.1% CA、OG+0.2% CA復(fù)合涂膜組果實的發(fā)病率均顯著低于對照組（P＜0.05），9 d后分別為對照組的76.7%、69.2%。結(jié)果表明，沙棗膠與CA復(fù)合涂膜明顯抑制了番茄紅粉病的發(fā)生與發(fā)展。

圖2 復(fù)合涂膜對番茄損傷接種粉紅單端孢后病情發(fā)展（A）、病斑直徑（B）及發(fā)病率（C）的影響Fig. 2 Effect of composite coating on disease development (A), lesion diameter (B) and disease incidence (C) in tomato fruit inoculated with T. roseum

2.3 復(fù)合涂膜對果實抗性的影響

2.3.1 H2O2含量

H2O2是活性氧的典型代表，參與果蔬抗病性、抗逆性啟動和誘導過程。從整體上看，H2O2含量呈先升后降再升的變化趨勢（圖3）。貯藏前期0～5 d內(nèi)，OG+0.2% CA復(fù)合涂膜組果實的H2O2含量顯著高于對照組（P＜0.05），且在第3天達到峰值。貯藏5 d后，番茄果實后熟逐漸開始腐爛，體內(nèi)H2O2過量積累，涂膜組果實的H2O2含量顯著低于對照組（P＜0.05）。表明沙棗膠與CA復(fù)合涂膜促進了果實貯藏前期H2O2含量快速產(chǎn)生，貯藏后期又抑制了H2O2過量積累，減緩過氧化對果實產(chǎn)生的傷害。

圖3 復(fù)合涂膜對番茄損傷接種后果實中H2O2含量的影響Fig. 3 Effect of composite coating on the content of H2O2 in inoculated tomato fruit

2.3.2 總酚和類黃酮含量

果蔬中總酚和類黃酮等次級代謝產(chǎn)物與體內(nèi)抗性密切相關(guān)。對照組和涂膜組果實中總酚含量變化趨勢基本一致，可能是因酚類物質(zhì)貯藏期間容易氧化還原，在貯藏前期稍有下降后便逐漸上升，且在第7、9天達到峰值（圖4A）。復(fù)合涂膜組果實的總酚含量在貯藏第7天之前顯著高于對照組（P＜0.05）。OG+0.2% CA復(fù)合涂膜組果實的總酚含量（高出對照14.7%）在第7天到達峰值，比OG+0.1% CA復(fù)合涂膜組果實總酚含量峰值（高出對照組5.5%）提早了2 d，但在貯藏末期稍有下降。各組果實中類黃酮含量隨貯藏時間延長先上升后下降（圖4B）。OG+0.2% CA復(fù)合涂膜組果實的類黃酮含量在貯藏前期0～3 d內(nèi)上升較快且顯著高于對照組（P＜0.05），在第3天到達峰值，高出對照組48.1%，而其余組在第5天才達到峰值并趨于平穩(wěn)。表明沙棗膠與CA復(fù)合涂膜促進了番茄果實中總酚和類黃酮的積累。

圖4 復(fù)合涂膜對番茄損傷接種后果實中總酚（A）和類黃酮（B）含量的影響Fig. 4 Effect of composite coating on the contents of total phenols (A)and flavonoids (B) in inoculated tomato fruit

2.3.3 POD活力

POD作為重要的抗氧化酶之一，與植物體內(nèi)活性氧清除及抗病性密切相關(guān)。貯藏期間，果實中POD活力整體呈先升后降的趨勢（圖5）。復(fù)合涂膜組果實的POD活力在貯藏前期逐漸上升且始終高于對照組（P＜0.05）。OG+0.1% CA復(fù)合涂膜組果實的POD活力（高出對照組34.9%）在第5天到達峰值，比OG+0.2% CA復(fù)合涂膜組果實POD活力峰值（高出對照45.5%）提前了2 d。而對照組和OG組果實的POD活力變化平穩(wěn)，在第3、7天均有峰值出現(xiàn)。表明沙棗膠與CA復(fù)合涂膜提高了番茄果實貯藏期間POD活力。

圖5 復(fù)合涂膜對番茄損傷接種后果實中POD活力的影響Fig. 5 Effect of composite coating on the activity of POD in inoculated tomato fruit

2.3.4 PAL和4CL活力

PAL和4CL是苯丙烷代謝途徑中重要的關(guān)鍵酶和限速酶，與果蔬抗病性密切相關(guān)。貯藏期間，對照組和涂膜組果實中PAL活力變化趨勢基本一致，總體先升后降（圖6A）。復(fù)合涂膜組果實PAL活力在貯藏第5天顯著高于OG涂膜組和對照組（P＜0.05）。對照組、OG組、OG+0.1% CA組PAL活力在第3天達到高峰，之后不斷下降，而OG+0.2% CA組在第5天才達到峰值，上升幅度最高，高出對照組31.6%，高出OG組25.3%。各組果實中4CL活力整體表現(xiàn)為先升后降（圖6B）。對照組與OG組4CL活力變化差異不明顯，而OG+0.2% CA復(fù)合涂膜組4CL活力始終顯著高于對照組（P＜0.05），在第7天達到峰值，高出對照組13.3%，高出OG組12.3%。表明沙棗膠與CA復(fù)合涂膜提高了番茄果實貯藏期間PAL活力和4CL活力。

圖6 復(fù)合涂膜對番茄損傷接種后果實中PAL（A）和4CL（B）活力的影響Fig. 6 Effect of composite coating on the activity of PAL (A) and 4CL (B)in inoculated tomato fruit

3 討 論

CA可顯著抑制T. roseum的菌絲生長以及孢子萌發(fā)，此外，能有效抑制花生等農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉的生長和產(chǎn)毒[19]，降低鏈格孢對采后果蔬的侵染活力[28]。孜然精油的主要活性成分CA對病原菌的抑菌機制通常與抑制孢子萌發(fā)、破壞病原菌細胞膜、誘導胞內(nèi)活性氧爆發(fā)以及線粒體功能紊亂等引起細胞凋亡有關(guān)[8]。精油的抑菌活性一般是通過其主要活性成分的作用來實現(xiàn)的，如肉桂精油中的活性成分肉桂醛可抑制由灰葡萄孢侵染引起的番茄灰霉病[29]和由擴展青霉侵染引起的番茄果腐病[30]，香草精油中的活性成分香蘭素可抑制由鏈格孢侵染引起的番茄黑腐病[31]。精油對多種果蔬采后病害有顯著的抑制效果，甚至在一定濃度時能完全抑制果蔬采后病原菌的生長[32]。同時，沙棗膠與CA復(fù)合涂膜顯著降低果實發(fā)病率并延緩病斑直徑的擴展，類似的結(jié)果在以漂白紫膠、百里酚和水楊酸復(fù)合涂膜后的番茄果實上也有報道[33]。

提高果蔬采后抗病性也是抑制果蔬采后病害的重要作用機制之一[32]。果蔬在受到病原菌侵染或不良環(huán)境脅迫時，體內(nèi)活性氧爆發(fā)產(chǎn)生的H2O2既可直接抗菌，也能調(diào)控相關(guān)應(yīng)答脅迫的系列信號傳導，如作為激活苯丙烷代謝的第二信使[34]，啟動寄主多種防御反應(yīng)。H2O2還可誘導促進果實細胞壁結(jié)構(gòu)蛋白的氧化交聯(lián)，POD則通過催化酚類前體聚合為木質(zhì)素來加固細胞壁，從而增強對病原菌侵染的抵御能力[35]。貯藏后期果實后熟隨之病情擴散，活性氧過度累加會對果實細胞本身造成破壞，而POD又能及時清除體內(nèi)過量的H2O2，抑制膜脂過氧化，延緩果實成熟與衰老[36]。本實驗中，貯藏前中期（0～5 d），沙棗膠與CA復(fù)合涂膜促進了番茄果實中H2O2的快速積累，提高了POD等抗病相關(guān)酶活力；貯藏后期（5 d后）復(fù)合涂膜又抑制了體內(nèi)H2O2過量積累，減緩過氧化對果實產(chǎn)生的傷害。其中沙棗膠與0.2% CA復(fù)合涂膜效果最為顯著。H2O2作為信號分子，激活POD和PPO等抗性酶活力明顯升高，類似結(jié)果在肉桂精油復(fù)合殼聚糖涂膜番木瓜[37]和生姜精油復(fù)合殼聚糖涂膜鮮銀耳[38]的研究中也有報道。因此，H2O2與POD在植物精油誘導抗性中發(fā)揮著重要作用，其前期持續(xù)的高含量提高了番茄果實抵抗病原菌入侵的應(yīng)激防御能力。

苯丙烷代謝是果蔬中次生代謝的主要環(huán)節(jié)[39]，能夠調(diào)控酚類、黃酮類、木質(zhì)素等主要抗菌物質(zhì)的積累，在抗病防御反應(yīng)中具有重要地位[40]。PAL和4CL是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶。PAL催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸，4CL調(diào)控苯丙烷代謝主途徑向分支途徑轉(zhuǎn)折，其下游代謝產(chǎn)物如水楊酸、木質(zhì)素等參與果實抗性反應(yīng)[41]?？偡雍皖慄S酮是苯丙烷代謝的最終產(chǎn)物，其產(chǎn)生速度與積累量通常反映了果實抗病性的強弱[42]。本研究中，與對照組及沙棗膠單獨涂膜組相比，沙棗膠與CA復(fù)合涂膜顯著提高了番茄果實體內(nèi)的PAL活力和4CL活力，并促進了總酚和類黃酮等代謝產(chǎn)物的積累。類似的結(jié)果在丁香精油處理后的冬棗果實[43]、茶樹精油處理后的草莓果實[44]及香芹酚處理后的黑莓果實[45]研究中也有報道，表明植物精油可通過促進果蔬苯丙烷代謝進程，增強果蔬對病害的抗性。

綜上所述，CA在體外條件下對番茄紅粉病病原菌T. roseum具有顯著的抑制活性。沙棗膠與CA復(fù)合涂膜可通過促進果實H2O2快速積累，激活苯丙烷代謝途徑，提高POD、PAL和4CL等抗性酶活力，以及總酚和類黃酮等代謝抗性產(chǎn)物的積累，誘導增強番茄果實抗病性。所以，沙棗膠與CA復(fù)合涂膜控制番茄采后紅粉病發(fā)生并抑制果實腐爛的作用機制部分歸因于CA對病原真菌T. roseum的直接抑制效果，但更重要的是與CA作為活性成分誘導番茄果實增強抗性有關(guān)。然而在分子水平上，活性成分CA是否影響并且如何影響苯丙烷代謝途徑基因的表達需要進一步研究，也可能是多種代謝通路相互作用的結(jié)果。此外，不同品種和成熟度的果蔬、病原菌以及接種時間對采后果蔬抗病性的影響可能不同，下一步可考慮擴大研究范圍，以便更全面地揭示精油活性成分對采后果蔬抗病性的影響。

4 結(jié) 論

CA處理對番茄紅粉病病原菌T. roseum具有顯著的體外抑制活性。沙棗膠與0.2% CA復(fù)合涂膜可較好地控制番茄采后紅粉病的發(fā)生，抑制果實病斑擴展。該復(fù)合涂膜促進了貯藏前期番茄果實中H2O2、總酚和類黃酮等抗性物質(zhì)的積累，并提高了POD、PAL和4CL等抗性酶活力，增強了番茄果實抗病性。以上結(jié)果表明，沙棗膠與CA復(fù)合涂膜是一種潛在有效的采后番茄防腐手段。