丁芷倩，許 敏，吳 華，RAKA Rifat Nowshin，魏夢(mèng)雅，王開陽，肖俊松,*

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048；2.中國輕工業(yè)釀酒分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；3.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

迷迭香（Rosmarinus officinalisL.）是一種原產(chǎn)于地中海地區(qū)的多年生木本香料植物，屬于唇形科迷迭香屬，具有多種藥用價(jià)值[1-2]，在食品工業(yè)中常被用作植物性天然防腐劑及調(diào)味品，在世界各地均有栽培[3-4]。迷迭香有良好的抗氧化和緩解炎癥功效，主要功能成分為鼠尾草酸（carnosic acid，CA）、鼠尾草酚（carnosol，CS）、迷迭香酚（rosmanol，RS）和迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）等化合物[5-8]，有研究表明RA在20 μmol/L濃度以上時(shí)才能發(fā)揮一定的生物活性[9]。CA、CS、RS和RA的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，這些功能成分能直接和腸道部位的免疫相關(guān)細(xì)胞接觸，有可能緩解腸道部位的炎癥，清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）。

圖1 CA（A）、CS（B）、RS（C）和RA（D）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of CA (A), CS (B), RS (C) and RA (D)

機(jī)體在受到各種可能的有害刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，過量產(chǎn)生的ROS會(huì)降低內(nèi)源性抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等[10]。過量ROS還會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致胞內(nèi)丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）含量增加[11]。

氧化應(yīng)激與炎癥密切相關(guān)[12]。Toll樣受體4（tolllike receptor 4，TLR4）是一類關(guān)鍵的病原模式識(shí)別受體，可以識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）[13]。當(dāng)LPS刺激時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致線粒體中ROS積累，激活NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein，NLRP3）炎癥小體，促進(jìn)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β釋放[14]；或激活核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路，增加IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α[15]、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）和一氧化氮（nitric oxide，NO）的表達(dá)[16]。LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，是一種常用的體外細(xì)胞炎癥模型[17]。

迷迭香化合物可能通過抑制機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，增加抗氧化酶活力，抑制NLRP3炎癥小體和NF-κB信號(hào)通路激活，降低促炎因子的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮其抗氧化和抗炎作用。為了系統(tǒng)準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)迷迭香化合物發(fā)揮抗氧化、抗炎的作用及其機(jī)制，本研究選用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞建立體外炎癥模型，從分子水平比較上述4種迷迭香化合物的抗氧化及抗炎作用，從而為迷迭香的功能性食品開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RAW264.7細(xì)胞 中國科學(xué)院干細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、谷氨酰胺和丙酮酸鈉 美國Gibco公司；CA、CS、RS和RA（均為色譜級(jí)，純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；LPS、2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescin-diacetate，DCFH-DA）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）美國Sigma公司；總NO、總SOD活力、CAT活力檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒 南京建成生物技術(shù)研究所有限公司；RNA提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒 上海東洋紡生物科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠抗β-actin抗體、小鼠抗iNOS抗體、小鼠抗COX-2抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗 美國Cell Signaling Technology公司；ECL化學(xué)發(fā)光液 北京原平皓生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KJ201A型微量振蕩器 上海啟前電子科技有限公司；ME403型電子天平 美國梅特勒托利多集團(tuán)；80-1型低溫離心機(jī) 德國希格瑪公司；Infinite M200 Pro 型多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯集團(tuán)公司；Q5000型微量紫外分光光度計(jì) 美國Quawell技術(shù)公司；CFX96型熒光定量PCR儀 上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；FMB40型制冰機(jī) 無錫沃信儀器公司；BE-9008型微孔板恒溫振蕩器 蘇州江東精密儀器有限公司；VE-180微型垂直電泳槽、VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽、Tanon5200型顯影儀 北京原平皓生物技術(shù)有限公司；TDK-2型水平搖床 北京鼎國生物技術(shù)公司；CX31-12C03型光學(xué)倒置顯微鏡日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將RAW264.7細(xì)胞置于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記代數(shù)和日期，細(xì)胞培養(yǎng)液由88% DMEM培養(yǎng)液、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺和10%胎牛血清組成，細(xì)胞于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24 h利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及密度，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)正常且密度達(dá)到80%以上時(shí)吸去培養(yǎng)液，用pH 7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）輕柔沖洗一次，棄液，加入1 mL胰蛋白酶消化2 min，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞[18]接種于培養(yǎng)板中進(jìn)行分組，空白組：不接種細(xì)胞，不加CA、CS、RS、RA和LPS干預(yù)處理；對(duì)照組：接種細(xì)胞，不加CA、CS、RS、RA和LPS干預(yù)處理；實(shí)驗(yàn)組：接種細(xì)胞，分別加入終質(zhì)量濃度1～10 μg/mL CA、CS、RS和終質(zhì)量濃度1～100 μg/mL的RA與質(zhì)量濃度1 μg/mL的LPS共孵育或加入終質(zhì)量濃度1 μg/mL的LPS孵育。

1.3.2 細(xì)胞活力檢測

采用四甲基偶氮唑鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法檢測細(xì)胞活力[19]。首先對(duì)CA、CS、RS和RA進(jìn)行最佳濃度的篩選，然后在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)檢測CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活力的影響。選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105cells/mL的密度接種于96 孔板中，在CA、CS、RS和RA最佳濃度的選擇實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組：接種細(xì)胞，不加CA、CS、RS和RA干預(yù)處理；實(shí)驗(yàn)組：接種細(xì)胞，分別加入質(zhì)量濃度1～20 μg/mL CA、CS、RS和質(zhì)量濃度1～100 μg/mL的RA。在4種化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活力的影響實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組：接種細(xì)胞，不加CA、CS、RS、RA和LPS干預(yù)處理；實(shí)驗(yàn)組：接種細(xì)胞，加入質(zhì)量濃度1 μg/mL的LPS以及分別與質(zhì)量濃度1～10 μg/mL CA、CS、RS和質(zhì)量濃度10～100 μg/mL的RA共處理細(xì)胞。于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄去上清液，每孔加入100 μL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液和10 μL MTT，于培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄液，每孔加入150 μL DMSO，于培養(yǎng)箱中孵育15 min后，利用酶標(biāo)儀在波長570 nm處測定吸光度A，按式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量的測定

利用DCFH-DA法測定CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平。選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105cells/mL的密度接種于96 孔板中，按照1.3.1節(jié)分組方法處理細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入終濃度10 μmol/L的DCFH-DA試劑，于培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，棄液。加入100 μL PBS洗去未結(jié)合的DCFH-DA，再加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，采用多功能酶標(biāo)儀于激發(fā)波長485 nm和發(fā)射波長530 nm條件下測定熒光強(qiáng)度，按式（2）計(jì)算ROS相對(duì)含量。

1.3.4 NO釋放量的測定

利用Greiss法測定CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的含量[20]。選取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以2×105cells/mL的密度接種于96 孔板中，按照1.3.1節(jié)分組方法處理細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)液于1 000×g離心5 min，收集上清液。向待測上清液中加入等體積的Griess Reagent I和Griess Reagent II于室溫下孵育10 min，利用酶標(biāo)儀在波長540 nm處測定各孔吸光度，以NaNO2作為標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)胞培養(yǎng)液分別稀釋至濃度為10、20、40、60、80 μmol/L，在與細(xì)胞上清液同樣處理?xiàng)l件下，以NaNO2濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.005 2x-0.014 3，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到NO釋放量。

1.3.5 SOD、CAT活力和MDA含量測定

利用水溶性四唑鹽-8（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium，WST-8）法、可見顯色法和硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）比色法分別測定CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞SOD、CAT活力和MDA含量的影響。將處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以5×105cells/mL的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，按照1.3.1節(jié)分組方法處理細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，重新加入1 mL PBS用細(xì)胞刮板刮下細(xì)胞并收集至1.5 mL的離心管中，根據(jù)試劑盒說明書提取蛋白并采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。

按SOD活力檢測試劑盒說明書在96 孔板中進(jìn)行如下操作：樣品組中加入20 μL蛋白樣品、160 μL WST-8/酶工作液和20 μL反應(yīng)啟動(dòng)工作液；空白1組中加入20 μL SOD檢測緩沖液、160 μL WST-8/酶工作液和20 μL反應(yīng)啟動(dòng)工作液；空白2組中加入40 μL SOD檢測緩沖液、160 μL WST-8/酶工作液和20 μL反應(yīng)啟動(dòng)工作液；空白3組中加入20 μL蛋白樣品、20 μL SOD檢測緩沖液、160 μL WST-8/酶工作液和20 μL反應(yīng)啟動(dòng)工作液；各組于37 ℃孵育30 min，利用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定各孔的吸光度，按式（3）、（4）計(jì)算SOD活力。

按CAT活力檢測試劑盒說明書進(jìn)行如下操作：取1 μL蛋白樣品，加入39 μL CAT檢測緩沖液和10 μL 250 mmol/L過氧化氫溶液，反應(yīng)5 min，加入450 μL CAT反應(yīng)終止液，混勻。取10 μL上述終止反應(yīng)的體系于新離心管中，加入40 μL CAT檢測緩沖液，混勻，取10 μL于96 孔板中加入200 μL顯色工作液，25 ℃孵育30 min，利用酶標(biāo)儀在波長520 nm處測定其吸光度。取0、12.5、25、50、75 μL的標(biāo)準(zhǔn)品過氧化氫溶液，加入CAT檢測緩沖液至終體積為100 μL，各取4 μL于96 孔板中，在與樣品同樣處理?xiàng)l件下，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝69.75x-0.099 3，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到CAT活力。

按MDA檢測試劑盒說明書進(jìn)行如下操作：取100 μL蛋白樣品，加入200 μL MDA檢測工作液，于100 ℃水浴15 min后冷卻至室溫，1 000×g離心10 min，取200 μL上清于96 孔板中，利用酶標(biāo)儀在波長532 nm處測定各孔的吸光度。將試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水分別稀釋至濃度為1、2、5、10、20、50 μmol/L，在與樣品同樣處理?xiàng)l件下，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.533 6x+0.101 0，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到MDA含量。

1.3.6TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量測定

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，以β-actin為內(nèi)參基因，測定CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA相對(duì)水平的影響。將處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以5×105cells/mL的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，按照1.3.1節(jié)分組方法處理細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入1 mL TRIzol試劑裂解細(xì)胞并收集至1.5 mL無RNA酶離心管中，按照試劑盒說明書分別進(jìn)行樣品RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和定量檢測，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt＝（Ct目的基因-Ctβ-actin）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ctβ-actin）對(duì)照組[21]。各指標(biāo)引物信息見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.3.7 iNOS、COX-2蛋白相對(duì)含量測定

利用Western blot法測定CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2蛋白的相對(duì)含量，參照Han等[22]的方法略有改動(dòng)，將處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以5×105cells/mL的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，按照1.3.1節(jié)分組方法處理細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，重新加入1 mL PBS用細(xì)胞刮板刮下細(xì)胞并收集至1.5 mL離心管中。利用試劑盒提取蛋白并檢測蛋白濃度，配制10%的分離膠和濃縮膠，上樣，恒壓100、120 V電泳各40 min，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，在膜上滴加超敏化學(xué)發(fā)光染料底物，反應(yīng)1 min后開始曝光顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白的凈光密度值，以β-actin為內(nèi)參蛋白，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量＝目標(biāo)蛋白的凈光密度值/β-actin的凈光密度值[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel做初步整理，然后用SPSS Statistics軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過單因素方差分析對(duì)多組數(shù)據(jù)之間的差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，最后利用Origin 2019b軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CA、CS、RS和RA最佳濃度的選擇及對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

采用MTT法檢測CA、CS、RS和RA對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2A～C可以看出，質(zhì)量濃度1～10 μg/mL的CA、CS和RS處理RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率均達(dá)到80%以上，表明這3種物質(zhì)在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用，而質(zhì)量濃度大于10 μg/mL的CA、CS和RS處理細(xì)胞后，細(xì)胞存活率均有一定程度的下降，所以選用質(zhì)量濃度1、5、10 μg/mL的CA、CS和RS進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖2D可以看出，質(zhì)量濃度10～100 μg/mL的RA處理RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率均達(dá)80%以上，即RA在此濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞無毒性作用，因此可選取10、50、100 μg/mL的RA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 CA（A）、CS（B）、RS（C）和RA（D）對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig. 2 Effects of CA (A), CS (B), RS (C) and RA (D) on the viability of RAW264.7 cells

采用MTT法檢測3種質(zhì)量濃度的CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖3所示，質(zhì)量濃度1、5、10 μg/mL的CA、CS、RS和質(zhì)量濃度10、50、100 μg/mL的RA分別與質(zhì)量濃度1 μg/mL的LPS共孵育24 h后，細(xì)胞存活率均超過90%，表明上述4種迷迭香化合物在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與LPS共孵育不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。因此，可選取質(zhì)量濃度1、5、10 μg/mL CA、CS、RS和質(zhì)量濃度10、50、100 μg/mL RA分別與LPS共孵育進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig. 3 Effects of CA, CS, RS and RA on the viability of RAW264.7 cells induced by LPS

2.2 CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

當(dāng)機(jī)體受到LPS刺激時(shí)，RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。ROS是氧化應(yīng)激發(fā)生的重要介質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)中采用DCHF-DA熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig. 4 Effect of CA, CS, RS and RA on ROS levels in RAW264.7 cells induced by LPS

由圖4可知，與LPS組相比，4種迷迭香化合物均能顯著降低LPS誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS相對(duì)含量升高（P＜0.05）（質(zhì)量濃度1 μg/mL CS除外），并具有明顯的劑量依賴性，即隨質(zhì)量濃度的升高，抑制效果逐漸增強(qiáng)?？傮w來看，CA對(duì)ROS的抑制效果優(yōu)于其他3種化合物，其中，質(zhì)量濃度10 μg/mL的CA與CS可將細(xì)胞ROS水平保持與對(duì)照組幾乎一致。

2.3 CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響

氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷和炎癥反應(yīng)，NO是炎癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵介質(zhì)，其釋放量是衡量炎癥反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[21]。本實(shí)驗(yàn)利用Greiss法測定NO釋放量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響Fig. 5 Effect of CA, CS, RS and RA on NO production of RAW264.7 cells induced by LPS

由圖5可見，與LPS組相比，大部分迷迭香化合物均能顯著降低LPS誘導(dǎo)細(xì)胞NO的釋放量（P＜0.05），并具有一定的劑量依賴性，隨質(zhì)量濃度的升高，其抑制效果逐漸增強(qiáng)。在4種迷迭香化合物中，CA對(duì)NO的抑制作用較其他3種化合物更顯著（P＜0.05），且質(zhì)量濃度10 μg/mL的CA可將NO釋放量降低至與對(duì)照組幾乎一致。與LPS組相比，質(zhì)量濃度5～10 μg/mL的CS和RS及質(zhì)量濃度100 μg/mL的RA對(duì)NO釋放有顯著的抑制效果（P＜0.05），但均不及相應(yīng)濃度下CA的效果顯著（P＜0.05）。

2.4 CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT活力和MDA含量的影響

SOD和CAT是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化酶，能有效清除ROS，從而提高機(jī)體的抗氧化能力[24]，本實(shí)驗(yàn)采用WST-8法檢測SOD活力，用可見顯色法測定CAT活力。MDA是ROS過量積累導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化而生成的產(chǎn)物，采用TBARS比色法測定細(xì)胞內(nèi)MDA含量，其含量間接反映細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度。

圖6 CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)SOD（A）、CAT（B）活力和MDA含量（C）的影響Fig. 6 Effect of CA, CS, RS and RA on the activity of SOD (A), CAT (B)and MDA levels (C) in RAW264.7 cells induced by LPS

從圖6A、B可以看出，SOD與CAT活力均隨4種迷迭香化合物質(zhì)量濃度的增大而提高，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。與LPS處理組相比，4種化合物在較高濃度處理時(shí)均能顯著提高SOD與CAT活力（P＜0.05）。其中，SOD活力在4種化合物添加到最高濃度時(shí)均與對(duì)照組近似，相互間無顯著差異（P＞0.05）。與SOD活力不同的是，低質(zhì)量濃度的CA（1 μg/mL）處理較LPS組能顯著提高CAT活力（P＜0.05）。且4種化合物中，只有CA在最高質(zhì)量濃度的作用下，CAT活力與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），其他3種化合物在最高質(zhì)量濃度下，雖然CAT活力較LPS組顯著提高，但仍顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖6C結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組能顯著刺激細(xì)胞內(nèi)MDA的產(chǎn)生（P＜0.05），不同質(zhì)量濃度的迷迭香化合物對(duì)MDA的抑制作用效果不同，且呈劑量依賴性。與LPS組相比，CS、RS和RA在較高質(zhì)量濃度下均能顯著抑制MDA的生成（P＜0.05）。與其他化合物不同的是，質(zhì)量濃度1、5、10 μg/mL CA處理與LPS組相比均可顯著抑制MDA的產(chǎn)生（P＜0.05），且在質(zhì)量濃度10 μg/mL時(shí)， MDA含量降低到較對(duì)照組更低的水平（P＜0.05）。由此可見，CA不僅能較好地提高SOD和CAT活力，還能夠較好地抑制MDA的產(chǎn)生。

2.5 CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

IL-6、IL-1β和TNF-α參與調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)，是重要的促炎因子。在LPS刺激下，細(xì)胞內(nèi)促炎因子顯著增加[25]。通過實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測迷迭香化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量反映細(xì)胞炎癥程度。

圖7 迷迭香CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β（C） mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 7 Effects of CA, CS, RS and RA on relative mRNA expression of TNF-α (A), IL-6 (B) and IL-1β (C) in RAW264.7 cells induced by LPS

由圖7可以看出，與LPS組相比，4種迷迭香化合物在較高質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量均有較好的抑制作用，且具劑量依賴性。與LPS組相比，4種迷迭香化合物在最高質(zhì)量濃度下均能顯著抑制TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05），且可達(dá)到與對(duì)照組水平（P＞0.05）。只有質(zhì)量濃度10 μg/mL RS能將LPS刺激導(dǎo)致的IL-6和IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量升高降低至與對(duì)照組一致的水平（P＞0.05）。由此可見，4種迷迭香化合物中，質(zhì)量濃度5、10 μg/mL CA對(duì)TNF-α轉(zhuǎn)錄水平具有較好的抑制效果，而對(duì)于IL-6和IL-1β的轉(zhuǎn)錄抑制則是質(zhì)量濃度10 μg/mL的RS效果最佳。

2.6 CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS和COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

炎癥是由多種分子機(jī)制介導(dǎo)的復(fù)雜過程，當(dāng)細(xì)胞受到LPS刺激時(shí)iNOS和COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量會(huì)增加，iNOS和COX-2是炎癥復(fù)雜網(wǎng)狀體系中的重要靶基因蛋白[26]。利用Western blot方法檢測iNOS和COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量，研究4種迷迭香化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞抗炎活性。

圖8 CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS和COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 8 Effects of CA, CS, RS and RA on the relative protein expression of iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells induced by LPS

由圖8可以看出，隨CS、RS和RA質(zhì)量濃度的升高，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，呈一定的劑量依賴效應(yīng)。與LPS組相比，RS和RA能顯著降低LPS誘導(dǎo)的iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05），且與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）。在相應(yīng)質(zhì)量濃度下比較4種迷迭香化合物，其中RS對(duì)iNOS表達(dá)的抑制效果最佳。與LPS組相比，RA和RS均能顯著降低LPS誘導(dǎo)細(xì)胞COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。其中，RA和質(zhì)量濃度10 μg/mL RS可將COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低至與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），對(duì)LPS誘導(dǎo)的COX-2蛋白表達(dá)升高表現(xiàn)出較好的抑制效果。

3 討 論

炎癥是宿主對(duì)抗外來病原體所產(chǎn)生的免疫防御應(yīng)答反應(yīng)。機(jī)體通過抗原呈遞細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）表面的模式識(shí)別受體識(shí)別各種入侵微生物的病原相關(guān)分子模式，如鞭毛蛋白和LPS等，當(dāng)機(jī)體受到LPS刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS[27]。本研究結(jié)果表明，CA、CS、RS和RA能降低LPS誘導(dǎo)的胞內(nèi)MDA含量和ROS相對(duì)含量，提高LPS誘導(dǎo)的抗氧化物酶活力，從而對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激與炎癥密切相關(guān)，通過LPS刺激產(chǎn)生的ROS可以激活NF-κB信號(hào)通路，NF-κB信號(hào)通路是炎癥發(fā)生的關(guān)鍵信號(hào)通路之一[28]，可以促進(jìn)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)[29]。iNOS和COX-2是NF-κB信號(hào)通路中重要的兩種蛋白分子，兩者互相協(xié)調(diào)，是預(yù)防或治療慢性炎性疾病的靶點(diǎn)[30]，其中，iNOS可以調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生，NO也是參與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)分子[31]。本研究中CA、CS、RS和RA可以降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)促炎因子TNF-α、IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量，降低LPS誘導(dǎo)的iNOS和COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量，降低LPS誘導(dǎo)的NO釋放量，且均有一定的濃度依賴效應(yīng)，發(fā)揮了一定的抗炎作用。

ROS也可以激活炎癥小體，炎癥小體在各種生理病理過程中起著重要的作用。目前，NLRP3是研究最廣泛的炎癥小體，ROS可以通過激活NLRP3炎癥小體促進(jìn)炎癥因子IL-1β的產(chǎn)生[32]，本研究發(fā)現(xiàn)CA、CS、RS和RA可以降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)促炎因子IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量。

近年來，迷迭香植物作為天然抗氧化、抗炎劑的研究與開發(fā)利用引起了廣泛的關(guān)注，Lai等[33]發(fā)現(xiàn)RS可以阻斷LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而下調(diào)iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)。Arranz等[34]利用LPS刺激THP-1巨噬細(xì)胞構(gòu)建體外炎癥模型，研究發(fā)現(xiàn)CA和CS能夠抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2等基因的表達(dá)，進(jìn)而表現(xiàn)出抗炎作用。Kuhlmann等[35]發(fā)現(xiàn)RA可以抑制LPS誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自由基和NO的產(chǎn)生，具有一定的抗氧化、抗炎作用。本研究的結(jié)果進(jìn)一步表明了4種迷迭香化合物可作為機(jī)體外源抗氧化、抗炎劑，從而有效地抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了CA、CS、RS和RA對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明，上述4種迷迭香化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量、MDA含量、NO釋放量和TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量，以及iNOS和COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量的升高有顯著抑制作用，對(duì)SOD和CAT活力有顯著的保護(hù)作用，且具有濃度依賴效應(yīng)。CA、CS、RS和RA可以有效緩解LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥，在體外具有預(yù)防或減弱氧化應(yīng)激和炎癥的效果，其中水溶性的RA有效質(zhì)量濃度高于其他3種。本研究結(jié)果可豐富迷迭香在食品營養(yǎng)中的理論基礎(chǔ)，為其開發(fā)抗氧化和抗炎的精準(zhǔn)營養(yǎng)食品提供科學(xué)依據(jù)。