嚴(yán) 媛，吳偉杰，郜海燕,*，房祥軍，韓延超，劉瑞玲，牛 犇，陳杭君,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210008；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜采后保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建），浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021）

茭白（Zizania latifolia）是禾本科菰屬水生植物，是我國(guó)僅次于蓮藕的第二大水生蔬菜，茭白殼是茭白采收時(shí)下部殘留的葉鞘[1]。茭白采收時(shí)，割取茭白后剩余的葉片和葉鞘通常丟棄在田埂間，我國(guó)茭白產(chǎn)業(yè)每年產(chǎn)生的廢棄茭白鞘葉在500萬(wàn) t以上，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[2]。目前關(guān)于茭白鞘葉的回收利用主要集中在食用菌基質(zhì)、動(dòng)物飼料等方面，從中提取的天然功能性物質(zhì)主要包括黃酮、膳食纖維和葉綠素[3-5]，加強(qiáng)對(duì)廢棄茭白殼的研究開(kāi)發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。小麥黃素又稱(chēng)為苜蓿素，是一種類(lèi)黃酮化合物，廣泛存在于禾本科植物中，研究表明小麥黃素能通過(guò)抑制環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、前列腺素（prostaglandin，PG）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）、一氧化氮（NO）等炎癥介質(zhì)發(fā)揮抗炎作用[6-7]。

潰瘍性結(jié)腸炎是一種發(fā)病機(jī)制尚未明確的慢性非特異性炎癥性腸病，病情易反復(fù)，治療難度大，近年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，常見(jiàn)于青壯年人群，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[8-9]。且潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要包括遺傳因素和環(huán)境因素，其中飲食是最重要的環(huán)境因素之一[10]，近年來(lái)通過(guò)飲食干預(yù)治療潰瘍性結(jié)腸炎的方法成為研究熱點(diǎn)。

基于前人研究基礎(chǔ)，本研究通過(guò)葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，評(píng)價(jià)茭白殼提取物（Zizania latifoliashell extract，Zlse）對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防作用，以期為推進(jìn)茭白殼的綜合利用提供理論依據(jù)，并為膳食預(yù)防和調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

C57BL/6小鼠，雄性，SPF級(jí)，7 周，體質(zhì)量16～22 g，購(gòu)于華東師范大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)員實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心專(zhuān)屬動(dòng)物房，使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2020-0022。

‘浙茭七號(hào)’茭白殼 浙江省嘉興市桐鄉(xiāng)董家優(yōu)質(zhì)茭白基地；玉米芯墊料 邳州市小河科技發(fā)展有限公司；60Co滅菌飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

美莎拉嗪腸溶片 佳木斯鹿靈制藥有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8檢測(cè)試劑盒 南京建成科技有限公司；DSS、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、甲醛（均為分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；柱層析硅膠（200～300 目） 青島海洋化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FreeZone?真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；DGG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DK-S28電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ME103E電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；ZJ-4獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具 蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司；RM2016病理切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司；SpectraMax M2酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；NIKON DS-U3光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 茭白殼提取物的制備

將新鮮茭白殼洗凈切碎，放入恒溫干燥箱中60 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過(guò)40 目篩，于干燥器中貯藏備用。將茭白殼粉末與體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液按料液比1∶30（m/V）混勻，在恒溫水浴鍋中于80 ℃攪拌浸提3 h，取出后超聲（30 ℃、210 W）輔助提取30 min，過(guò)濾，所得濾液于40 ℃旋蒸至無(wú)乙醇味，冷凍干燥后以料液比1∶30（m/V）用乙酸乙酯分兩次萃取，合并萃取液，旋蒸水洗后冷凍干燥備用。取乙酸乙酯相凍干樣品與硅膠攪拌，干法上樣，進(jìn)行硅膠柱色譜層析，以體積比100∶0～0∶100的二氯甲烷-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)結(jié)果合并相似洗脫液，再次進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以體積比50∶1～5∶1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，合并目標(biāo)洗脫液，真空冷凍干燥保存?zhèn)溆?。所得Zlse利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析。

1.3.2 小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的構(gòu)建及分組

小鼠飼養(yǎng)條件：SPF級(jí)，溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，明暗12 h循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，小鼠自由攝食飲水。參考Wu Hao等[11]的方法進(jìn)行造模，60 只C57BL/6雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為6 組，每組10 只，除正常組外其余組灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.5% DSS水溶液誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，陽(yáng)性對(duì)照組以美沙拉嗪（5-aminosalicylic acid，5-ASA）作為陽(yáng)性對(duì)照，分組及模型構(gòu)建方法如表1所示。

表1 小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的構(gòu)建Table 1 Experimental scheme for construction of mouse model of ulcerative colitis

造模結(jié)束后斷食24 h，眼球取血收集血清并處死小鼠，取出盲腸至肛門(mén)處整段結(jié)腸，測(cè)量長(zhǎng)度，剪下1 cm結(jié)腸用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液固定，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察結(jié)腸組織病變情況，其余結(jié)腸組織迅速于液氮中保存，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱用于酶活力測(cè)定。

1.3.3 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天記錄小鼠體質(zhì)量，并觀察小鼠大便性狀及便血情況，并進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（disease active index，DAI）評(píng)分，量化炎癥程度[12]。DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示[13]，體質(zhì)量變化率和DAI評(píng)分計(jì)算分別見(jiàn)式（1）、（2）。

組別 第1～7天 第8～14天正常（normal control，NC）組灌胃0.2 mL 0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethylcellulose，CMCNa）溶液灌胃0.2 mL 0.5% CMC-Na溶液灌胃0.2 mL 0.5% CMC-Na溶液+3.5% DSS溶液（自由飲食）陽(yáng)性對(duì)照（positive control，PC）組模型（model control，MC）組灌胃0.2 mL 0.5%CMC-Na溶液灌胃0.2 mL Zlse（灌胃劑量為100 mg/（kg·d））+3.5% DSS溶液（自由飲食）Zlse-M組 灌胃0.2 mL Zlse溶液（灌胃劑量為200 mg/（kg·d））灌胃0.2mL 5-ASA+3.5% DSS溶液（自由飲食）Zlse-L組 灌胃0.2 mL Zlse溶液（灌胃劑量為100 mg/（kg·d））灌胃0.2 mL 5-ASA溶液（灌胃劑量為200 mg/（kg·d））灌胃0.2 mL Zlse（灌胃劑量為200 mg/（kg·d））+3.5% DSS溶液（自由飲食）Zlse-H組 灌胃0.2 mL Zlse溶液（灌胃劑量為300 mg/（kg·d））灌胃0.2 mL Zlse（灌胃劑量為300 mg/（kg·d））+3.5% DSS溶液（自由飲食）

表2 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring criteria for DAI

1.3.4 小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及HE染色檢查結(jié)腸組織病理學(xué)變化

將用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液固定的結(jié)腸組織樣本取出，經(jīng)過(guò)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟洗滌、HE染色等步驟后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組織樣本病變情況并進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分[14]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表3所示，結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分按式（3）計(jì)算。

表3 小鼠結(jié)腸炎組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Criteria for histopathological grading of colitis in mice

1.3.5 小鼠血清炎癥因子水平的測(cè)定

各組小鼠血液樣本靜止4 h時(shí)，待血液凝固后，3 000 r/min離心15 min取上層血清，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）稀釋至所需濃度，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各血清樣本中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8質(zhì)量濃度。

1.3.6 小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平測(cè)定

精確稱(chēng)取結(jié)腸組織，加入檢測(cè)試劑盒中的勻漿介質(zhì)混勻，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測(cè)定OD460nm，測(cè)定和計(jì)算小鼠結(jié)腸組織中MPO活力和SOD活力。

1.3.7 茭白殼提取物活性成分作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取成分的分子式和SMILES號(hào)，通過(guò)Swiss Target平臺(tái)查詢Zlse各活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，再通過(guò)OMIM、GeneCards、Therapeutic Target Database（TTD）數(shù)據(jù)庫(kù)3個(gè)平臺(tái)查找潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)靶點(diǎn)，并篩選出Zlse活性成分與疾病的交疊靶點(diǎn)，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到交疊靶點(diǎn)相關(guān)京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路。最后通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 3.7.0構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖和“活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel及GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。采用SPSS 25.0中單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，置信區(qū)間為95%（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 茭白殼提取物成分分析

如圖1所示，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，MRM）檢測(cè)多峰圖顯示了樣本中檢測(cè)到的所有物質(zhì)，其中不同顏色的質(zhì)譜峰代表檢測(cè)到不同物質(zhì)，具體物質(zhì)見(jiàn)表4。茭白殼粗提物經(jīng)過(guò)乙酸乙酯萃取和硅膠層析柱純化之后，得到的化合物進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測(cè)，所得Zlse共檢測(cè)到10種化合物，其中9種為黃酮類(lèi)化合物、1種為生物堿。10種化合物根據(jù)相對(duì)含量排序分別為沙可林B＞小麥黃素-4’-O-(愈創(chuàng)木酰甘油)醚＞沙可林A＞小麥黃素＞小麥黃素-4’-O-丁香醇醚＞3-氯苯胺＞香葉木素＞高車(chē)前素＞小麥黃素-7-O-(2’-丙二酰)鼠李糖苷＞柚皮素，其中小麥黃素-4’-O-丁香醇醚、小麥黃素、小麥黃素-4’-O-(愈創(chuàng)木酰甘油)醚、小麥黃素-7-O-(2’’-丙二酰)鼠李糖苷、沙可林B、沙可林A這6種化合物為小麥黃素及其衍生物，總相對(duì)含量約為91.53%。

圖1 茭白殼提取物MRM檢測(cè)多峰圖Fig. 1 MRM detection multi-peak diagram of Z. latifolia shell extract

表4 茭白殼提取物成分分析Table 4 Component analysis of Z. latifolia shell extract

2.2 茭白殼提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量變化率及DAI的影響

體質(zhì)量下降是DSS誘導(dǎo)小潰瘍性結(jié)腸炎的典型癥狀之一[15]。如圖2A所示，MC組小鼠體質(zhì)量從第10天開(kāi)始下降，第14天時(shí)，MC組小鼠體質(zhì)量為造模初始的84.50%，而NC組小鼠體質(zhì)量為初始的106.77%，MC組小鼠相較NC組體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05）。與MC組相比，Zlse處理組（Zlse-L、Zlse-M和Zlse-H）小鼠體質(zhì)量的下降趨勢(shì)減緩，分別為初始體質(zhì)量的89.10%、92.17%和96.06%，表明Zlse能有效改善結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量減輕的癥狀。

DAI評(píng)分是評(píng)估小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的重要指標(biāo)[16]。如圖2B所示，NC組小鼠精神活躍、毛色光澤發(fā)亮，且體質(zhì)量穩(wěn)定上升、大便成形、無(wú)便血情況，而MC組小鼠第9天開(kāi)始DAI評(píng)分上升，出現(xiàn)精神萎靡、大便帶黏液等癥狀，第11天出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)便血，并伴隨水狀糞便、肛門(mén)腫脹等現(xiàn)象。相較而言，Zlse組情況有所改善，第14天時(shí)，NC組DAI評(píng)分為0，MC組為3.70，Zlse-L組為3.17，Zlse-M組為2.87，Zlse-H組為2.23，說(shuō)明Zlse能緩解小鼠結(jié)腸炎病狀。

圖2 茭白殼提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量變化率（A）和DAI評(píng)分（B）的影響Fig. 2 Effect of Z. latifolia shell extract on percentage body mass change (A) and DAI score (B) in mice

2.3 茭白殼提取物對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響

結(jié)腸萎縮是小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的主要癥狀之一[17]。如圖3所示，NC組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度為7.95 cm，MC組為5.02 cm，與NC組相比顯著縮短（P＜0.05），Zlse-L、Zlse-M和Zlse-H組結(jié)腸長(zhǎng)度分別為5.37、5.67 cm和6.08 cm，相比MC組分別增長(zhǎng)6.97%、12.95%和21.12%，說(shuō)明Zlse一定程度能改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀。

圖3 茭白殼提取物對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響Fig. 3 Effect of Z. latifolia shell extract on colon length in mice

2.4 茭白殼提取物對(duì)小鼠結(jié)腸組織病理情況的影響

為評(píng)價(jià)Zlse對(duì)小鼠結(jié)腸組織病理情況的影響，對(duì)結(jié)腸進(jìn)行HE染色，結(jié)果如圖4A所示。NC組小鼠結(jié)腸肉眼觀察無(wú)潰瘍和充血癥狀，HE染色切片觀察結(jié)腸組織健康，上皮組織結(jié)構(gòu)完整，腺體完整有序，隱窩結(jié)構(gòu)正常。MC組結(jié)腸組織肉眼可見(jiàn)充血和部分糜爛，顯微鏡下觀察上皮損傷脫落，隱窩破損甚至完全消失，腺體損傷，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，這與MC組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分相較于NC組顯著提高（P＜0.05）（圖4B）一致。而Zlse-L、Zlse-M組和Zlse-H組上皮組織之間趨于完整，杯狀細(xì)胞增多，炎癥細(xì)胞減少，隱窩結(jié)構(gòu)逐漸趨于正常，組織病理學(xué)評(píng)分較MC組分別顯著降低16.47%、34.12%和57.65%（P＜0.05）。

圖4 茭白殼提取物對(duì)小鼠結(jié)腸HE染色切片（200×）（A）及組織病理學(xué)評(píng)分（B）的影響Fig. 4 Effect of Z. latifolia shell extract on colonic morphology (200 ×) (A)and histopathology score (B) of mice

2.5 茭白殼提取物對(duì)小鼠血清炎癥因子水平的影響

炎癥因子是一類(lèi)主要由免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性多肽，可介導(dǎo)單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)腸組織，引起腸組織損傷，直觀反映結(jié)腸的炎癥程度[18]。IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α等促炎癥因子分泌水平異常升高會(huì)促使小鼠結(jié)腸炎性損傷加劇[19]。

TNF-α是炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，能夠協(xié)同干擾素γ改變腸上皮細(xì)胞的屏障功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加腸黏膜和血管壁的通透性，引起腸壁出現(xiàn)潰瘍和水腫[20]，還能夠促進(jìn)IL-6、IL-8等炎癥因子的表達(dá)，擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加劇炎癥損傷[21]。IL-1β是單核細(xì)胞及免疫細(xì)胞產(chǎn)生的重要炎癥介質(zhì)，可促進(jìn)其他炎性因子表達(dá)，趨化中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)腸道病變部位[22]。IL-6可被IL-1β通過(guò)自分泌或者旁分泌的形式刺激產(chǎn)生，能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑[23]。IL-8能刺激中性粒細(xì)胞趨化，使其脫顆粒后釋放彈性酶、損傷內(nèi)皮細(xì)胞，引起微循環(huán)血流淤滯、組織壞死[24]。

如圖5所示，與NC組相比，MC組小鼠血清中促炎癥因子水平均顯著提高（P＜0.05），與MC組相比，Zlse干預(yù)組各炎癥因子水平均顯著降低（P＜0.05），其中Zlse-L、Zlse-M組和Zlse-H組IL-6質(zhì)量濃度相較于MC組分別降低15.99%、23.11%和43.48%，IL-8質(zhì)量濃度分別降低24.69%、32.82%和44.79%，IL-1β質(zhì)量濃度分別降低25.39%、44.68%和65.96%，TNF-α質(zhì)量濃度分別降低42.33%、49.21%和62.79%。殷玉婷等[25]研究發(fā)現(xiàn)小麥黃素可顯著降低小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β水平，改善小鼠肺部炎癥；郭敏俠等[26]用尿酸鈉誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥黃素能夠降低細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中TNF-α含量。本研究發(fā)現(xiàn)Zlse能通過(guò)抑制促炎癥因子水平升高，緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎病理過(guò)程中的炎癥反應(yīng)和組織損傷，與前人研究結(jié)果一致。

圖5 茭白殼提取物對(duì)小鼠血清炎癥因子水平的影響Fig. 5 Effect of Z. latifolia shell extract on serum inflammatory factors in mice

2.6 茭白殼提取物對(duì)小鼠結(jié)腸氧化應(yīng)激的影響

潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制與腸道抗氧化系統(tǒng)的失衡有關(guān)，過(guò)量活性氧和活性氮堆積會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸抗氧化防御系統(tǒng)失衡。MPO是一種血紅素蛋白，富含于中性粒細(xì)胞中，在中性粒細(xì)胞中可使過(guò)氧化氫催化電子供體的氧化作用生成多種氧化物，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)和氧化損傷，最終導(dǎo)致結(jié)腸組織損傷[27-28]。如圖6A所示，和NC組相比，MC組小鼠結(jié)腸的MPO活力顯著升高（P＜0.05），而Zlse-L、Zlse-M和Zlse-H組的MPO活力顯著低于MC組（P＜0.05），且隨著Zlse劑量升高M(jìn)PO活力逐漸降低，相較于MC組分別降低18.48%、22.56%和41.96%，表明Zlse能有效減少小鼠結(jié)腸組織中的中性粒細(xì)胞，降低炎癥程度，這與HE染色中觀察到的結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度降低一致。SOD能通過(guò)清除機(jī)體產(chǎn)生的超氧陰離子自由基減輕氧化應(yīng)激損傷，SOD活力降低致使結(jié)腸對(duì)自由基的清除能力下降，加速結(jié)腸組織損傷[29]。如圖6B所示，相較于NC組，MC組SOD活力顯著降低（P＜0.05），Zlse-L、Zlse-M組和Zlse-H組SOD活力分別為MC組的1.28、1.48 倍和1.70 倍。小麥黃素具有良好的抗氧化能力，能有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基[30-32]。Li Xiaoxiao等[33]研究發(fā)現(xiàn)小麥黃素可以通過(guò)抑制MPO活力減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織損傷。本研究結(jié)果表明Zlse能夠通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠結(jié)腸組織MPO和SOD活力，提高結(jié)腸抗氧化應(yīng)激能力，減輕結(jié)腸氧化損傷，緩解炎癥。

圖6 茭白殼提取物對(duì)小鼠結(jié)腸組織中MPO活力（A）和SOD活力（B）的影響Fig. 6 Effect of Z. latifolia shell extract on MPO (A) and SOD (B)activity in colon tissue of mice

2.7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

Zlse經(jīng)過(guò)UPLC/MS-MS系統(tǒng)檢驗(yàn)共包含10種化合物，進(jìn)一步在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到符合要求的靶點(diǎn)280個(gè)，8種化合物為有效活性成分，在OMIM、GeneCards、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)以潰瘍性結(jié)腸炎為關(guān)鍵詞，篩選得到1 571個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)，將篩選得到的活性成分靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，共得到77個(gè)共有靶點(diǎn)（圖7A）。

通過(guò)Cytoscape構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖7B所示，根據(jù)平均節(jié)點(diǎn)Degree值（30）篩選得5個(gè)關(guān)鍵活性成分，根據(jù)節(jié)點(diǎn)Degree值排序分別為高車(chē)前素（49）＞香葉木素（45）＞小麥黃素（44）＞小麥黃素-4’-O-丁香醇醚（42）＞柚皮素（39），由于高車(chē)前素、香葉木素和柚皮素相對(duì)含量很少，推測(cè)小麥黃素及小麥黃素-4’-O-丁香醇醚為關(guān)鍵活性成分。

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在基因進(jìn)行通路富集分析得到119 條KEGG通路，篩選排名前20的KEGG通路，結(jié)果如圖7C、D所示，除人類(lèi)癌癥相關(guān)通路之外，磷脂酰肌醇3-激酶/蘇氨酸激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/threonine kinase，PI3K/Akt）信號(hào)通路位居首位，可能是Zlse治療潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵通路，另外受體激活和活性氧積累等也是相關(guān)重要通路。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在腸道炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與細(xì)胞因子的調(diào)控緊密相關(guān)。PI3K家族是一類(lèi)蛋白激酶，PI3K活化之后會(huì)激活下游直接靶蛋白Akt，進(jìn)而激活核因子κB，誘導(dǎo)其釋放大量炎性因子如TNF-α、IL-6和IL-8等[34]。推測(cè)Zlse可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子和抗氧化系統(tǒng)來(lái)改善潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥程度和癥狀，其中小麥黃素和小麥黃素-4’-O-丁香醇醚為關(guān)鍵活性成分，這與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相印證。

圖7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析Fig. 7 Network pharmacology analysis

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，相較于MC組，Zlse干預(yù)組小鼠體質(zhì)量下降變緩，DAI評(píng)分顯著降低（P＜0.05），小鼠結(jié)腸縮短現(xiàn)象減輕，且結(jié)腸組織病變情況明顯改善，組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低（P＜0.05），Zlse顯著抑制了小鼠血清中促炎癥因子水平的升高（P＜0.05），顯著降低結(jié)腸氧化應(yīng)激酶MPO活力（P＜0.05），提高結(jié)腸SOD活力（P＜0.05）。UPLC-MS/MS分析Zlse中共檢出10種化合物，經(jīng)過(guò)PubChem、Swiss Target、OMIM、GeneCards、TTD、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，推測(cè)小麥黃素及小麥黃素-4’-O-丁香醇醚為其關(guān)鍵活性成分，PI3K/Akt信號(hào)通路、受體激活、活性氧積累為重要作用通路。Zlse通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸氧化防御系統(tǒng)，緩解小鼠的炎癥程度，修復(fù)結(jié)腸炎帶來(lái)的損傷。