范妍芹 嚴(yán)立斌 孟雅寧 張紅肖

（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北石家莊 050051）

甜椒（Capsicum annuumvar.grossum）是辣椒的一個變種，是我國栽培面積較大的主要蔬菜種類之一，其雜種優(yōu)勢顯著。利用甜椒雄性不育系培育雜交種，可大大降低雜交制種難度和成本，是目前甜椒雜種優(yōu)勢利用的重要途徑之一，也是倍受國內(nèi)外蔬菜育種學(xué)家重視的方法（Peterson，1958；Shifriss，1979；范妍芹和郭景印，1993；唐冬英 等，2001；張寶璽 等，2001）。

核雄性不育（GMS）兩用系遺傳簡單，不育性穩(wěn)定，一系兩用既是不育系又是保持系，同時育成，從而簡化育種程序和繁殖保存程序，且恢復(fù)源廣泛，一般自交系都是恢復(fù)系，克服了甜椒“三系”恢復(fù)源缺乏、選育雜交種難度大的問題，易選育出優(yōu)良恢復(fù)系，可較快地培育出雜種優(yōu)勢顯著的雜交種（范妍芹和郭景印，1993；唐冬英 等，2001；張寶璽 等，2001；范妍芹 等，2002；鄒學(xué)校和何青，2004；周永堅 等，2007；于海龍 等，2021）。河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所利用自己發(fā)現(xiàn)的甜椒雄性不育源育成甜椒核雄性不育兩用系A(chǔ)B91，目前利用AB91 已育成通過國家級、省級審（鑒）定的冀研系列甜椒、辣椒雜交種16 個，大面積應(yīng)用于生產(chǎn)，解決了甜椒一代雜種生產(chǎn)中人工去雄的難題（范妍芹 等，1999，2004a，2009；范妍芹和嚴(yán)立斌，2013；嚴(yán)立斌 等，2016）。

甜椒核雄性不育兩用系的轉(zhuǎn)育，一般選擇不育株與優(yōu)良自交系雜交，F(xiàn)2的育性開始分離，其群體不育株（msms）占25%，可育株（有兩種基因型MSMS 和MSms）占75%。只有選擇雜合基因型MSms 的可育株與不育株雜交，可產(chǎn)生后代育性發(fā)生分離且不育株與可育株分離比例符合1∶1 的群體，才有可能選育出新的甜椒核雄性不育兩用系。因F2從表型性狀無法鑒別可育株中的MSms、MSMS 兩種基因型，無法選擇出雜合基因型MSms可育株與不育株msms 雜交轉(zhuǎn)育，只能采用表現(xiàn)可育的單株測交，需要配制大量的測交組合，下一年種植鑒定，開花期鑒定后淘汰表現(xiàn)全可育的測交組合，留下育性分離比符合1∶1 的測交組合，即雜合基因型可育株與不育株雜交組合再進(jìn)行姊妹交，選育新的甜椒核雄性不育兩用系（范妍芹等，2004b）。這樣就需要配制大量的測交組合，第2 年再種植鑒定、淘汰，因此在F2和F3階段大大增加了測交組合配制和鑒定數(shù)量，耗費大量人力、物力和財力。且甜椒核雄性不育兩用系的不育株和可育株各占50%，在雜交制種前的初花期，根據(jù)花器官標(biāo)記性狀，需鑒別、拔除50%的可育株。因此，兩用系母本的播種和定植數(shù)量增加1 倍，也增加了拔除可育株的工作量（范妍芹等，2004b）。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇成為育種的重要手段，近年發(fā)展起來的競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）新型基因分型技術(shù)，通過引物末端堿基的特異匹配對SNP 以及InDel 位點進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因分型。因其批量化、自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的特點，特別適用于大量群體的高通量檢測，成為國際上主流的分子標(biāo)記檢測方法之一（Semagn et al.，2014）。目前KASP 標(biāo)記已在小麥（Wu et al.，2018；單子龍等，2020）、水稻（Steele et al.，2018；韋宇等，2019）、大豆（Shi et al.，2015）、大白菜（楊雙娟等，2018）、黃瓜（Wen et al.，2015）等作物中應(yīng)用，在構(gòu)建遺傳圖譜、基因定位、種質(zhì)資源分析等方面發(fā)揮了重要作用。但在甜椒核雄性不育方面應(yīng)用報道極少。

前人通過全基因組重測序技術(shù)，對辣椒核雄性不育基因ms1（Jeong et al.，2018）、msc-1（Cheng et al.，2019）、msc-2（Cheng et al.，2020；Meng et al.，2021）進(jìn)行了精細(xì)定位，初步確定了導(dǎo)致核不育的候選基因。本試驗根據(jù)本所甜椒課題組已獲得并公布的甜椒AB91 核雄性不育其中一個候選基因Capana05g000747（Meng et al.，2021）的突變位點設(shè)計KASP 分子標(biāo)記，運用于甜椒核雄性不育兩用系雜交育種早期對育性的分子標(biāo)記輔助選擇，以期減少大量的繁瑣工作，節(jié)省人力、物力、財力，提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜椒核雄性不育兩用系A(chǔ)B91，自交系HTJ412、HLD163 均由本所甜椒課題組提供。兩用系A(chǔ)B91 的雄性不育性由1 對隱性核基因msms（不育基因為msc-2）控制且穩(wěn)定遺傳，其群體可育株與不育株各占50%，不育株率穩(wěn)定在50%左右。HTJ412 果實燈籠形，成熟果黃色，味甜質(zhì)脆；HLD163 果實燈籠形，成熟果紅色，味甜質(zhì)脆。

1.2 試驗方法

1.2.1 核雄性不育兩用系轉(zhuǎn)育群體構(gòu)建 試驗在本所試驗基地進(jìn)行，2018 年以甜椒核雄性不育兩用系A(chǔ)B91 群體內(nèi)的不育株為不育源，其雄性不育性由1 對隱性核基因msms 控制，作母本；以具有顯性可育基因MSMS 的自交系HTJ412、HLD163 為轉(zhuǎn)育對象，作父本，雜交后獲得AB91×HTJ412和AB91×HLD163 2 個雜交組合；2019 年1 月在日光溫室內(nèi)穴盤育苗，3 月在塑料大棚內(nèi)分別種植2 個雜交組合，F(xiàn)1表現(xiàn)全可育，可育株基因型為MSms，分別自交留種，得到F2群體；2019 年7 月將2 個F2群體分別播種在育苗穴盤中，幼苗長至4～5 葉期，分別編號取嫩葉，采用成都福際生物技術(shù)有限公司的DNA 提取試劑盒提取DNA，使用Nanodrop 測定樣品DNA 濃度，確保DNA 質(zhì)量濃度在20 ng·μL-1以上，放入-40 ℃冰箱保存。

1.2.2 核雄性不育兩用系轉(zhuǎn)育F2育性基因分型方法 引物設(shè)計。根據(jù)本所甜椒課題組已獲得并公布的AB91 核雄性不育候選基因Capana05g000747（參考基因組見http：//peppersequence.genomics.cn/page/species/download.jsp）的突變位點設(shè)計KASP 引物，該基因序列全長1 350 bp，突變位點位于937 bp 處。正向引物1：5′-GAAGGTCGGAGTCAAC GGATTTTTTTTCTGCTCATGTCTGTCAGT-3′，正向引物2：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT TTTTCTGCTCATGTCTGTCAGG-3′，反向引物：5′-GCCTTACTTCACTAACAGAGCGG-3′，均由華大基因科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系（10 μL）：2×TaqParms PCR Mix 5 μL，DNA 提取液1 μL，正向引物1（10 μmol·L-1）0.15 μL，正向引物2（10 μmol·L-1）0.15 μL，反向引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，加ddH2O補(bǔ)至10 μL。陰性對照以等量ddH2O 代替DNA 提取液。設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。

PCR 反應(yīng)程序：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，65℃ 1 min，10 個循環(huán)，每循環(huán)下降0.8 ℃；94 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，28 個循環(huán)；57 ℃ 1 min。

KASP 反應(yīng)使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 進(jìn)行，并采用終點法進(jìn)行熒光信號掃描，以ROX 熒光作為內(nèi)參熒光，使用7500 Software v2.0.6 軟件計算各樣品的ΔRn 值用于數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 隱性核不育基因雄性不育性的轉(zhuǎn)育方法 利用根據(jù)AB91 不育候選基因Capana05g000747設(shè)計的KASP 分子標(biāo)記，對AB91×HTJ412 和AB91 ×HLD163 的F2群體植株進(jìn)行基因型檢測，在苗期淘汰純合基因型可育株（MSMS），保留不育株（msms）和雜合基因型可育株（MSms），并將其分別定植在網(wǎng)紗棚內(nèi)，開花期對植株的育性進(jìn)行田間性狀鑒定，淘汰與KASP 基因型檢測結(jié)果不一致的植株，分別選擇與KASP 基因型檢測結(jié)果一致的不育株與可育株成對測交，從不育株上收獲測交組合種子，分別編號留種。2020 年春季在網(wǎng)紗棚內(nèi)分別種植不同測交組合（F3），開花期進(jìn)行育性鑒定調(diào)查，若全部測交組合的可育株與不育株分離比例符合1∶1，則在F3及后代中只要選擇群體內(nèi)的不育株與可育株姊妹交，就能保持后代育性分離比例符合1∶1，選育出新的雄性不育兩用系。

1.2.4 F2KASP 基因分型結(jié)果準(zhǔn)確性的鑒定方法 根據(jù)KASP 分子標(biāo)記對轉(zhuǎn)育的AB91×HTJ412和AB91×HLD163 2 個雄性不育系F2植株基因分型結(jié)果，將保留的進(jìn)行不育系轉(zhuǎn)育的不育株（msms）和雜合基因型可育株（MSms）種植在網(wǎng)紗棚內(nèi)供開花期進(jìn)行田間育性鑒定，并將雜合基因型可育株分別自交單株留種，供F3進(jìn)行育性鑒定。將根據(jù)KASP 基因分型檢測結(jié)果淘汰的純合基因型可育株（MSMS）種植在另一網(wǎng)紗棚內(nèi)，開花期進(jìn)行田間育性鑒定，并分別單株自交留種，供F3進(jìn)行育性鑒定。將所有可育株自交種分別單株種植，根據(jù)其F3株系群體內(nèi)育性分離結(jié)果，推斷出F2可育株的基因型。F3株系群體內(nèi)育性發(fā)生分離的可育株其F2為雜合型可育株（MSms），F(xiàn)3株系群體內(nèi)表現(xiàn)全可育的可育株其F2為純合基因型可育株（MSMS）。通過田間育性鑒定調(diào)查結(jié)果與KASP基因分型結(jié)果對比，計算KASP 基因分型準(zhǔn)確率。

1.2.5 核雄性不育兩用系育性基因分型檢測方法 2021 年秋季將育成的甜椒核雄性不育兩用系分別播種在育苗穴盤中，幼苗4～5 葉期分別單株編號取嫩葉，采用成都福際生物技術(shù)有限公司的DNA 提取試劑盒提取DNA，使用Nanodrop 測定樣品DNA 濃度，確保DNA 質(zhì)量濃度在20 ng·μL-1以上，放入-40 ℃冰箱保存。

按照1.2.2 的方法進(jìn)行基因分型檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 核雄性不育兩用系轉(zhuǎn)育F2 育性基因分型結(jié)果

利用根據(jù)AB91 不育候選基因Capana05g000747設(shè)計的KASP 分子標(biāo)記，對AB91×HTJ412 和AB91×HLD163 的F2群體植株進(jìn)行基因型檢測。結(jié)果顯示：該分子標(biāo)記與甜椒核雄性不育的育性呈現(xiàn)共分離，群體植株的育性基因型可以清楚地分為3 類（圖1）。靠近縱坐標(biāo)位置的信號點藍(lán)色三角表示僅檢測到FAM 熒光信號，為不育株（msms）；靠近橫坐標(biāo)位置的信號點紅色三角表示僅檢測到HEX 信號，為純合基因型可育植株（MSMS）；中間位置信號點綠色正方形表示同時檢測到FAM 和HEX 信號，為雜合基因型可育植株（MSms），可以有效地區(qū)分甜椒核雄性不育兩用系轉(zhuǎn)育F2植株的育性基因型。AB91×HTJ412 F2群體內(nèi)的92 株單株中，有雜合基因型可育株43 株，純合基因型可育株25 株，不育株24 株（圖1-A）；AB91 ×HLD163 F2群體內(nèi)的104 株單株中，有雜合基因型可育株47 株，純合基因型可育株27 株，不育株30 株（圖1-B）。

圖1 核雄性不育兩用系轉(zhuǎn)育F2 KASP 基因分型結(jié)果

2.2 AB91 隱性核不育基因雄性不育性的轉(zhuǎn)育

根據(jù)KASP 分子標(biāo)記對轉(zhuǎn)育的2 個雄性不育系F2植株基因型檢測結(jié)果，在苗期淘汰純合基因型可育株（MSMS），保留不育株（msms）和雜合基因型可育株（MSms）。開花期對保留的不育株和可育株的育性進(jìn)行田間性狀鑒定，只有1 株雜合基因型可育株表現(xiàn)不育，與KASP 基因型檢測結(jié)果不一致，淘汰。分別選擇符合育種目標(biāo)性狀的不育株與可育株成對測交，從不育株上收獲測交組合種子，2020 年春季種植后發(fā)現(xiàn)全部測交組合的育性均表現(xiàn)分離，可育株與不育株分離比例符合1∶1，沒有出現(xiàn)全可育的測交組合，表明選留的可育株均為雜合基因型（MSms），KASP 分子標(biāo)記檢測結(jié)果準(zhǔn)確。F3不需要淘汰全可育測交組合，在F3及后代中只要選擇群體內(nèi)的不育株與可育株姊妹交，就能保持后代育性1∶1 的分離比例，不需要對雄性不育性進(jìn)行選育，主要根據(jù)農(nóng)藝性狀優(yōu)劣選擇淘汰測交組合。轉(zhuǎn)育的AB91× HTJ412 和AB91×HLD163 2 個雄性不育系，主要育種目標(biāo)是選育黃色和紅色彩色甜椒雄性不育系。因此，本試驗重點對果實的顏色等主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行篩選，選擇符合育種目標(biāo)性狀的不育株與可育株成對姊妹交3 代（2020 年春、秋季，2021 年春季），選育出了雄性不育性穩(wěn)定，不育株率穩(wěn)定在50%左右，符合育種目標(biāo)性狀的黃色甜椒核雄性不育兩用系A(chǔ)B91-HTJ412（果實燈籠形，成熟果黃色，味甜質(zhì)脆）和紅色甜椒核雄性不育兩用系A(chǔ)B91-HLD163（果實燈籠形，成熟果紅色，味甜質(zhì)脆），可作為選育彩色椒的雄性不育系。

2.3 F2 KASP 基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性鑒定

F2KASP 基因分型結(jié)果及田間育性調(diào)查結(jié)果見表1。AB91×HTJ412 雄性不育系轉(zhuǎn)育的F2中，KASP 基因分型結(jié)果中不育株24 株、雜合基因型可育株43 株與田間育性調(diào)查結(jié)果一致，只有純合基因型可育株25 株中，有1 株田間育性發(fā)生分離，與KASP 基因分型結(jié)果不一致，KASP 基因分型準(zhǔn)確率為98.91%；AB91×HLD163 雄性不育系轉(zhuǎn)育的F2中，KASP 基因分型結(jié)果中不育株30株、純合基因型可育株27 株與田間育性調(diào)查結(jié)果一致，只有雜合基因型可育株47 株中，有1 株田間育性表現(xiàn)為不育，與KASP 基因分型結(jié)果不一致，KASP 基因分型準(zhǔn)確率為99.04%。這2 個群體KASP 基因分型準(zhǔn)確率平均值為98.98%，表明KASP 基因分型有較高的準(zhǔn)確性、可靠性。

表1 核雄性不育兩用系轉(zhuǎn)育F2 KASP 基因分型與田間育性調(diào)查結(jié)果

2.4 核雄性不育兩用系基因分型結(jié)果

對育成的黃色和紅色甜椒核雄性不育兩用系A(chǔ)B91-HTJ412 和AB91-HLD163 的群體進(jìn)行育性基因型檢測，結(jié)果顯示：該分子標(biāo)記與甜椒核雄性不育的育性呈現(xiàn)共分離，AB91-HTJ412、AB91-HLD163 兩用系的育性基因型可以清楚地分為兩類（圖2）?？拷v坐標(biāo)位置的信號點藍(lán)色三角表示僅檢測到FAM 熒光信號，為不育株（msms），靠近橫坐標(biāo)位置的信號點綠色正方形表示同時檢測到FAM 和HEX 信號，為雜合基因型可育植株（MSms），可以有效地區(qū)分甜椒核雄性不育兩用系植株的育性基因型。AB91-HTJ412 兩用系群體的83 株單株中，有41 株不育株，42 株雜合基因型可育株（圖2-A）；AB91-HLD163 兩用系群體的78株單株中，有40 株不育株，38 株雜合基因型可育株（圖2-B）。

圖2 核雄性不育兩用系KASP 基因分型結(jié)果

根據(jù)KASP 分子標(biāo)記基因分型結(jié)果，在苗期淘汰可育株（MSms），將AB91-HTJ412 保留的41 株不育株和AB91-HLD163 保留的40 株不育株分別定植在網(wǎng)紗棚內(nèi)，開花期對植株的育性進(jìn)行田間鑒定，均表現(xiàn)不育，與KASP 基因分型結(jié)果一致，定植的不育株可直接用于雜交組合選配及雜交制種。

3 討論與結(jié)論

辣椒雄性不育相關(guān)基因基礎(chǔ)研究相對于水稻、番茄等作物相對滯后，辣椒基因組信息公布較晚且遺傳群體多態(tài)性低也限制了標(biāo)記的開發(fā)進(jìn)程，導(dǎo)致實用標(biāo)記不足，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)在辣椒雄性不育領(lǐng)域的應(yīng)用也相對較少（程翔 等，2020）。在辣椒核雄性不育分子標(biāo)記研究方面，國內(nèi)外都有一些報道，主要開發(fā)出了與辣椒核不育相關(guān)的AFLP標(biāo) 記（Lee et al.，2012）、SCAR 標(biāo) 記（Menisha et al.，2021）、CAPS 標(biāo) 記（Jo et al.，2016）、SSR標(biāo) 記（Aulakh et al.，2016）、InDel 標(biāo) 記（Cheng et al.，2019），在當(dāng)前開發(fā)的標(biāo)記中SSR 和InDel標(biāo)記較多（程翔 等，2020），這些標(biāo)記的開發(fā)為分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。但在甜椒核雄性不育分子標(biāo)記研究方面報道較少，Bartoszewski 等（2012）通過RAPD-BSA 技術(shù)，鑒定了7 個與ms8位點相關(guān)的標(biāo)記，將ms8定位在4 號染色體上，并開發(fā)了與ms8基因連鎖的2 個標(biāo)記SCAR-P2 和RAPD Z05-760，遺傳距離分別為34.5 cM 和4.6 cM，鑒定出的標(biāo)記可用于分子輔助育種，但目前仍缺乏與ms8位點緊密相關(guān)的標(biāo)記。嚴(yán)慧玲等（2011）以甜椒核雄性不育兩用系A(chǔ)B91 為材料，篩選了225 對SRAP 引物組合及1 393 對EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ引物組合，確定了標(biāo)記E37M39（200 bp，與育性基因的遺傳距離為6 cM）和E44M93（500 bp，與育性基因的遺傳距離為12 cM）。孟雅寧等（2019）運用BSA 法與全基因組重測序技術(shù)，以甜椒核雄性不育兩用系A(chǔ)B91 為材料，開發(fā)了2個SSR 標(biāo)記H12、H24，與不育基因msms的連鎖距離分別為0.29、0.00 cM。

為了進(jìn)一步提高核雄性不育兩用系育種效率，減少大量的繁瑣工作，降低育種成本，利用本所甜椒課題組已獲得并公布的甜椒AB91 核雄性不育候選基因Capana05g000747（Meng et al.，2021）的突變位點設(shè)計KASP 分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記與甜椒核雄性不育的育性呈現(xiàn)共分離，可準(zhǔn)確鑒別不育株基因型、可育株的純合基因型和雜合基因型，其基因分型準(zhǔn)確率平均為98.98%。該KASP 分子標(biāo)記已成功地應(yīng)用于甜椒核雄性不育系的轉(zhuǎn)育，在苗期對F2植株的育性基因型進(jìn)行早期檢測鑒定，可有效淘汰基因型為MSMS 的可育株，篩選出基因型為MSms 的可育株，直接用于不育系的轉(zhuǎn)育，可減少人力、物力、財力投入。該標(biāo)記也可應(yīng)用于兩用系的雜交組合選配及雜交制種，在苗期對兩用系群體的育性基因型進(jìn)行早期鑒別，可有效淘汰50%可育株（MSms），選留的50%不育株（msms）直接用于雜交組合選配及雜交制種，可減少50%定植數(shù)量，省去花期鑒定、拔除50%可育株的工作。

KASP 分子標(biāo)記具有便于批量化、自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的檢測特點，適用于大量群體的高通量檢測，將其成功運用于甜椒核雄性不育兩用系雜交育種早期對育性進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，可減少大量的繁瑣工作，節(jié)省人力物力財力，降低育種成本，簡化轉(zhuǎn)育程序，提高育種效率，加快育種進(jìn)程。