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        化瘀散結灌腸液對子宮內膜異位癥盆腔痛大鼠的影響實驗研究

        2022-12-28 09:41:20宗春曉劉小麗薛曉鷗朱玉瑩
        世界中醫(yī)藥 2022年23期
        關鍵詞:氧化應激劑量模型

        宗春曉 徐 信 劉小麗 謝 偉 薛曉鷗 朱玉瑩 徐 立

        (北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,北京,100010)

        子宮內膜異位癥(Endometriosis,EMT)是婦科常見病,臨床癥狀以痛經(jīng)、慢性盆腔痛、月經(jīng)失調、不孕等為主,嚴重影響患者的生命質量,但目前EMT發(fā)病機制尚不明確[1]。近年來研究表明,EMT與盆腔局部的炎癥反應及氧化應激密切相關[2-3],核因子κB信號通路在EMT疼痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4-5]。

        中醫(yī)認為EMT的基本病機為瘀血阻滯沖任、胞宮,血瘀是其最基本的病理基礎,治療以活血化瘀為常法[6]。化瘀散結灌腸液由當歸、川芎、赤芍、地黃、桃仁、紅花、川牛膝、三棱、莪術、丹參、鱉甲、龜甲、木通、連翹、金銀花等組成,具有活血化瘀止痛的功效。既往臨床研究表明,化瘀散結灌腸液對緩解EMT患者的痛經(jīng)、慢性盆腔痛癥狀療效確切[7]。本研究旨在觀察化瘀散結灌腸液對EMT盆腔痛模型大鼠氧化應激因子、核因子κB通路及炎癥介質的影響,探討化瘀散結灌腸液治療EMT盆腔痛的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動物 選取40只無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雌性SD大鼠,鼠8~10周,體質量180~230 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動物室。溫度24 ℃,濕度60%~70%,12 h明暗交替循環(huán),自由飲食。動物實驗嚴格遵守北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院實驗動物福利與倫理委員會的要求,倫理審批號:20-16。

        1.1.2 藥物 化瘀散結灌腸液(青海瑞成藥業(yè)有限公司,國藥準字Z20025840,藥物組成:當歸、川芎、赤芍、地黃、桃仁、紅花、川牛膝、三棱、莪術、丹參、鱉甲、龜甲、木通、連翹、金銀花),吲哚美辛膠囊(河北永豐藥業(yè)有限公司,國藥準字H13020834)。苯甲酸雌二醇注射液(上海全宇生物科技動物藥業(yè)有限公司,獸藥字163232511),縮宮素注射液(上海全宇生物科技動物藥業(yè)有限,獸藥字163231571)。SD大鼠給藥量按照等效劑量系數(shù)折算法換算。

        1.1.3 試劑與儀器 試劑:大鼠白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:H002),腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:H052),超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A001-1-2),丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A003-1-2),兔抗核因子κB p65抗體(北京博奧森生物技術有限公司,貨號:bs-0982R),蛋白提取液(北京百奧思科生物醫(yī)學技術有限公司,貨號:MDL91201),蛋白酶抑制劑(北京百奧思科生物醫(yī)學技術有限公司,貨號:MD912893)。

        儀器:低溫離心機(Sigma,德國,型號:3-30K),脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司,型號:TS-100),電泳儀(北京百晶生物技術有限公司,型號:BG-subMIDI),電熱恒溫水浴槽(上海一恒恒溫設備廠,型號:HWS-24),聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF),膜(Millipore,美國,型號:ISEQ00010),ChemiDoc MP化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-rad,美國,型號:170-8280)。

        1.2 方法

        1.2.1 分組與模型制備 將40只雌性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后,按隨機數(shù)字表法選取6只為假手術組,剩余大鼠采用自體子宮內膜移植法加雌激素聯(lián)合縮宮素注射建立EMT盆腔痛大鼠模型[8-10]。造模過程具體如下:將大鼠稱重后以2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射進行麻醉,固定于手術板,腹部備皮,常規(guī)消毒。選取尿道口上1 cm處為切入點,向上沿前正中線縱切開1.5~2.0 cm切口,逐層打開腹壁,進腹后找到大鼠“Y”形子宮,分離右側子宮,結扎兩端,剪下中間段約1 cm子宮組織,迅速放入裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中沖洗。用眼科剪縱行剖開管狀子宮,切割成約5 mm×5 mm大小的碎片,將子宮組織內膜面朝向腹膜縫合于左側腹膜血管豐富處,使其完全貼附于腹壁。檢查無活動性出血后,腹腔內注射青霉素(0.1 mL/只)以抗感染,逐層關腹,消毒切口。術后前3 d連續(xù)腹腔注射青霉素(0.1 mL/只)以抗感染。假手術組術前準備、麻醉同造模組,只需要找到右側子宮,緊貼左側腹膜縫2針5-0尼龍線,縫合腹部傷口即可。造模4周后開腹查看造模情況,如肉眼看到移植物體積增大,移植物表面有血管形成,移植物呈小囊狀、內含清亮液體,即判斷EMT大鼠模型造模成功。術后第2天開始肌內注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg,2次/周,假手術組雌性SD大鼠肌內注射等量生理鹽水。造模4周后,腹腔注射縮宮素4 U/只,出現(xiàn)扭體反應即判斷EMT盆腔痛大鼠模型造模成功。

        選取30只造模成功的大鼠隨機分為5組:模型組、陽性對照組、化瘀散結灌腸液低劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液高劑量灌腸組,每組6只。

        1.2.2 給藥方法 造模4周后,化瘀散結灌腸液劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液高劑量灌腸組分別給予每只大鼠相當于成藥2.5 mL/kg、5 mL/kg和10 mL/kg的化瘀散結灌腸液配成的2.5 mL藥液灌腸;陽性對照組大鼠給予2.5 mg/kg吲哚美辛配成的混懸液2.5 mL灌腸;假手術組和模型組給予同體積的生理鹽水灌腸。每日1次,連續(xù)灌腸4周。

        1.2.3 檢測指標與方法

        1.2.3.1 扭體反應觀察 除假手術組外,其他組大鼠術后第2天開始肌內注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg,2次/周,連續(xù)8周,假手術組大鼠肌內注射等量生理鹽水。末次給藥后,除假手術組外,其他各組大鼠均腹腔注射縮宮素4 U/只,假手術組大鼠腹腔注射等量生理鹽水,記錄大鼠30 min內扭體次數(shù),根據(jù)公式計算扭體次數(shù)抑制率,抑制率(%)=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/模型組扭體次數(shù)×100%。扭體反應表現(xiàn)為大鼠腹部內凹,身體扭曲,后肢伸張,臀部高起。

        研究人員稱,父母對于子女日后的語言表達能力也起著十分重要的作用。所以嬰兒期堅持給寶寶“磨耳朵”,日后會有意想不到的收獲哦!

        1.2.3.2 取材及組織形態(tài)學觀察 造模后8周即最后1次灌腸結束后次日,麻醉大鼠進行剖腹以獲取大鼠血清、正常子宮內膜及異位內膜組織。腹主動脈取血5 mL,室溫靜置20 min,置于離心機2 500 r/min,離心半徑7 cm,離心15 min,收集血清。取異位內膜組織及假手術組正常子宮內膜組織,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,行5 μm連續(xù)切片,蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察內膜組織學形態(tài)。

        1.2.3.3 血清IL-1β、TNF-α、SOD、MDA水平測定 取大鼠血清,按照酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒說明書檢測血清IL-1β、TNF-α表達水平。按照試劑盒說明書操作要求,用羥胺法檢測血清SOD水平,通過硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid,TBA)法檢測血清MDA水平。

        1.2.3.4 蛋白質印跡法檢測核因子κB p65蛋白表達 將異位內膜組織或假手術組在位內膜組織在冰上剪碎,加入細胞裂解液,冰浴上勻漿。在4 ℃條件下,12 000 r/min,離心半徑7 cm,離心15 min后取上清,加入緩沖液,經(jīng)二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量,將蛋白定量為5 mg/mL,進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結束后,將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉印至PVDF膜。將PVDF膜浸入封閉液輕搖1 h封閉后,加入核因子κB p65和β-機動蛋白一抗(稀釋比例為1∶1 000)4 ℃孵育過夜,洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)洗滌后,加入辣根過氧化物酶標記的二抗37 ℃孵育1 h,TBST洗膜后,將增強型化學發(fā)光試劑均勻鋪在PVDF膜表面,室溫作用4 min。抖掉膜上液體,將其放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像,分析條帶光密度(Optical Density,OD)值,目標蛋白的相對表達量=目標蛋白灰度值/內參β-機動蛋白灰度值。

        2 結果

        2.1 各組大鼠扭體反應比較 與模型組比較,陽性對照組大鼠扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01),其抑制率為81.63%,化瘀散結灌腸液劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液高劑量灌腸組均能顯著減少大鼠扭體次數(shù)(P<0.05),其抑制率分別為26.52%、47.95%、53.58%。見表1。

        表1 各組大鼠扭體反應比較

        2.2 各組大鼠內膜組織形態(tài)學比較 假手術組大鼠子宮內膜上皮完整,柱狀上皮細胞連續(xù)整齊排列,間質細胞排列致密整齊,微絨毛密集;模型組異位子宮內膜可見柱狀、扁平狀、立方體狀上皮細胞增殖,間質細胞增殖密集,可見腺體;陽性對照組及化瘀散結灌腸液灌腸組異位子宮內膜可見柱狀上皮細胞排列致密不規(guī)則,間質細胞疏密不等,腺體較少。見圖1。

        圖1 各組大鼠內膜組織形態(tài)學比較(HE染色,×400)

        2.3 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較 與假手術組比較,模型組大鼠血清IL-1β及TNF-α水平均升高(P<0.01),與模型組比較,陽性對照組及化瘀散結灌腸液劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液高劑量灌腸組IL-1β、TNF-α水平均降低(P<0.05)。見表2。

        表2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較

        2.4 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較 與假手術組比較,模型組大鼠血清SOD活力降低、MDA水平升高(P<0.01),與模型組比較,陽性對照組及化瘀散結灌腸液劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液高劑量灌腸組SOD活力升高、MDA水平降低(P<0.01)。見表3。

        表3 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較

        2.5 各組大鼠內膜核因子κB p65蛋白表達比較 與假手術組大鼠在位內膜表達比較,模型組大鼠異位內膜核因子κB p65蛋白表達升高(P<0.05),與模型組比較,陽性對照組及化瘀散結灌腸液劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液中劑量灌腸組、化瘀散結灌腸液高劑量灌腸組核因子κB p65蛋白表達降低(P<0.05)。見圖2,表4。

        圖2 各組大鼠子宮內膜組織中核因子κB p65蛋白含量表達電泳圖

        表4 各組大鼠核因子κB p65蛋白表達比較

        3 討論

        中醫(yī)學古文獻中無確切EMT的病名記載,但根據(jù)EMT的主要臨床癥狀與體征,可歸屬于“痛經(jīng)”“月經(jīng)不調”“癥瘕積聚”“不孕”的范疇。本病的基本病機為“瘀血阻滯胞宮、沖任”,治法以活血化瘀為主。化瘀散結灌腸液以養(yǎng)血活血之桃紅四物湯為基礎方,配伍三棱、莪術以破血消癥,鱉甲、龜甲軟堅散結,丹參化瘀涼血,連翹、金銀花清熱散結,川牛膝、木通通利血脈、引血下行。諸藥合用,共奏活血化瘀,軟堅散結,清熱解毒之效。且灌腸液對于盆腔痛的治療具有直達病所,易于吸收,避免肝臟首過效應,減輕胃腸刺激的優(yōu)勢。既往臨床研究表明,化瘀散結灌腸液臨床治療EMT取得良好療效,能明顯改善EMT患者疼痛癥狀,提高患者生命質量?,F(xiàn)代藥理研究表明,桃紅四物湯、丹參、三棱、莪術等具有抗炎、鎮(zhèn)痛、改善血流動力學及提高免疫力等功效。

        目前關于EMT疼痛發(fā)生的機制尚未完全清楚,近期研究發(fā)現(xiàn),參與EMT盆腔痛發(fā)生的可能因素有炎癥反應、雌激素異常、神經(jīng)纖維異常、盆腔粘連、神經(jīng)的中樞敏感化及神經(jīng)外周敏感化等[11]。

        氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時,體內高活性分子產(chǎn)生過多,氧化程度超過氧化物的清除,抗氧化劑減少,氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失去平衡,從而引起細胞氧化損傷。SOD是一種重要的抗氧化物酶,它可以將有害的超氧自由基轉化為過氧化氫,過氧化氫進一步在過氧化氫酶和過氧化物酶催化下分解為水。氧化活性物質增加可對不飽和脂肪酸等脂質造成損傷。MDA是脂質過氧化的產(chǎn)物,可作為氧化應激的重要標志物。研究表明,氧化應激與EMT的發(fā)生發(fā)展密切相關。EMT異位病灶在誘導炎癥反應清除異物的過程中會釋放活性氧產(chǎn)物致使病變部位及其周圍組織產(chǎn)生氧化應激,而氧化應激又能反過來誘導細胞因子產(chǎn)生,促進EMT的發(fā)展。抗氧化劑可以減弱炎癥反應、緩解慢性盆腔痛[12-15]。

        核因子κB是介導免疫與炎癥反應的重要轉錄因子,參與多種復雜的細胞反應。研究表明,核因子κB能夠通過介導炎癥反應、抑制細胞凋亡、促進神經(jīng)血管生成等機制影響外周敏化進而建立中樞敏化,抑制核因子κB可明顯抑制EMT的發(fā)生和發(fā)展,并且減少EMT的相關疼痛癥狀[16-17]。氧化應激是核因子κB及其下游基因的強誘導因子,活性氧類可激活子宮內膜基質細胞的核因子κB通路,從而刺激IL-1β、TNF-α等炎癥介質的產(chǎn)生,這些介質一方面可以刺激前列腺素分泌,引起子宮平滑肌收縮從而導致疼痛,另一方面又可以正反饋核因子κB激活通路,維持病灶中核因子κB的活性、巨噬細胞募集和腹腔內的炎癥反應,從而活化周圍神經(jīng)纖維,刺激周圍神經(jīng)敏感化,改變神經(jīng)組織的電信號,引發(fā)疼痛感覺[18-20]。此外,Khan等[21]提出氧化應激與炎癥反應可以相互促進,通過相加作用進一步促進EMT的發(fā)生發(fā)展。

        本研究結果表明模型組血清MDA、IL-1β、TNF-α處于高水平,SOD表達降低,異位內膜組織核因子κB表達增加,提示EMT盆腔痛模型大鼠存在氧化應激反應和炎癥反應,核因子κB參與了EMT盆腔痛的發(fā)生發(fā)展。通過化瘀散結灌腸液灌腸干預后,化瘀散結灌腸液干預組及西藥干預組可降低血清MDA、IL-1β、TNF-α水平,升高SOD水平,抑制異位內膜組織核因子κB表達。

        綜上所述,化瘀散結灌腸液能有效緩解大鼠EMT盆腔痛,其機制可能與抑制氧化應激反應,進而調控核因子κB通路,減少炎癥介質產(chǎn)生有關。但本研究僅涉及化瘀散結灌腸液對氧化應激因子、核因子κB通路及相關炎癥介質表達的影響,仍有待對該通路機制進一步研究。

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